Tổng quan luận án
Rối loạn phổ tự kỷ (Autism Spectrum Disorders - ASD) là một nhóm rối loạn phát triển thần kinh khởi phát sớm trong ba năm đầu đời, đặc trưng bởi sự khiếm khuyết trong tương tác xã hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, cùng các hành vi, sở thích mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Bệnh nhân tự kỷ thường có các rối loạn đi kèm như rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa và phản ứng bất thường với các kích thích cảm giác; khoảng 31% bệnh nhân có khuyết tật trí tuệ và 20-25% có triệu chứng co giật. Về mặt dịch tễ học, các ước tính cho thấy ASD ảnh hưởng đến khoảng 1/59 trẻ dưới 8 tuổi, với tỷ lệ mắc ở bé trai cao gấp 4-6 lần so với bé gái. Tự kỷ có cơ sở di truyền phức tạp do ảnh hưởng đồng thời của nhiều biến thể gen khác nhau; sự đồng nhất kiểu hình ở các cặp song sinh cùng trứng đạt từ 70% đến 90%, trong khi ở song sinh khác trứng chỉ đạt từ 0% đến 30%; nguy cơ tái mắc ở anh chị em ruột trong gia đình lên tới 25%, và mức độ di truyền của bệnh được ghi nhận từ 40% đến 80%.
Tại Việt Nam, trường hợp tự kỷ đầu tiên được ghi nhận vào giai đoạn 1997-1998 và số lượng bệnh nhân đến khám ngày càng gia tăng (thống kê tại Bệnh viện Nhi Trung ương cho thấy năm 2007 có 405 trường hợp, đến năm 2015 đã ghi nhận khoảng 200.000 trường hợp). Tuy nhiên, các can thiệp lâm sàng trong nước hiện chủ yếu dừng lại ở các biện pháp hỗ trợ, phục hồi chức năng và giáo dục chuyên biệt; các nghiên cứu về bản chất di truyền học phân tử còn rất hạn chế. Việc làm rõ nguyên nhân di truyền ở cấp độ hệ gen là một khoảng trống nghiên cứu cần được giải quyết nhằm hỗ trợ chẩn đoán và định hướng điều trị. Xuất phát từ thực tiễn đó, luận án "Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (exome)" được thực hiện.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm hai nội dung được đánh số:
- Giải trình tự và phân tích toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.
- Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu của luận án được triển khai theo bốn nhiệm vụ cụ thể:
- Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ.
- Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân và gia đình.
- Giải trình tự toàn bộ exome của một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.
- Phân tích số liệu tìm các biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số người Việt Nam.
Đối tượng nghiên cứu là các mẫu máu thu nhận từ 07 bệnh nhân nam được chẩn đoán mắc rối loạn tự kỷ cùng với người thân (bố và mẹ). Phạm vi không gian nghiên cứu được thực hiện đối với các bệnh nhân đến khám và điều trị tại Khoa Tâm bệnh thuộc Bệnh viện Nhi Trung ương (Hà Nội, Việt Nam); các phân tích sinh học phân tử và tin sinh học được tiến hành tại Viện Nghiên cứu hệ gen và Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Về phạm vi thời gian, công trình được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu ưu tiên cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (mã số VAST02) và hoàn thành vào năm 2019.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Luận án đã tổng quan các công trình nghiên cứu về dịch tễ học, công cụ chẩn đoán và cơ sở di truyền của bệnh tự kỷ trên thế giới và tại Việt Nam:
Về dịch tễ và chẩn đoán, Williams và cộng sự (2006) báo cáo tỷ lệ mắc ASD toàn cầu là 20/10.000; Elsabbagh và cộng sự (2012) ghi nhận tỷ lệ 62/10.000 (tương đương 1/160 trẻ); Baxter và cộng sự (2015) ghi nhận tỷ lệ 7,6/1.000. Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC, 2014) thống kê tỷ lệ trẻ tự kỷ là 1/68, tăng 119,4% so với năm 2000 (1/150). Ở châu Á, Sun và Allison (2010), Sun và cộng sự (2013) khảo sát tại sáu quốc gia cho thấy tỷ lệ hiện mắc là 14,8/10.000. Tại Việt Nam, Quách Thúy Minh (2011), Khoa Tâm thần (2012), Vũ Song Hà và cộng sự (2014, 2017), Đậu Tuấn Nam và Vũ Hải Vân (2015) đã ghi nhận sự gia tăng nhanh chóng của số ca bệnh đến khám. Các công cụ chẩn đoán được tổng quan gồm CHAT (Baron-Cohen et al., 1992), M-CHAT 23 (Robins et al., 2001), CARS, DBC-P (Einfeld và Tonge, 1992), ADI-R, ADOS, PL-ADOS và GARS (Gilliam, 1995).
