MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Astaxanthin (C40H52O4) là một loại carotenoid màu đỏ, trong tự nhiên đƣợc tìm thấy ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh astaxanthin có tác dụng vƣợt trội trong lĩnh vực chăm sóc, bảo vệ sức khỏe nhƣ chống oxy hóa, bảo vệ DNA, tăng cƣờng miễn dịch, hỗ trợ điều trị tiểu đƣờng, tim mạch, thần kinh. Hiện nay, sản phẩm bổ sung astaxanthin đã lƣu hành phổ biến trên thị trƣờng gồm viên nang, bột, kem bảo vệ da, gel.
Ngoài ra, ngành chăn nuôi, thủy sản cũng tiêu thụ khối lƣợng lớn astaxanthin để tạo màu đỏ tự nhiên cho sản phẩm thịt, cá, tôm bằng cách bổ sung vào nguồn thức ăn. Do đƣợc sử dụng phổ biến, hiệu quả trên nhiều lĩnh vực nên nhu cầu astaxanthin trên thị trƣờng rất lớn và ngày càng tăng. Điều này làm cho giá astaxanthin rất cao, với astaxanthin tự nhiên là 2500-7000 USD/kg, astaxanthin tổng hợp khoảng 1000 USD/kg, tổng nhu cầu trên thế giới đạt khoảng 280 tấn, trị giá 447 triệu USD năm 2014, ƣớc tính đến năm 2020 đạt mức 1,1 tỉ USD [3][4][5]. Hai nguồn cung chính của astaxanthin gồm sản phẩm tổng hợp hoặc ly trích từ sinh vật, với nguồn tổng hợp chỉ giới hạn sử dụng để tạo màu tự nhiên cho thực phẩm, còn astaxanthin tự nhiên đƣợc dùng trong chăm sóc, bảo vệ sức khỏe.
Loại có nguồn gốc tự nhiên chủ yếu đến từ ly trích tảo Haematococcus pluvialis, nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous, hoặc vỏ tôm, cua. Trên thực vật, astaxanthin chỉ có ở một số cây có hoa thuộc chi Adonis nhƣ Adonis aestivalis [6]. Cánh hoa màu đỏ của các loài thuộc chi Adonis có sản lƣợng thấp nên khó khai thác để cung cấp astaxanthin. Nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin vào các cây thực phẩm mà các sản phẩm của nó đã đƣợc sử dụng phổ biến trong thực tế là một hƣớng nghiên cứu nhiều tiềm năng.
Điều này hứa hẹn cung cấp các sản phẩm có giá trị kinh tế và sử dụng cao. Nhiều nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin, có nguồn gốc từ vi khuẩn, tảo., vào các loại cây trồng khác nhau nhƣ ngô, gạo, táo đã đƣợc thực hiện [7][8]. Đậu tƣơng vốn là cây trồng quan trọng với nhiều ƣu điểm nổi bật ở giá trị dinh dƣỡng của hạt đậu, khả năng thích nghi ở nhiều vùng trồng, giúp cải tạo đất, đồng thời các sản phẩm từ đậu tƣơng rất đa dạng và phổ biến trong đời sống hàng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 ngày nhƣ đậu hũ, chao, sữa, bột, dầu ăn. nên tiềm năng ứng dụng với giống đậu tƣơng mới rất lớn.
Tuy nhiên, nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin trên đậu tƣơng còn hạn chế. Ở Việt Nam, chƣa ghi nhận đƣợc nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng. Do đó, nghiên cứu này đã đƣợc thực hiện nhằm chuyển các gen từ cây hoa Adonis aestivalis vào đậu tƣơng giúp cây có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt, từ đó tạo các sản phẩm có thể đƣợc ứng dụng. Mục tiêu của đề tài Tạo đƣợc dòng đậu tƣơng biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin ở hạt thông qua phƣơng pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3. Ý nghĩa khoa học Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam chuyển gen tạo astaxanthin vào thực vật nói chung và cây đậu tƣơng nói riêng. Giống đậu tƣơng dùng để chuyển gen là các giống lai đã đƣợc thuần hóa và trồng phổ biến. Ngoài ra, trên thực vật, khả năng tạo astaxanthin chỉ có ở một số loài thuộc chi Adonis.
