TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM KHOA: LÝ – HÓA – SINH ---------- LÊ THỊ THU HÀ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC APERGILLUSS NIGER CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE CAO ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Quảng Nam, tháng 4 năm 2015 LỜI CẢM ƠN Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ của ngƣời khác. Để hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: - Giáo viên hƣớng dẫn tôi, Th.S Phan Thị Thanh Diễm, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và truyền niềm đam mê nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. - Ban giám hiệu, các thầy cô trƣờng Đại học Quảng Nam, đặc biệt là các thầy cô trong Khoa Lý – Hóa – Sinh đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm của mình cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập và quá trình làm khóa luận. - Xin cảm ơn những lời động viên, khích lệ của bạn bè, đặc biệt là các bạn trong lớp DT122SSH01 đã góp ý, chia sẻ giúp tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận.
Do trình độ còn hạn chế về kiến thức cũng nhƣ kinh nghiệm nên trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp khó tránh những thiếu sót, tôi rất mong đƣợc sự góp ý kiến của thầy cô giáo để bài khóa luận của tôi đƣợc hoàn chỉnh hơn. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn và kính chúc quý thầy cô dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau. Quảng Nam, tháng 4 năm 2016 Sinh viên thực hiện Lê Thị Thu Hà LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả khóa luận Lê Thị Thu Hà DANH MỤC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Hàm lƣợng pectin trong các loại trái cây 6 1.2 Phân loại enzyme pectinase 12-13 Tốc độ ép của bã nghiền nho khi sử dụng 18 1.3 pectinase Thành phần môi trƣờng nuôi cấy với cơ chất 2.1 25 cảm ứng khác nhau Thành phần môi trƣờng nuôi cấy với nguồn 2.2 26 nitơ khác nhau Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc 3.1 29-30 phân lập đƣợc.
Sự sinh trƣởng và phát triển của các chủng 3.2 32 nấm mốc Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất đến khả năng 3.3 34 sinh tổng hợp enzyme pectinase DANH MỤC VIẾT TẮT A : Aspergillus MT : môi trƣờng PE : Pectinesterase PG : Polygalacturonase VSV : Vi sinh vật Exo-PG : exo-poly 1,4-D-galacturonide PDA : Potato dextrose agar PEL : Pectate lyase PNL : Pectin lyase PMG : Polymethylgalacturonase DANH MỤC HÌNH Số hiệu Số Tên hình hình trang 1.1 Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của 5 pectin 1.2 Cấu trúc của pectinesterase từ carrot 8 1.3 Cấu tạo của Aspergillus 21 3.1 Các đặc điểm hình thái của chủng Aspergillus niger 31 3.2 Tốc độ sinh trƣởng của các chủng nấm mốc A.3 Tốc độ sinh trƣởng của chủng H5(A.4 Vòng phân giải pectin của chủng H1 34 3.5 Sự phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng có cơ chất là 35 pectin 3.6 Ảnh hƣởng của chất cảm ứng đến hoạt độ của enzyme 35 pectinase.7 Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến hoạt độ của enzyme 36 pectinase 3.8 Sự phát triển của chủng H1 trong môi trƣờng có nguồn cung cấp nitơ là (NH4)2SO4 (A) và vòng phân giải pectin 37 của enzyme thu đƣợc (B) 3.9 Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của enzyme pectinase 37 3.10 Sự phát triển của chủng H1 trong môi trƣờng có pH là 5,5 38 (A) và vòng phân giải pectin của enzyme thu đƣợc (B) 3.11 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme pectinase 38 3.12 Vòng phân giải pectin của chủng H1ở 25 oC (A) và 35 oC 39 (B).13 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ của enzyme 40 pectinase MỤC LỤC Phần 1. Lí do chọn đề tài. Mục tiêu của đề tài. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu.
Phƣơng pháp nghiên cứu. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về enzyme pectinase.
Lịch sử nghiên cứu. Các nghiên cứu trên thế giới. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc. Cơ chất của enzyme pectinase.
Khái niệm enzyme pectinase. Cấu tạo enzyme pectinase. Đặc điểm của enzyme pectinase. Enzyme pectinase từ nguồn thực vật:.
Enzyme pectinase từ vi sinh vật. Phân loại enzyme pectinase. Cơ chế tác động của enzyme pectinase. Các enzyme khử mạch polymer.
Các ứng dụng cơ bản của enzyme pectinase. Ứng dụng trong công nghiệp rƣợu vang. Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast. Tổng quan về nấm Aspergillus niger.
Giới thiệu chung. Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger. Cấu tạo cơ quan sinh sản. 21 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
Vật liệu và thiết bị nghiên cứu. Địa điểm, thời gian. Vật liệu nghiên cứu. Thiết bị, hoá chất.
Phƣơng pháp nghiên cứu. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu. Phƣơng pháp phân lập. Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc.