Về các hội chứng di truyền liên quan đến ASD, luận án điểm lại hội chứng Fragile X (FXS) do đột biến tăng số lần lặp bộ ba CGG (>200 lần) tại gen FMR1 ở vị trí Xq27.3 (Bagni và Greenough, 2005; Rousseau et al., 1995; Hagerman et al., 2010), và bệnh xơ cứng não củ (Tuberous Sclerosis - TS) do đột biến bất hoạt trên gen TSC1 (9q34) hoặc TSC2 (16p13) (Napolioni và Curatolo, 2008; Gutierrez et al., 1998; Crino et al., 2006).
Về các yếu tố ở cấp độ phân tử, luận án hệ thống hóa các nghiên cứu về biến thể số lượng bản sao (CNVs) (Sebat et al., 2007; Christian et al., 2008; Marshall et al., 2008; Rajcan-Separovic et al., 2007; Kumar et al., 2008; Liang et al., 2009; Fernandez et al., 2010); nhóm gen khớp thần kinh gồm neuroligins (NLGN1, NLGN2, NLGN3, NLGN4X, NLGN4Y với đột biến R704C trên NLGN3; Lintas và Persico, 2009; Etherton et al., 2011), họ gen SHANK gồm SHANK1, SHANK2, SHANK3 tại 22q13 liên quan đến hội chứng Phelan-McDermid (Naisbitt et al., 1999; Boeckers et al., 2002; Phelan và McDermid, 2011), và neurexins NRXN1, NRXN2, NRXN3 (Ichtchenko et al., 1995; Missler et al., 2003; Zhang et al., 2005; Vaags et al., 2012). Ngoài ra, tài liệu điểm qua gen cấu trúc chromatin MECP2 liên quan hội chứng Rett (Chahrour và Zoghbi, 2007; Lam et al., 2000; Young et al., 2008); các gen điều hòa phát triển và hình thái gồm HOXA1 (Ingram et al., 2000; Conciatori et al., 2004; Muscarella et al., 2010; Raznahan et al., 2012; Tischfield et al., 2005; Bosley et al., 2007), PTEN tại 10q23 liên quan hội chứng Cowden và tật đầu to (Blumenthal và Dennis, 2008; Ma và Blenis, 2009; Goffin et al., 2001), và EIF4E tại 4q21-q25 (Neves-Pereira et al., 2009); các gen điều hòa kênh Ca2+ nội bào gồm CACNA1C, CACNA1F, KCNMA1, SCN2A, RYRs (Splawski et al., 2004; Krey và Dolmetsch, 2007; Naoki Matsuo et al., 2009; Lanner et al., 2010); chức năng ty thể (Giulivi et al., 2010; Palmieri và Persico, 2010) và hai gen MUC16 (Mizejewski et al., 2013) cùng HTR4 (Hu et al., 2011).
Về phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NGS), luận án tổng thuật các công trình WES xác định đột biến mới của O’Roak và cộng sự (2011, 2012), Iossifov và cộng sự (2012), Sanders và cộng sự (2012), Neale và cộng sự (2012), Gupta và cộng sự (2014); các công trình xác định biến thể lặn hoặc biến thể hiếm của Chahrour và cộng sự (2007), Bi và cộng sự (2012 với gen ANK3), Novarino và cộng sự (2012 với gen BCKDK), Puffenberger và cộng sự (2012 với gen HERC2), Yu và cộng sự (2013 với các gen AMT, PEX7, VPS13B/COH1, SYNE1), Egawa và cộng sự (2015 với biến thể CLN8 R24H), Inoue và cộng sự (2015 với các biến thể RPS24 Q191X và CD300LF P261fsX266); các nghiên cứu đột biến trên nhiễm sắc thể X của Nava và cộng sự (2012), Stein và cộng sự (2013), Butler và cộng sự (2014, 2015); và nghiên cứu giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) của Yuen và cộng sự (2015).
Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: các nghiên cứu exome trước đây chủ yếu thực hiện trên quần thể bệnh nhân thuộc các nước phương Tây hoặc một số nước Đông Á; dữ liệu về các biến thể di truyền trên toàn bộ vùng mã hóa ở bệnh nhân tự kỷ tại Việt Nam hoàn toàn chưa được thiết lập. Luận án đặt mục tiêu áp dụng kỹ thuật WES nhằm xác định các biến thể di truyền đặc thù ở bệnh nhân tự kỷ Việt Nam, tập trung vào các nhóm gen kênh ion và các gen liên quan đến tiếp hợp thần kinh.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án tiếp cận dựa trên mô hình di truyền đa gen (oligogenic/polygenic model) của rối loạn phổ tự kỷ, trong đó sự kết hợp của các biến thể hiếm làm biến đổi chức năng các protein kênh dẫn truyền ion canxi (RYR2, RYR3), các thụ thể dẫn truyền thần kinh (HTR4) và các glycoprotein màng (MUC16) đóng vai trò then chốt trong cơ chế sinh bệnh học.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành qua các khâu kỹ thuật tiêu chuẩn:
Đối tượng nghiên cứu gồm 07 bệnh nhân nam và bố mẹ. Các bệnh nhân được đánh giá lâm sàng bằng bảng câu hỏi DBC-P và thang đánh giá CARS bởi bác sĩ tại Khoa Tâm bệnh, Bệnh viện Nhi Trung ương. Nghiên cứu được chấp thuận bởi Hội đồng Y đức Viện Nghiên cứu hệ gen theo Quyết định số 02/QĐ-NCHG và tuân thủ Tuyên bố Helsinki của Hội đồng Y khoa thế giới.
| STT |
Ký hiệu bệnh nhân |
Giới tính |
Mẫu bố/mẹ đi kèm |
Điểm DBC-P |
Điểm CARS |
| 1 |
T01 |
Nam |
Bố + Mẹ |
29 |
41,5 |
| 2 |
T02 |
Nam |
Bố + Mẹ |
29 |
41,0 |
| 3 |
T03 |
Nam |
Bố + Mẹ |
29 |
41,5 |
| 4 |
T06 |
Nam |
Bố + Mẹ |
29 |
40,5 |
| 5 |
T07 |
Nam |
Bố + Mẹ |
25 |
42,5 |
| 6 |
T08 |
Nam |
Bố + Mẹ |
29 |
40,5 |
| 7 |
T09 |
Nam |
Không có |
29 |
44,0 |
Phương pháp sinh học phân tử và tin sinh học gồm:
- Tách chiết DNA tổng số: Thu thập 2 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA 1,5 mg/ml, tách chiết bằng bộ kit QIAamp Blood Mini Kit (QIAGEN), kiểm tra chất lượng bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo mật độ quang phổ.
- Tạo thư viện DNA exome: Sử dụng hệ thống làm giàu đích SureSelect Target Enrichment System (cho giải trình tự bắt cặp Illumina paired-end multiplexed sequencing) qua năm bước: cắt đoạn DNA, gắn adaptors và indexes riêng cho từng mẫu, lai bắt giữ với các mẫu dò exome, khuếch đại thư viện bằng PCR.
- Giải trình tự thế hệ mới: Sử dụng hệ thống máy giải trình tự Illumina theo nguyên lý giải trình tự bằng tổng hợp (Sequencing by Synthesis - SBS), kết hợp các bộ kit TruSeq DNA Nano và TruSeq DNA PCR-free.