Các gen đóng vai trò chính trong quá trình chuyển hóa tạo astaxanthin đã đƣợc xác định gồm gen cbfd (mã hóa enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase) và gen hbfd (mã hóa enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase). Các gen này lần đầu tiên đƣợc sử dụng để chuyển vào một loài thực vật khác, có khả năng hoạt động hiệu quả giúp cây chuyển gen sản xuất astaxanthin, điều này làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. Nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hƣởng đáng kể của các phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu khác nhau đến hiệu quả chuyển gen vào giống đậu tƣơng MTĐ 176 thông qua vi khuẩn A. Trong đó, các phƣơng pháp tối ƣu dùng kim châm, dao mổ kết hợp sóng siêu âm, thấm hút chân không đã đƣợc xác định, có thể đƣợc áp dụng để nâng cao hiệu quả chuyển gen vào các giống đậu tƣơng khác.
Ý nghĩa thực tiễn Cây đậu tƣơng biến đổi gen có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt có thể đƣợc sử dụng để sản xuất các sản phẩm từ hạt đậu có chứa astaxanthin LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 nhƣ thức ăn chăn nuôi, thủy sản hoặc bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm cho ngƣời nhƣ bột ngũ cốc. Đối tƣợng, phạm vi và nội dung nghiên cứu của đề tài Nghiên cứu sử dụng một số giống đậu tƣơng đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam. Các giống này đƣợc dùng để chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens giúp tạo đƣợc cây đậu tƣơng có khả năng sản xuất astaxanthin.
Cây đậu tƣơng chuyển gen đƣợc phân tích sự hiện hiện gen biến nạp bằng PCR và Souhern blot, đồng thời đánh giá so sánh kiểu hình và khả năng sinh sản với cây đối chứng. Hạt đậu chuyển gen đƣợc phân tích xác định hàm lƣợng astaxanthin ở thế hệ T1. Nội dung nghiên cứu chính của đề tài: Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt. Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng.
Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tƣơng chuyển gen. Những đóng góp mới của luận án Các gen cbfd2 (mã hóa enzyme enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase) và gen hbfd1 (mã hóa enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase) có nguồn gốc từ cây hoa Adonis aestivalis kết hợp với gen Zm-psy (mã hóa enzyme phytoen sythetase) có nguồn gốc từ ngô khi đƣợc chuyển vào đậu tƣơng đã giúp tạo đƣợc cây phát triển bình thƣờng, có khả năng sản suất astaxanthin. Xây dựng đƣợc qui trình giúp nâng cao hiệu quả chuyển gen trên giống đậu tƣơng MTĐ 176, qui trình này có thể đƣợc áp dụng để nâng cao hiệu quả chuyển gen trên các giống khác.
Cụ thể cải tiến trong phƣơng pháp tạo vết thƣơng mẫu gồm: sử dụng kim châm đâm nhẹ 3 lần hoặc dùng dao mổ cắt nhẹ lên vùng đốt lá mầm 5 lần kết hợp xử lý sóng siêu âm 30 giây hoặc thấm hút chân không 60 giây. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 8 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Chuyển hóa tạo carotenoid ở thực vật Carotenoid là một loại sắc tố hữu cơ tự nhiên có nhiều trong thực vật, đóng vai trò quan trọng giúp bảo vệ, tăng cƣờng sức khỏe nhƣ chống oxy hóa, ung thƣ, tăng cƣờng sức khỏe tim mạch, là tiền chất của vitamin.
Tuy nhiên, con ngƣời không thể tự tổng hợp carotenoid mà hấp thu qua thực phẩm. Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện nhằm thay đổi chu trình chuyển hóa carotenoid ở thực vật để tăng cƣờng các sản phẩm mong muốn, trong đó nổi bật là β-carotene [11][12][13]. Bên cạnh đó, astaxanthin, một carotenoid, nằm ở cuối chuỗi chuyển hóa của một số loài thực vật thuộc chi Adonis cũng đang thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu do có giá trị thị trƣờng rất cao, với công dụng vƣợt trội trong bảo vệ, tăng cƣờng sức khỏe [14][15][16][17][18]. Sau đây là chu trình chuyển hóa tổng hợp carotenoid ở thực vật và một số cải biến chính đã đƣợc thực hiện.
Sinh tổng hợp và tích trữ carotenoid Carotenoid đƣợc tổng hợp từ những tiền chất tạo bởi con đƣờng chuyển hóa MEP (methylerythritol 4-phosphate pathway) diễn ra trong lạp thể. Glyceraldehyde- 3-phosphate và pyruvate là những cơ chất ban đầu để tổng hợp geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), tiền chất chung để tổng hợp các carotenoid và những hợp chất terpenoid khác (hình 1. Bƣớc đầu tiên trong con đƣờng tổng hợp carotenoid là sự kết hợp hai phân tử GGPP tạo thành 15-cis-phytoene đƣợc xúc tác bởi enzyme phytoene synthase (PSY). Phytoene đƣợc chuyển thành lycopene bởi hai phản ứng khử bão hòa xúc tác bởi phytoene desaturase (PDS) và zeta-carotene desaturase (ZDS).
Lycopene là điểm phân nhánh của con đƣờng tổng hợp do là cơ chất của hai enzyme cyclase cạnh tranh nhau, β lycopene cyclase (β-LCY) và ε lycopene cyclase (ε-LCY). α-carotene đƣợc tạo ra khi β-LCY và ε-LCY hoạt động kết hợp với nhau ở hai đầu của phân tử lycopene, trong khi β-carotene đƣợc tạo thành khi chỉ β-LCY hoạt động. α-carotene và β-carotene đƣợc hydroxyl hóa bởi ε-ring carotene hydroxylase và β-ring carotene hydroxylase để tạo lutein và zeaxanthin. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 9 Lutein là sản phẩm cuối cùng của nhánh β, ε còn zeaxanthin đƣợc oxy hóa bởi zeaxanthin epoxidase (ZEP) trong hai bƣớc để tạo violaxanthin thông qua antheraxanthin.
Những phản ứng này có thể đảo ngƣợc bởi violaxanthin deepoxidase (VDE), tạo thành vòng xanthophyll giúp thực vật thích nghi với stress ánh sánh cƣờng độ cao. Violaxanthin đƣợc chuyển thành neoxanthin bởi neoxanthin synthase (NXS), carotenoid cuối cùng của nhánh β,β [19][20][21]. Sơ đồ con đƣờng sinh tổng hợp carotenoid [19] Tích trữ carotenoid: Carotenoid thƣờng đƣợc tổng hợp trong hầu nhƣ tất cả các loại lạp thể của lá, rễ, hoa, trái, hạt bao gồm lục lạp, sắc lạp, bột lạp, dầu lạp… nhƣng đƣợc tích lũy với lƣợng lớn trong lục lạp và sắc lạp. Trong lục lạp, hầu hết LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 10 các carotenoid đƣợc tích lũy ở dạng phức protein-chlorophill-chlorophyll trong các màng thylakoid.
Carotenoid của hạt đƣợc giữ trong các ngăn elaioplasts (các lạp thể dự trữ lipid, vô sắc lạp), có cấu trúc đặc biệt để dự trữ số lƣợng lớn các carotenoid. Trong sắc lạp phần lớn các carotenoid có thể đƣợc dự trữ trong các màng, thể dầu hoặc dạng tinh thể trong stroma [22][23][24]. Thay đổi chuyển hóa sinh tổng hợp carotenoid Những thay đổi đƣợc thực hiện trên một số gen mã hóa các enzyme quan trọng trong con đƣờng sinh tổng hợp carotenoid, giúp tăng cƣờng sự tích lũy hoặc thay đổi tỉ lệ các loại carotenoid đƣợc tạo thành. Sau đây là một số gen mã hóa các enzyme đã đƣợc sử dụng.
Phytoene synthase: Phytoene synthase (PSY) là enzyme xúc tác bƣớc đầu tiên đóng vai trò quan trọng, quyết định đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid, là phản ứng kết hợp hai phân tử GGPP tạo thành phytoene. Do đó sự biểu hiện của gen psy là yếu tố điều hòa quan trọng trong quá trình tích lũy carotenoid ở thực vật.