Đặt vấn đề Ngày nay, nhu cầu cuộc sống của con người ngày càng nâng cao dẫn đến sự phát triển các ngành trong nhiều lĩnh vực nhằm đáp ứng đủ nhu cầu của con người. Biosurfactant (chất hoạt hóa bề mặt sinh học) đang được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực: công nghiệp, nông nghiệp, khai thác mỏ, thuộc da, thu hồi dầu, công nghệ hoá học, mỹ phẩm, dược phẩm , thực phẩm, y học với đặc tính là nhân tố làm ướt, tạo bọt, hoạt hóa bề mặt, nhũ tương hoá. Chất hoạt hóa bề mặt được tổng hợp theo 2 con đường hóa học và sinh học. Hầu hết các chất hoạt hóa bề mặt đang sử dụng đều tổng hợp từ con đường hóa học.
So với chất hoạt hóa bề mặt hóa học thì biosurfactant có nhiều ưu điểm hơn. Ưu điểm của biosurfactant là có cấu trúc lưỡng cực, dễ dàng tạo ra từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền và những phế thải của công nghiệp chế biến, có thể hoạt động được ngay trong các điều kiện khắc nghiệt trong các giếng khoan khai thác dầu khí (nhiệt độ cao, áp suất lớn, nồng độ NaCl cao), nên chúng được sử dụng chủ yếu trong các ngành công nghiệp dầu khí. Với những đặc tính ưu việt đó, biosurfactant được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới, nhưng ở nước ta đây còn là lĩnh vực khá mới mẻ. Dưới sự hướng dẫn của TS Trần Hoàng Ngọc Ái và sự giúp đỡ của các cô trong phòng thí nghiệm trường Đại Học Tôn Đức Thắng, tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu thu nhận biosurfactant từ vi khuẩn Bacillus subtilis”.2 Mục đích đề tài Thu nhận Biosurfactant từ vi khuẩn Bacillus subtilis và nghiên cứu khả năng ứng dụng của Biosurfactant trong xử lý môi trường.3 Yêu cầu đề tài Phân lập được loài Bacillus subtilis từ đất.
Khảo sát khả năng sinh biosurfactant và các yếu tố ảnh hưởng. Xác định hoạt động nhũ tương hóa của biosurfactant vừa thu nhận được. 1 Chương 2 : Tổng Quan 2.1 Giới thiệu về biosurfactant 2.1 Giới thiệu khái quát biosurfactant Chất hoạt hóa bề mặt là các chất có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của chất lỏng. Phân tử chất hoạt hóa bề mặt gồm hai phần: Đầu kỵ nước (Hydrophop) và đầu ưa nước (Hydrophyl).
Đầu kỵ nước phải đủ dài, mạch Carbon từ 8 – 21, ankyl thuộc mạch ankal, anken mạch thẳng hay có gắn vòng cylo hoặc vòng benzene… Đầu ưa nước phải là một nhóm phân cực mạnh như cacboxyl (COO-), Hydroxyl (-OH), amin (-NH2), sulfat (-OSO3)… Chất hoạt hóa bề mặt được tổng hợp theo 2 con đường hóa học và sinh học. Chất có hoạt tính bề mặt sinh học của vi sinh vật là những sản phẩm rất quan trọng, hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp. Những đặc tính có giá trị của chúng là làm thay đổi hoạt hóa bề mặt do làm giảm sức căng bề mặt và giữa hai bề mặt (interface), hoạt tính làm ẩm hoặc xuyên thấm (penetrating), tính lan tỏa (spreading), ưa nước và kị nước, nhũ tương hóa và khử nhũ tương hóa (de- emulsitication), tẩy rửa (detergency), tạo gel (làm đông đặc), tạo bọt kết tụ (floculation), gia tăng phát triển vi khuẩn, thu hút kim loại (metal sequestration) và kháng vi sinh vật. Tuy nhiên hầu hết các chất hoạt hóa bề mặt đang được sử dụng hiện nay đều là tổng hợp hóa học.