- Xử lý số liệu và phân tích tin sinh học: Dữ liệu thô FastQ được gióng hàng với hệ gen tham chiếu người bằng phần mềm BWA (với các thuật toán BWA-backtrack, BWA-SW, BWA-MEM); chuyển đổi, sắp xếp và tạo chỉ mục tệp SAM/BAM bằng Samtools và Picard; xác định biến thể đơn nucleotide và indel bằng phần mềm GATK (Genome Analysis Toolkit); hiển thị và kiểm tra trực quan các biến thể bằng IGV (Integrated Genomics Viewer); đối chiếu với cơ sở dữ liệu dbSNP, 1000 Genomes, OMIM để sàng lọc và chú giải biến thể.
- Kiểm chứng biến thể bằng PCR và giải trình tự Sanger: Thiết kế các cặp mồi oligonucleotide đặc hiệu để nhân đoạn gen mục tiêu trên máy PCR Eppendorf AG, sau đó giải trình tự tự động hai chiều trên hệ máy ABI 3500 Genetic Analyzer bằng kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
- Phân tích tương tác mạng lưới gen và mô phỏng cấu trúc protein 3D bằng các phần mềm tin sinh chuyên sâu để đánh giá ảnh hưởng của các đột biến thay thế amino acid.
| Tên mồi |
Chiều |
Trình tự đoạn mồi (5' > 3') |
Kích thước sản phẩm (kb) |
Gen đích |
| R4-F / R4-R |
Xuôi / Ngược |
TTATTGTGTTGCTTGGCTCCCGGAG / GGTCATATGTAGGAAATGCCAAGAGG |
1,5 |
RYR3 |
| R65-F / R65-R |
Xuôi / Ngược |
GCCTAGTGCCTAGGGATGTCCATGG / GCTCCTCTCCTCTCAGCACATGAAAT |
1,5 |
RYR3 |
| R2-F / R2-R |
Xuôi / Ngược |
CACATTATGATGGTACGTAGGGG / GCCTGGACAACAGAGCACGACTCC |
0,6 |
RYR2 |
| M16_1F / M16_1R |
Xuôi / Ngược |
GGCACAGCCTCTTCAGCAGGGAC / GTCACCACAGAATTGCTAGAGGTAGG |
0,4 |
MUC16 |
| M16_2F / M16_2R |
Xuôi / Ngược |
ATCCGTCCAAACTAAAGCACCCACC / TTGGATGAGGTGGGCGTGGCTGGCA |
0,4 |
MUC16 |
| M16_3F / M16_3R |
Xuôi / Ngược |
TTCCACCCCAGCTCCAAAGACAGGC / TTCCTTGCTGTATCCCTTGGGTCTGG |
0,4 |
MUC16 |
| M16_4F / M16_4R |
Xuôi / Ngược |
ATGCACCAAGACCTATGCTCAGCC / GGCTGTAGTTGGTGGAGCTGACAT |
0,4 |
MUC16 |
| M16_5F / M16_5R |
Xuôi / Ngược |
AAGCAGTCCAGTACACTCAGGG / AACCTGCATAGAGAGGGAGGGAGG |
0,4 |
MUC16 |
| M16_6F / M16_6R |
Xuôi / Ngược |
AGTACCTTCTTCCCTGATCTGAGG / ATCCAAGCCTCTCATGGCAGAAAGG |
0,4 |
MUC16 |
| H4_F / H4_R |
Xuôi / Ngược |
CCCTCCGACTCTTCTCCTCAA / TCACCCAGACCACTATCAGA |
0,4 |
HTR4 |
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương này trình bày toàn diện về bệnh tự kỷ, bao gồm các khái niệm, lịch sử phát hiện từ năm 1943 của Leo Kanner, thực trạng dịch tễ học toàn cầu và tại Việt Nam. Tác giả phân tích phân loại năm dạng rối loạn phát triển lan tỏa gồm tự kỷ điển hình, hội chứng Asperger, hội chứng Rett, rối loạn tan rã thời thơ ấu (hội chứng Heller) và rối loạn phát triển lan tỏa không xác định (PDD-NOS). Chương 1 hệ thống hóa các hội chứng di truyền liên quan chặt chẽ đến ASD (hội chứng Fragile X, xơ cứng não củ), phân tích các cơ chế biến dị ở mức độ nhiễm sắc thể, đột biến số lượng bản sao (CNVs) và các đột biến đơn gen. Các nhóm gen quan trọng tham gia vào chức năng tiếp hợp thần kinh (neuroligins, SHANK, neurexins), cấu trúc chất nhiễm sắc (MECP2), điều khiển hình thái phôi thai (HOXA1, PTEN, EIF4E), các kênh điều hòa ion canxi (CACNA1C, CACNA1F, KCNMA1, RYRs, SCN2A) và chức năng ty thể được phân tích chi tiết. Cuối cùng, chương 1 tổng kết lịch sử phát triển của các phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS), so sánh hiệu quả của phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (WES) và giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS), chỉ ra tính khả thi và hiệu quả của WES trong việc xác định các biến thể di truyền gây bệnh tự kỷ từ năm 1975 đến 2015.
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết thông tin lâm sàng của 07 bệnh nhân tự kỷ (T01, T02, T03, T06, T07, T08, T09) có điểm CARS dao động từ 40,5 đến 44,0 (mức độ tự kỷ nặng) và điểm DBC-P từ 25 đến 29 (vượt ngưỡng chẩn đoán tự kỷ là 17 điểm). Toàn bộ hóa chất, trang thiết bị từ các nhà sản xuất như Illumina, QIAGEN, Sigma, Merck, Fermentas, Eppendorf, Bio-Rad và hệ máy giải trình tự ABI 3500 được chuẩn hóa. Chương này thiết lập quy trình thực nghiệm gồm tách chiết DNA máu ngoại vi, kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ, quy trình chuẩn bị thư viện SureSelect XT cho hệ thống Illumina, các bước kiểm định chất lượng tệp dữ liệu đọc FastQ. Đồng thời, chương trình bày chi tiết quy trình xử lý số liệu tin sinh học bằng các công cụ BWA, Samtools, Picard, GATK và IGV; kỹ thuật nhân gen bằng PCR, phương pháp giải trình tự Sanger kiểm chứng và các phần mềm mô phỏng cấu trúc protein 3D, phân tích tương tác gen.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu
Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:
- Đã tách chiết thành công DNA tổng số từ mẫu máu của 07 bệnh nhân và các thành viên gia đình đạt tiêu chuẩn nồng độ và độ tinh sạch phục vụ tạo thư viện.
- Thư viện DNA exome của các mẫu được xây dựng thành công bằng hệ thống SureSelect, kiểm tra chất lượng đạt yêu cầu và tiến hành giải trình tự trên hệ máy Illumina, tạo ra dữ liệu đọc FastQ có chất lượng cao.
- Dữ liệu giải trình tự được gióng hàng thành công với hệ gen tham chiếu người; quy trình lọc biến thể qua GATK đã phân loại và chú giải các biến thể có mặt ở từng bệnh nhân từ T01 đến T09.
- Xác định và kiểm chứng thành công các biến thể di truyền nổi bật:
- Phát hiện 02 biến thể mới p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys trên gen RYR3 ở bệnh nhân T06; mô hình hóa 3D cho thấy các đột biến này làm thay đổi cấu trúc không gian của protein tại 5 domain đầu tiên.
- Phát hiện 02 biến thể mới p.Arg801Cys và p.Tyr819Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07; phân tích trình tự amino acid đối chiếu qua các loài chứng minh vị trí đột biến nằm ở vùng có tính bảo thủ cao.
- Phát hiện 06 biến thể mới trên gen MUC16 bao gồm p.Ala2224Ser (ở bệnh nhân T02 và T09), p.Val2430Ala (ở T03), p.Leu13171Phe và p.Glu12869Lys (ở T06), p.Val13167Met (ở T07), và p.Trp13569Cys (ở T02 và T08).
- Xác định sự xuất hiện của đa hình đơn nucleotide rs7725785 (c.507+53G>T) trên gen HTR4 ở 04 bệnh nhân gồm T01, T07, T08 và T09.
- Thiết lập sơ đồ mạng lưới tương tác gen cho từng bệnh nhân nghiên cứu.
| Gen |
Biến thể amino acid / nucleotide |
Bệnh nhân ghi nhận |
Phương pháp kiểm chứng |
| RYR3 |
p.Leu111Pro |
T06 |
Sanger |
| RYR3 |
p.Arg3048Cys (p.R3048C) |
T06 |
Sanger |
| RYR2 |
p.Arg801Cys |
T07 |
Sanger |
| RYR2 |
p.Tyr819Cys (p.W819C) |
T07 |
Sanger |
| MUC16 |
p.Ala2224Ser |
T02, T09 |
Sanger |
| MUC16 |
p.Val2430Ala |
T03 |
Sanger |
| MUC16 |
p.Leu13171Phe |
T06 |
Sanger |
| MUC16 |
p.Glu12869Lys |
T06 |
Sanger |
| MUC16 |
p.Val13167Met |
T07 |
Sanger |
| MUC16 |
p.Trp13569Cys |
T02, T08 |
Sanger |
| HTR4 |
rs7725785 (c.507+53G>T) |
T01, T07, T08, T09 |
Sanger |
Chương 4: Bàn luận kết quả
Chương 4 tập trung biện giải ý nghĩa sinh học của các phát hiện:
- Bàn luận về vai trò của các kênh phóng thích canxi từ mạng lưới nội chất: Các thụ thể Ryanodine (RYRs), đặc biệt là RYR2 và RYR3, là các homotetramer kích thước lớn đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì cân bằng nội môi Ca2+ nội bào của tế bào thần kinh trung ương. Đột biến trên RYR3 (p.Leu111Pro, p.Arg3048Cys) được đối chiếu với các bằng chứng thực nghiệm của Naoki Matsuo và cộng sự (2009) trên mô hình chuột bị loại bỏ gen RYR3, cho thấy chuột knockout có sự suy giảm và rối loạn hoạt động vận động cũng như xuất hiện hành vi tăng động thái quá. Đột biến trên RYR2 (p.Arg801Cys, p.Tyr819Cys) nằm ở các domain cấu trúc được bảo thủ cao qua các loài sinh vật, làm biến đổi tương tác không gian và dòng ion Ca2+.
- Bàn luận về gen MUC16: Luận án thảo luận mối liên quan giữa glycoprotein MUC16 và phản ứng miễn dịch thần kinh, củng cố giả thuyết của Mizejewski và cộng sự (2013) khi xếp MUC16 cùng với IL-8 và TIMP-1 vào nhóm chỉ thị phân tử sinh học nhóm 3 trong sàng lọc tự kỷ ở trẻ sơ sinh. Sự xuất hiện lặp lại của 06 biến thể mới trên MUC16 ở đa số bệnh nhân gợi ý vai trò quan trọng của gen này trong sự nhạy cảm với ASD.
- Bàn luận về đa hình rs7725785 trên gen HTR4: Tác giả thảo luận vai trò của thụ thể serotonin 5-HT4 (mã hóa bởi gen HTR4) trong việc điều hòa các con đường dẫn truyền thần kinh liên quan đến hành vi và cảm xúc, tương đồng với các công bố của Hu và cộng sự (2011) về vai trò của gen này trong các rối loạn tâm thần. Tỷ lệ mang biến thể rs7725785 c.507+53G>T ở 4/7 bệnh nhân là dữ kiện thực nghiệm cho thấy đa hình này có thể là yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng phát triển bệnh tự kỷ ở người Việt Nam.
Kết quả và những đóng góp mới
Luận án đã đạt được các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn:
- Đưa ra số liệu về các biến thể di truyền trên toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở 07 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới.
- Xác định 02 biến thể mới p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys (p.R3048C) trên gen RYR3 ở bệnh nhân T06.
- Xác định 02 biến thể mới p.Arg801Cys và p.Tyr819Cys (p.W819C) trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07.
- Xác định 06 biến thể mới trên gen MUC16 (p.Ala2224Ser, p.Val2430Ala, p.Leu13171Phe, p.Glu12869Lys, p.Val13167Met, p.Trp13569Cys) ở các bệnh nhân nghiên cứu.
- Xác định đa hình đơn nucleotide rs7725785 (c.507+53G>T) trên gen HTR4 ở 04 bệnh nhân (T01, T07, T08, T09).
Về kiến nghị, tác giả đề xuất:
- Cần mở rộng quy mô nghiên cứu trên số lượng mẫu bệnh nhân tự kỷ lớn hơn để đánh giá tần số xuất hiện của các biến thể phát hiện được trong quần thể người Việt Nam.
- Cần tiếp tục tiến hành các thử nghiệm chức năng chuyên sâu nhằm làm rõ cơ chế tác động của các đột biến mới trên gen RYR2, RYR3 đối với động học dòng canxi nội bào và biểu hiện bệnh lý thần kinh.
- Ứng dụng quy trình phân tích WES kết hợp kiểm chứng Sanger đã thiết lập trong sàng lọc di truyền và hỗ trợ chẩn đoán sớm cho các gia đình có nguy cơ cao.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của luận án:
- Kích thước mẫu nghiên cứu còn hạn chế (07 bệnh nhân nam) do chi phí giải trình tự thế hệ mới và tính phức tạp trong việc thu thập đủ mẫu bệnh phẩm có sự đồng thuận của cả bố và mẹ.
- Phạm vi nghiên cứu tập trung vào vùng gen mã hóa (exome), do đó chưa bao quát được các biến thể nằm sâu trong vùng không mã hóa (intron, intergenic) hoặc các biến thể cấu trúc lớn (CNVs kích thước nhỏ ngoài vùng exon) vốn có thể đóng vai trò trong cơ chế bệnh sinh.
- Luận án chưa tiến hành các thử nghiệm chức năng sinh học trực tiếp in vitro hoặc trên mô hình động vật biến đổi gen để đánh giá cơ chế phân tử cụ thể của từng biến thể mới phát hiện.
Hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Mở rộng cỡ mẫu phân tích WES trên các nhóm gia đình có nhiều thành viên mắc tự kỷ (multiplex families) tại Việt Nam.
- Ứng dụng công nghệ giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) nhằm phát hiện toàn diện các biến thể ở cả vùng mã hóa và vùng không mã hóa.
- Thực hiện các nghiên cứu chức năng tế bào để làm sáng tỏ cơ chế sinh học phân tử của các đột biến trên hệ thống kênh thụ thể Ryanodine (RYR2, RYR3) và đa hình HTR4.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo cho:
- Các nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà khoa học thuộc chuyên ngành Hóa sinh học, Di truyền học phân tử, Công nghệ sinh học và Tin sinh học: cung cấp quy trình kỹ thuật chuẩn về tạo thư viện exome (SureSelect XT), quy trình xử lý dữ liệu tin sinh học (BWA, GATK, Samtools, Picard, IGV) và phương pháp kiểm chứng bằng giải trình tự Sanger.
- Các bác sĩ lâm sàng, cán bộ y tế tại các chuyên khoa Tâm thần nhi và Thần kinh: cung cấp cơ sở dữ liệu về các biến thể gen cụ thể (RYR2, RYR3, MUC16, HTR4) trên bệnh nhân người Việt, phục vụ tư vấn di truyền và định hướng phát triển các dấu ấn sinh học hỗ trợ chẩn đoán.
- Các đơn vị xây dựng chính sách y tế và cơ sở dữ liệu hệ gen người Việt Nam: đóng góp dữ liệu biến dị di truyền thực nghiệm ở nhóm bệnh nhân rối loạn phát triển thần kinh.
Phần đáng tham khảo nhất của luận án là Chương 2 và Chương 3, nơi trình bày chi tiết các cặp mồi khuếch đại gen đặc hiệu, quy trình đường ống tin sinh học phân tích đột biến và hệ thống bảng số liệu kiểm chứng các biến thể gen kênh ion.
Câu hỏi thường gặp
1. Luận án đã nghiên cứu trên bao nhiêu bệnh nhân và tiêu chuẩn lâm sàng lựa chọn mẫu là gì?
Luận án thực hiện trên 07 bệnh nhân nam người Việt Nam (ký hiệu từ T01 đến T09; gồm T01, T02, T03, T06, T07, T08, T09), được thu nhận mẫu máu cùng bố mẹ tại Khoa Tâm bệnh, Bệnh viện Nhi Trung ương. Tất cả bệnh nhân đều có biểu hiện lâm sàng tự kỷ nặng theo hai thang đo chuẩn hóa: điểm thang đánh giá tự kỷ tuổi ấu thơ (CARS) dao động từ 40,5 đến 44,0 điểm (ngưỡng xác định tự kỷ nặng là từ 37 đến 60 điểm) và điểm bảng kiểm phát triển hành vi cho cha mẹ (DBC-P) từ 25 đến 29 điểm (vượt xa ngưỡng chẩn đoán tự kỷ là trên 17 điểm).
2. Những biến thể mới nào đã được phát hiện trên hai gen kênh ion RYR2 và RYR3?
Luận án đã xác định được 04 biến thể mới trên hai gen thuộc họ thụ thể Ryanodine:
- Trên gen RYR3: phát hiện 02 biến thể mới là p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys (p.R3048C) ở bệnh nhân T06.
- Trên gen RYR2: phát hiện 02 biến thể mới là p.Arg801Cys và p.Tyr819Cys (p.W819C) ở bệnh nhân T07.
Các biến thể này đều đã được kiểm chứng thành công bằng giải trình tự Sanger và được mô phỏng cấu trúc 3D cho thấy sự thay đổi không gian tại các domain bảo thủ của protein.
3. Biến thể trên gen MUC16 và gen HTR4 có những đặc điểm gì ở các bệnh nhân nghiên cứu?
- Trên gen MUC16: Luận án phát hiện 06 biến thể mới bao gồm p.Ala2224Ser (ở T02, T09), p.Val2430Ala (ở T03), p.Leu13171Phe (ở T06), p.Glu12869Lys (ở T06), p.Val13167Met (ở T07) và p.Trp13569Cys (ở T02, T08).
- Trên gen HTR4: Luận án ghi nhận sự có mặt của đa hình đơn nucleotide rs7725785 (c.507+53G>T) xuất hiện ở 04 trong số 07 bệnh nhân (T01, T07, T08, T09).
4. Quy trình tin sinh học và các công cụ phần mềm nào được áp dụng để xác định biến thể từ dữ liệu giải trình tự exome?
Quy trình phân tích tin sinh học của luận án bao gồm các bước:
- Kiểm tra chất lượng dữ liệu thô FastQ.
- Gióng hàng trình tự với hệ gen tham chiếu người bằng phần mềm BWA (sử dụng các thuật toán BWA-backtrack, BWA-SW, BWA-MEM).
- Xử lý tệp SAM/BAM, loại bỏ trùng lặp và định chỉ mục bằng Samtools và Picard.
- Phát hiện biến thể đơn nucleotide và indel bằng bộ công cụ GATK (Genome Analysis Toolkit).
- Hiển thị trực quan và đối soát biến thể bằng phần mềm IGV (Integrated Genomics Viewer), kết hợp đối chiếu các cơ sở dữ liệu quốc tế như dbSNP và 1000 Genomes.
5. Phương pháp nào được sử dụng để kiểm chứng lại các biến thể phát hiện từ giải trình tự thế hệ mới?
Tất cả các biến thể quan trọng phát hiện từ kỹ thuật WES trên máy Illumina đều được kiểm chứng độc lập bằng kỹ thuật khuếch đại gen PCR với các cặp mồi oligonucleotide đặc hiệu (nhân các đoạn gen có kích thước từ 0,4 kb đến 1,5 kb) và tiến hành giải trình tự chuỗi tự động theo phương pháp Sanger trên hệ thống máy ABI 3500 Genetic Analyzer sử dụng hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thu Hiền đã ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (WES) kết hợp kiểm chứng bằng giải trình tự Sanger để xác định các biến thể di truyền ở 07 bệnh nhân tự kỷ nặng tại Việt Nam. Công trình đã phát hiện 02 biến thể mới trên gen RYR3, 02 biến thể mới trên gen RYR2, 06 biến thể mới trên gen MUC16 và xác định sự xuất hiện của đa hình rs7725785 trên gen HTR4 ở 04 bệnh nhân. Kết quả nghiên cứu cung cấp dẫn liệu thực nghiệm về cơ sở di truyền học phân tử liên quan đến rối loạn kênh ion canxi và các thụ thể dẫn truyền thần kinh ở bệnh nhân tự kỷ người Việt, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu chức năng chuyên sâu và ứng dụng chẩn đoán di truyền trong tương lai.