Phƣơng pháp giữ giống. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của các chủng nấm mốc thu đƣợc. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của nguồn cơ chất đến sinh tổng hợp enzyme pectinase. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp enzyme pectinase.
Phƣơng pháp xác định độ pH ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase. Phƣơng pháp xác định độ ẩm. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase.
27 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Phân lập nấm từ vỏ quả bƣởi, cam và đất. Đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển của chủng nấm mốc Aspergillus niger phân lập đƣợc. Khả năng sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm phân lập đƣợc.
Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzyme pectinase. Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của chủng H1. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của chủng H1. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của chủng H1.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của chủng H1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của chủng H1. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. TÀI LIỆU THAM KHẢO.
42 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Số hiệu bảng Tên bảng Trang 1.1 Hàm lƣợng pectin trong các loại trái cây 6 1.2 Phân loại enzyme pectinase 12-13 Tốc độ ép của bã nghiền nho khi sử dụng 18 1.3 pectinase Thành phần môi trƣờng nuôi cấy với cơ chất 2.1 25 cảm ứng khác nhau Thành phần môi trƣờng nuôi cấy với nguồn 2.2 26 nitơ khác nhau Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc 3.1 29-30 phân lập đƣợc. Sự sinh trƣởng và phát triển của các chủng 3.2 32 nấm mốc Ảnh hƣởng của nguồn cơ chất đến khả năng 3.3 34 sinh tổng hợp enzyme pectinase DANH MỤC VIẾT TẮT A : Aspergillus MT : môi trƣờng PE : Pectinesterase PG : Polygalacturonase VSV : Vi sinh vật Exo-PG : exo-poly 1,4-D-galacturonide PDA : Potato dextrose agar PEL : Pectate lyase PNL : Pectin lyase PMG : Polymethylgalacturonase DANH MỤC HÌNH Số hiệu Số Tên hình hình trang 1.1 Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của 5 pectin 1.2 Cấu trúc của pectinesterase từ carrot 8 1.3 Cấu tạo của Aspergillus 21 3.1 Các đặc điểm hình thái của chủng Aspergillus niger 31 3.2 Tốc độ sinh trƣởng của các chủng nấm mốc A.3 Tốc độ sinh trƣởng của chủng H5(A.4 Vòng phân giải pectin của chủng H1 34 3.5 Sự phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng có cơ chất là 35 pectin 3.6 Ảnh hƣởng của chất cảm ứng đến hoạt độ của enzyme 35 pectinase.7 Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến hoạt độ của enzyme 36 pectinase 3.8 Sự phát triển của chủng H1 trong môi trƣờng có nguồn cung cấp nitơ là (NH4)2SO4 (A) và vòng phân giải pectin 37 của enzyme thu đƣợc (B) 3.9 Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ của enzyme pectinase 37 3.10 Sự phát triển của chủng H1 trong môi trƣờng có pH là 5,5 38 (A) và vòng phân giải pectin của enzyme thu đƣợc (B) 3.11 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme pectinase 38 3.12 Vòng phân giải pectin của chủng H1ở 25 oC (A) và 35 oC 39 (B).13 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ của enzyme 40 pectinase Phần 1. Lí do chọn đề tài Enzyme là một trong những chế phẩm sinh học đƣợc quan tâm nhất hiện nay, bởi vai trò của nó hết sức quan trọng. Hiện nay enzyme đã đƣợc thu nhận và ứng dụng trong hầu hết các lĩnh vực mang lại hiệu quả thiết thực.
Đặc biệt trong chế biến thực phẩm, chế phẩm enzyme đã đƣợc áp dụng để tạo ra sản phẩm có năng suất và chất lƣợng, rút ngắn thời gian sản xuất hạ đƣợc giá thành sản phẩm. Đối với nƣớc ta ngành công nghệ thực phẩm rất phát triển, do vậy nhu cầu về enzyme phục vụ trong sản xuất rất lớn. Tuy nhiên, ở Việt Nam xƣởng sản xuất chế phẩm enzyme rất ít, hàng năm nƣớc ta vẫn phải nhập ngoại một khối lƣợng lớn những loại enzyme này (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b) [12]. Pectinase là nhóm enzyme xúc tác cho sự thủy phân các polymer pectin đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm cũng nhƣ xử lý chất thải và nhiều lĩnh vực khác.
Ở Việt Nam, chế phẩm pectinase đã đƣợc sử dụng khá phổ biến và đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu (Lê Văn Nhƣơng et al., 1978; Phí Quyết Tiến, 1999; Huỳnh Ngọc Oanh và Trần Ngọc Hùng, 2008) [12]. Tuy nhiên việc nghiên cứu thu nhận enzyme pectinase còn rất hạn chế. Trong khi đó enzyme pectinase đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lƣợng dịch quả và có tác dụng làm trong nƣớc trái cây cũng nhƣ làm trong rƣợu vang. Vì vậy việc nghiên cứu đặc điểm và thu nhận nguồn enzyme ở Việt Nam là vấn đề cần thiết, mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.