Các biosurfactant vẫn chưa được ứng dụng rỗng rãi.1 Tính thấm ướt: Tính thấm ướt tạo điều kiện để vật cần giặt rửa, các vết bẩn tiếp xúc với nước một cách dễ dàng nên đóng vai trò rất quan trọng. Vải sợi có khả năng thấm ướt dễ dàng nhưng nước khó thấm sâu vào bên trong cấu trúc vì sức căng bề mặt rất lớn, nhất là khi vải sợi bị dây bẩn bằng dầu mỡ. Vì thế, dùng xà phòng để làm giảm sức căng bề mặt của nước và vải sợi – nước.2 Khả năng tạo bọt: Bọt được hình thành do sự phân tán khí trong môi trường lỏng. Hiện tượng này làm cho bề mặt dung dịch chất tẩy rửa tăng lên.
2 Khả năng tạo bọt và độ bền bọt phụ thuộc vào cấu tạo của chính chất đó, nồng độ, nhiệt độ của dung dịch, độ pH và hàm lượng ion Ca2+, Mg2+ trong dung dịch chất tẩy rửa.3 Khả năng hòa tan: Tính hòa tan phụ thuộc vào các yếu tố: - Bản chất và vị trí của nhóm ưa nước. Nhóm ưa nước ở đầu mạch dễ hòa tan hơn nhóm ở giữa mạch. - Chiều dài của mạch Hydrocacbon. Nhóm kỵ nước mạch thẳng dễ hòa tan hơn mạch nhánh.
- Nhiệt độ - Bản chất của ion kim loại: với ion Na+, K +dễ hòa tan hơn các ion Ca2+, Mg2+ … [2] 2.4 Khả năng hoạt hóa bề mặt: Nước có sức căng bề mặt lớn. Khi hòa tan xà phòng vào nước, sức căng bề mặt của nước giảm. Một lớp hấp thụ định hướng hình thành trên bề mặt nhóm ưa nước hướng vào nước, nhóm kỵ nước hướng ra ngoài. Nhờ có lớp hấp thụ đó mà sức căng bề mặt của nước giảm vì bề mặt nước – không khí được thay bằng kỵ nước – không khí (giữa các pha) [2] Hình 2.1 Khả năng hoạt động bề mặt 3 2.5 Khả năng nhũ hóa: Nhũ tương là hệ phân tán không bền vững nên muốn thu được hệ bền vững thì phải cho thêm chất nhũ hóa.
Xà phòng thường được dùng làm chất ổn định nhũ tương. Tác dụng của chúng là làm giảm sức căng bề mặt của hai hướng dầu – nước. sau đó, làm cho hệ nhũ tương dễ dàng ổn định.3 Ưu điểm của biosurfactant Nếu so sánh với chất hoạt hóa bề mặt hóa học thì các biosurfactant có nhiều ưu điểm hơn như: - Có khả năng phân hủy sinh học. - Nhìn chung các chất đều có độ độc thấp.
- Có tính dung hợp sinh học (biocompatibility) và tính tiêu hóa được (digestibility) nên thường dùng trong mỹ phẩm, dược phẩm hay thậm chí làm chất phụ gia thực phẩm. - Nguồn nguyên liệu ban đầu sẵn có: các nguồn vật liệu thô, rẻ tiền như hydrocacbon, cacbonhydrat hay lipid có thể được tận dụng tối đa để sản xuất ra biosurfactant. - Sản xuất có hiệu quả kinh tế: phụ thuộc vào việc ứng dụng biosurfactant có thể được sản xuất từ phụ phế phẩm công, nông nghiệp rẻ tiền và điều này có ý nghĩa quan trọng cho sản xuất lớn. Do vậy chi phí nguyên liệu sản xuất không đáng kể.
- Sử dụng trong kiểm soát môi trường: dùng trong xử lí các vụ dầu tràn, trong phân hủy sinh học và giải độc hay trong bồi hoàn sinh học xử lí, đất bị ô nhiễm. - Tính đặc hiệu: các biosurfactant ở dạng phức hợp chất hữu cơ với các nhóm chức đặc trưng nên thường có hoạt tính chuyên biệt, điều này có giá trị đặc biệt trong giải độc (detoxification) và các chất ô nhiễm (pollutants), khử nhũ tương hóa các nhũ tương công nghiệp và những ứng dụng đặc biệt trong mỹ phẩm, dược phẩm hay thực phẩm. - Tính hiệu quả ở các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, pH và muối.4 Các nhóm biosurfactant Biosurfactant của vi khuẩn: nhiều loại vi khuẩn có khả năng tạo ra glycolipid. Đầu mang gốc đường của glycolipid có thể chứa nhiều loại đường khác nhau như rhamnose, trehalose (còn gọi là đường nấm men), sucrose và glycose.
Rhamnolipid chứa một hoặc hai đơn vị rhamnose và phần còn lại thường là 2 acid β- hydroxy trehalose lipid có liên hệ với vách tế bào. Các acid béo β-hydroxy phân nhánh α thường bị este hóa tại nhóm 6 và 6’ hydroxyl của đơn vị trehalose. Biosurfactant của nấm men: Sophrose lipid dạng lacton và acid của Torulopsis magnoliac (bombicola). Chất nhũ hóa sinh học ở dạng polysaccharide ngoại bào: Polysaccharide ngoại bào của vi khuẩn là những polymer có khối lượng phần tử lớn mang nhiều tính chất vật lí và cơ học rất hữu ích như có tính nhớt cao, tính co giãn, khả năng chịu đựng sự biến dạng… Trong công nghiệp, các chất này được sử dụng rộng rãi ở dạng gôm, chất biến đổi, tác nhân làm dày, chất ổn định có độ nhớt cao.
Một trong những chất nhũ hóa sinh học được nghiên cứu nhiều nhất là Emulsan, được tiết ra từ vi khuẩn phân hủy dầu Acinetobacter calcoaceticus.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sản xuất biosurfactant 2.1 Nguồn carbon Chất HHBMSH được sản xuất bởi nhiều các sinh vật khác nhau và chúng cũng có những cấu trúc rất khác nhau, tuy nhiên có một số các hiện tượng chung liên quan tới việc tổng hợp chúng: Thứ nhất là việc sản xuất CHHBMSH có thể do các hydrocacbon hoặc các cơ chất không tan trong nước. Hiện tượng dễ thấy khác là sự kìm hãm tổng hợp CHHBMSH bởi glucose và một số các chất trao đổi khác. Trong trường hợp của Athrobacter paraffineus I, CHHBMSH không được tạo ra khi thay thế hexan bằng glucose. Một chủng thuộc loài Pseudomonas aeruginosa đã sản xuất ra một chất giống protein trên nguồn hydrocacbon nhưng không tạo ra trên glucose, glycerol,axit palmitic.
Loài Torulopsis petrophilum không tạo ra bất cứ một glucolipid nào khi nuôi trên môi trường đồng pha chứa bất cứ nguồn cacbon hoà tan trong nước nào. Đối với chủng Pseudomonas 5 aeruginosa khác khi nuôi trên môi trường chứa glycerol nếu thêm glucose, acetate, succinate, citrate thì sản lượng rhamnolipid giảm mạnh. Nhiều loài vi sinh vật đã được biết là sẽ tổng hợp nhiều loại CHHBM khác nhau khi nuôi trên vài nguồn cacbon. Có nhiều ví dụ về việc sản xuất CHHBMSH trên các nguồn cacbon hoà tan trong nước như ở Pseudomonas sp.
đã sản xuất CHHBMSH trên các nguồn cacbon hoà tan trong nước như glycerol, glucose, mannitol, ethanol. Nhiều tác giả đã chứng minh rằng sản lượng CHHBMSH tạo ra ít khi nuôi vi sinh vật trên các nguồn cacbon nào đó trong môi trường, chỉ khi nào nguồn cacbon này hết, khi đưa vào nguồn cacbon không hoà tan trong nước sẽ thúc đẩy tạo CHHBMSH.Việc tạo glucolipid bởi Torulospos bombiloca được kích thích khi thêm dầu ăn vào trong môi trường nuôi cấy chứa 10% D – glucose. Davis cùng các cộng sự đã chứng minh khi thêm ethyl este của một loại axit béo vào môi trường chứa glucose thì sản lượng sopholipid ở chủng Candida bombicola CBS6009 tăng. Khi sản xuất glucolipid ở chủng Torulopsis apicola TMET73747, Stuwer cùng các cộng sự đã thu được sản lượng lên tới 90g/l trên môi trường chứa glucose và dầu hướng dương.
Nhìn chung các hydrocacbon khác nhau bị phân huỷ bởi nhiều loại vi khuẩn và bằng nhiều con đường khác nhau. Cơ chế phân huỷ các hydrocacbon của vi sinh vật đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu. Vi sinh vật sử dụng hydrocacbon làm nguồn dinh dưỡng và năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển.