Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô Sugarcane Mosaic Virus (SCMV) tại Chương Mỹ, Đan Phượng, Hà Nội

Chuyên khảo phân tích Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô sugarcane mosaic virus scmv tại vùng chương mỹ đan phượng hà nội, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Trần Thị Thanh Bình
• Người hướng dẫn: GS. Vũ Triệu Mân
• Trường học: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
• Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
• Đề tài: Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV) tại vùng Chương Mỹ, Đan Phượng (Hà Nội) và sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán bệnh
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài
• 1.1.1. Những nghiên cứu ngoài nước
• 1.1.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
• 1.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại ngô trên thế giới
• 1.1.4. Bệnh khảm lùn ngô do virus Sugarcane mosaic virus - SCMV
• 1.1.4.1. Giới thiệu chung về chi Potyvirus
• 1.1.5. Phương pháp chẩn đoán virus
• 1.1.5.1. Phương pháp chẩn đoán virus bằng ELISA
• 1.1.5.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
• 1.1.5.3. Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction)
• 1.1.5.4. Phương pháp hiển vi điện tử
• 1.1.6. Những nghiên cứu bệnh virus hại ngô ở Việt Nam
• 1.1.6.1. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
• 1.1.6.2. Những nghiên cứu về bệnh virus hại ngô
• 1.1.6.3. Phân loại SCMV ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Mẫu giống ngô, cây thí nghiệm và côn trùng môi giới
• 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp xác định virus bằng huyết thanh
• 2.4.2. Phương pháp xác định virus bằng RT-PCR
• 2.4.3. Phương pháp xác định virus bằng phương pháp hiển vi điện tử
• 2.4.4. Phương pháp điều tra ngoài đồng
• 2.4.5. Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm lùn ngô (SCMV) bằng tiếp xúc cơ học
• 2.4.6. Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm lá ngô (SCMV) bằng côn trùng môi giới
• 2.4.7. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của virus khảm lùn cây ngô (SCMV) đến một số chỉ tiêu sinh trưởng phát triển của ngô
• 2.4.8. Phương pháp sản xuất và thử nghiệm kháng huyết thanh virus SCMV
• 2.4.9. Phương pháp tính và xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả xác định nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô
• 3.1.1. Mô tả triệu chứng bệnh virus khảm lùn ngô
• 3.1.2. Kiểm tra một số loại virus gây hại ngô ngoài đồng tại các vùng khác nhau, vụ xuân 2009 - 2010 bằng phương pháp ELISA gián tiếp
• 3.1.3. Kiểm tra virus khảm lùn ngô (SCMV) vụ xuân 2010 - 2011 bằng phương pháp RT-PCR
• 3.1.4. Phương pháp hiển vi điện tử
• 3.1.5. Điều tra bệnh virus khảm lùn ngô ngoài đồng tại Đan Phượng và Chương Mỹ (Hà Nội)
• 3.1.6. Điều tra bệnh khảm lùn ngô ngoài đồng
• 3.1.7. Ảnh hưởng của bệnh đến các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất ngô
• 3.1.8. Ảnh hưởng của bệnh virus tới hàm lượng diệp lục và thành phần hoá sinh hạt ngô
• 3.1.9. Ảnh hưởng của bệnh virus tới các yếu tố liên quan đến năng suất
• 3.2. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm lan truyền của virus SCMV
• 3.2.1. Khả năng lan truyền của virus SCMV bằng phương pháp tiếp xúc cơ học
• 3.2.2. Khả năng lan truyền của virus SCMV bằng côn trùng môi giới (rệp ngô Rhopalosiphum maydis)
• 3.2.3. Khả năng lan truyền của virus SCMV qua tiếp xúc cơ học từ nguồn hạt cây nhiễm bệnh
• 3.2.4. Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh đặc hiệu virus SCMV
• 3.2.4.1. Tinh chiết virus
• 3.2.4.2. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể SCMV trong cơ thể thỏ thí nghiệm sau các tuần tiêm
• 3.2.4.3. Thực hiện điều kiện phản ứng với kháng huyết thanh virus SCMV đã tạo được
• 3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của virus SCMV gây hại trên các bộ phận cây ngô thu thập trong vụ xuân 2011 bằng phương pháp ELISA
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 4.1. Đề nghị
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu virus khảm lùn ngô SCMV tại Hà Nội

Virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV) là một trong những bệnh phổ biến nhất ảnh hưởng đến cây ngô tại Việt Nam, đặc biệt là ở vùng Chương Mỹ và Đan Phượng, Hà Nội. Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu nguyên nhân, triệu chứng và phương pháp chẩn đoán bệnh, từ đó sản xuất kháng huyết thanh để hỗ trợ trong việc phát hiện và phòng ngừa bệnh.

1.1. Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh virus khảm lùn ngô

Bệnh khảm lùn ngô do virus SCMV gây ra các triệu chứng như cây lùn, biến dạng và giảm năng suất. Việc nhận diện sớm triệu chứng là rất quan trọng để có biện pháp xử lý kịp thời.

1.2. Tình hình bệnh virus khảm lùn ngô tại vùng Chương Mỹ Đan Phượng

Tình hình bệnh virus khảm lùn ngô tại Chương Mỹ và Đan Phượng đang gia tăng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất ngô. Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh cao, cần có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

II. Thách thức trong việc chẩn đoán bệnh virus khảm lùn ngô SCMV

Việc chẩn đoán bệnh virus khảm lùn ngô gặp nhiều khó khăn do triệu chứng bệnh có thể nhầm lẫn với các bệnh khác. Điều này đòi hỏi các phương pháp chẩn đoán chính xác và nhanh chóng để bảo vệ cây trồng.

2.1. Những khó khăn trong việc xác định virus SCMV

Các triệu chứng của bệnh virus khảm lùn ngô thường tương tự với các bệnh khác, gây khó khăn trong việc xác định chính xác tác nhân gây bệnh.

2.2. Tác động của virus SCMV đến năng suất ngô

Virus SCMV có thể làm giảm năng suất ngô từ 15-30%, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng và chất lượng ngô, gây thiệt hại lớn cho nông dân.

III. Phương pháp nghiên cứu và sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán bệnh

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại như ELISA và RT-PCR để xác định virus SCMV. Đồng thời, sản xuất kháng huyết thanh nhằm hỗ trợ chẩn đoán nhanh chóng và hiệu quả.

3.1. Phương pháp ELISA trong chẩn đoán virus

Phương pháp ELISA được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của virus SCMV trong mẫu cây ngô, giúp xác định nhanh chóng tình trạng nhiễm bệnh.

3.2. Sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán virus SCMV

Kháng huyết thanh được sản xuất từ thỏ thí nghiệm, giúp phát hiện virus SCMV một cách nhanh chóng và chính xác, hỗ trợ nông dân trong việc phòng ngừa bệnh.

IV. Kết quả nghiên cứu về virus khảm lùn ngô SCMV

Kết quả nghiên cứu cho thấy virus SCMV có khả năng lây lan nhanh chóng và ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất ngô. Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời là rất cần thiết.

4.1. Tỷ lệ nhiễm virus SCMV tại các vùng nghiên cứu

Tỷ lệ nhiễm virus SCMV tại Chương Mỹ và Đan Phượng cho thấy mức độ phổ biến cao, cần có biện pháp can thiệp kịp thời.

4.2. Ảnh hưởng của virus đến năng suất và chất lượng ngô

Virus SCMV làm giảm năng suất và chất lượng ngô, ảnh hưởng đến thu nhập của nông dân và an ninh lương thực.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về virus khảm lùn ngô SCMV

Nghiên cứu về virus khảm lùn ngô SCMV không chỉ giúp xác định nguyên nhân gây bệnh mà còn mở ra hướng đi mới trong việc sản xuất giống ngô kháng bệnh. Tương lai cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

5.1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu virus SCMV

Nghiên cứu virus SCMV có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng và nâng cao năng suất ngô, góp phần đảm bảo an ninh lương thực.

5.2. Hướng đi tương lai trong nghiên cứu và phòng ngừa bệnh

Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các giống ngô kháng bệnh, đồng thời nâng cao nhận thức cho nông dân về phòng ngừa và quản lý bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh virus hại ngô là một trong những nguyên nhân gây suy giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng nông sản tại nhiều vùng trồng ngô trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Cây ngô (Zea mays L.) giữ vị trí là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa nước ở nước ta. Đến năm 2010, diện tích ngô cả nước đạt 1.126,9 nghìn ha với sản lượng 4,6 triệu tấn và năng suất bình quân 4,09 tấn/ha. Tuy nhiên, nguồn cung trong nước vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu sản xuất thức ăn chăn nuôi, hàng năm vẫn phải nhập khẩu lượng ngô trị giá trên 500 triệu USD.

Trong số các bệnh virus hại ngô, bệnh khảm lùn do Sugarcane mosaic virus (SCMV) thuộc chi Potyvirus là bệnh phổ biến nhất trên cây ngô và cây mía ở Việt Nam. Cây bị bệnh có triệu chứng khảm lá rõ rệt, thân lùn thấp biến dạng, bắp teo lép hoặc không thể tạo bắp, làm suy giảm nghiêm trọng năng suất thu hoạch. Trước thời điểm nghiên cứu, các công trình trong nước về bệnh khảm lùn ngô còn ít, chưa xác định đầy đủ các đặc tính sinh học, phân tử của tác nhân gây bệnh, chưa đánh giá hệ thống mức độ phổ biến ngoài đồng và đặc biệt chưa sản xuất được kháng huyết thanh đặc hiệu để phục vụ chẩn đoán nhanh. Xuất phát từ thực tế đó, tác giả Trần Thị Thanh Bình đã thực hiện đề tài luận án tiến sĩ: "Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô (Sugarcane mosaic virus - SCMV) tại vùng Chương Mỹ, Đan Phượng (Hà Nội) và sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán bệnh".

Mục đích và các yêu cầu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể như sau:

• Mục đích nghiên cứu: Tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh, tình hình bệnh và sản xuất kháng huyết thanh phục vụ công tác chẩn đoán nhanh bệnh virus khảm lùn ngô.
• Các yêu cầu nghiên cứu:
  1. Xác định chính xác virus gây bệnh khảm lùn ngô.
  2. Xác định triệu chứng bệnh trên ngô và điều tra mức độ phổ biến của virus gây bệnh trên đồng ruộng.
  3. Nghiên cứu khả năng lan truyền của virus gây bệnh (qua tiếp xúc cơ học, côn trùng môi giới và nguồn hạt).
  4. Sản xuất kháng huyết thanh đặc hiệu phục vụ chẩn đoán bệnh hại.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án:

• Đối tượng nghiên cứu: Bệnh virus khảm lùn ngô tại vùng Chương Mỹ và Đan Phượng (Hà Nội), tác nhân virus SCMV, côn trùng môi giới rệp cờ ngô (Rhopalosiphum maydis), các giống ngô trồng và tập đoàn giống ngô thí nghiệm.
• Phạm vi nghiên cứu: Các thí nghiệm đồng ruộng, điều tra thực địa và phân tích phòng thí nghiệm được tiến hành trong giai đoạn từ năm 2007 đến năm 2011 tại vùng Chương Mỹ, Đan Phượng (Hà Nội), Viện Nghiên cứu Ngô và Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về phân loại virus hại ngô, dịch tễ học và các kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus thực vật. Theo Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV) và các tác giả Van Regenmortel et al. (2000, 2002), trên thế giới đã ghi nhận 12 bệnh virus chính gây hại trên cây ngô:

1. Maize chlorotic dwarf virus (MCDV) thuộc họ Secoviridae (Rorenkranz, 1969; Bradfute et al., 1972; Nault et al., 1973; Gordon & Nault, 1977).
2. Maize chlorotic mottle virus (MCMV) thuộc họ Tombusviridae (Lommel, 1995; Castillo & Hebert, 1974; Niblett & Claflin, 1978; Uyemoto, 1983; Jiang et al., 1992; Delgadillo-Sanchez, 1994).
3. Maize dwarf mosaic virus (MDMV) thuộc họ Potyviridae.
4. Maize mosaic virus (MMV) thuộc họ Rhabdoviridae (Kunkel, 1921; Herold et al., 1960; Lastra, 1976; Sharon et al., 2005).
5. Maize Rayado fino virus (MRFV) thuộc họ Tymoviridae (Ancalmo & Davies, 1961; Gámez et al., 1977; Hammond & Ramirez, 2001; Rosemarie & John Hammond, 2010).
6. Maize Rough dwarf virus (MRDV) thuộc họ Reoviridae.
7. Maize Stem borer virus (MSBV) - nhóm chưa phân chia (Unassigned).
8. Maize Sterile stunt virus (MSSV) thuộc họ Rhabdoviridae.
9. Maize Streak virus (MSV) thuộc họ Geminiviridae (Storey, 1925; Bock et al., 1974; Ruppel, 1965).
10. Maize Strip virus (MStpV) thuộc nhóm virus ssRNA chưa phân loại (Unallocated ssRNA-viruses) (Shepherd, 1929; Storey, 1939; Tsai, 1975).
11. Maize White line mosaic satellite virus (MWlMV) thuộc nhóm Satellite.
12. Maize White line mosaic virus (MWLMV) thuộc họ Tombusviridae.

Đối với bệnh khảm lùn do Sugarcane mosaic virus (SCMV), Janson và Ellett (1963) cùng Williams và Alexander (1965) đã ghi nhận các mô tả ban đầu. Tiếp đó, nhiều tác giả quốc tế đã xác định cấu trúc hình thái của SCMV là các hạt virion dạng sợi mềm kích thước 750 × 13 nm thuộc chi Potyvirus, lây truyền qua các loài rệp muội thuộc họ Aphididae (như Rhopalosiphum maydis, Myzus persicae, Aphis gossypii) theo kiểu không bền vững và có thể truyền cơ giới hoặc truyền qua hạt ở tỷ lệ thấp từ 0,007% đến 0,04% (Shepherd & Holdeman, 1965; Tosic & Sutic, 1977; Mikel et al., 1984; Marie-Jeanne, 2011). Về phân loại phân tử, Chen et al. (2002) chứng minh các dòng virus gây khảm lùn ngô tại miền Bắc Trung Quốc có độ tương đồng nucleotide trên 98% với nhóm Potyvirus trên ngô và là các chủng của SCMV chứ không phải MDMV. Về chẩn đoán huyết thanh học, các nghiên cứu của Gibbs & Harrison (1980), Clark & Adams (1977), Mowat & Dawson (1987), Hull (2002) đã đặt nền tảng cho việc ứng dụng các kỹ thuật ELISA (DAS-ELISA, PTA-ELISA) và sản xuất kháng huyết thanh đa dòng trên thỏ.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Cục Trồng Trọt (2011) và Ngô Hữu Tình và CTV (1997) cho thấy sự phát triển của các giống ngô lai như LVN10, LVN99, LVN4, LVN14... Tuy nhiên, các công trình trước đây về bệnh virus hại ngô trong nước chưa phân lập và mô tả chi tiết hình thái virion dưới kính hiển vi điện tử, chưa kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR để kiểm chứng và chưa chủ động chế tạo được nguồn kháng huyết thanh chuẩn đặc hiệu SCMV để phục vụ công tác giám định diện rộng. Luận án này lựa chọn giải quyết khoảng trống nêu trên bằng cách kết hợp đồng bộ các phương pháp giám định hình thái, sinh học phân tử và huyết thanh học, đồng thời thiết lập quy trình tinh sạch virus và sản xuất thành công kháng huyết thanh chẩn đoán nhanh SCMV trong điều kiện Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên cơ sở phân loại học virus thực vật của họ Potyviridae, cụ thể là chi Potyvirus. Các virus thuộc chi Potyvirus có hạt virion hình sợi mềm, chiều dài 650–950 nm (SCMV dài khoảng 700–760 nm, đường kính 13–14 nm), chứa hệ gen RNA sợi đơn cực dương (ssRNA) chiếm khoảng 5% khối lượng phân tử và vỏ capsid protein (CP) gồm 1700–2000 tiểu phần protein (khối lượng phân tử khoảng 30,7–35,5 kDa) chiếm khoảng 95%. Trong tế bào ký chủ bị nhiễm, Potyvirus hình thành các thể vùi tế bào chất dạng cuộn hình hoa thị (cylindrical inclusion - CI) và thể vùi nhân (NI) có giá trị đặc trưng trong chẩn đoán hình thái học.

Phân loại học họ Potyviridae theo tài liệu của Berger et al. (2005) được tổng hợp trong bảng sau:

STT	Tên chi (Genus)	Loài chuẩn (Type species)	Đặc điểm bộ gen	Vector truyền bệnh chính	Số loài ghi nhận
1	Potyvirus	Potato virus Y (PVY)	Bộ gen đơn	Rệp muội (không bền vững)	197
2	Ipomovirus	Sweet potato mild mottle virus (SPMMV)	Bộ gen đơn	Bọ phấn (không bền vững)	4
3	Macluravirus	Maclura mosaic virus (MacMV)	Bộ gen đơn	Rệp muội (không bền vững)	4
4	Rymovirus	Ryegrass mosaic virus (RGMV)	Bộ gen đơn	Nhện (bền vững tuần hoàn)	3
5	Tritimovirus	Wheat streak mosaic virus (WSMV)	Bộ gen đơn	Nhện (bền vững tuần hoàn)	4
6	Bymovirus	Barley yellow mosaic virus (BaYMV)	Bộ gen kép	Nấm hại rễ	6
Tổng	6 chi	—	—	—	218

Về nguyên lý tạo kháng thể và huyết thanh học (Gibbs & Harrison, 1980), khi đưa kháng nguyên virus tinh khiết vào cơ thể thỏ thí nghiệm, hệ miễn dịch sẽ kích thích sinh kháng thể đặc hiệu (IgM trong tuần đầu, sau đó chuyển dần sang IgG bền vững có độ đặc hiệu cao). Kỹ thuật ELISA gián tiếp (PTA-ELISA) và trực tiếp (DAS-ELISA) cho phép phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể thông qua phản ứng của enzyme alkaline phosphatase (AP) thủy phân cơ chất p-nitrophenyl phosphate tạo tín hiệu đo quang học.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Luận án triển khai hệ thống phương pháp nghiên cứu toàn diện gồm các nội dung:

1. Phương pháp xác định virus bằng huyết thanh học: Sử dụng kỹ thuật ELISA gián tiếp (PTA-ELISA) trên các mẫu lá ngô và ký chủ thu thập ngoài đồng ruộng vụ xuân 2009–2010.
2. Phương pháp sinh học phân tử (RT-PCR): Tách chiết RNA tổng số từ lá ngô, mía và cỏ dại nhiễm bệnh; tổng hợp cDNA bằng enzyme phiên mã ngược; khuếch đại đoạn gen đặc hiệu vỏ capsid protein của SCMV bằng phản ứng chuỗi polymerase qua 20–30 chu kỳ nhiệt (biến tính ở 94–96°C, gắn mồi ở 45–60°C, kéo dài ở 70–72°C); kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose.
3. Phương pháp hiển vi điện tử (TEM): Quan sát hình thái sợi virus tinh khiết và kiểm tra cấu trúc siêu vi thể vùi trong tế bào chất của mô lá ngô, mô lá mía bị bệnh bằng kỹ thuật lát cắt siêu mỏng; đối chứng với mẫu phytoplasma (thu tại Lạng Sơn) và virus lùn sọc đen (thu tại Nghệ An).
4. Phương pháp điều tra dịch tễ đồng ruộng: Điều tra tỷ lệ bệnh (TLB %) và diễn biến phát sinh trên giống ngô LVN-4 tại xã Thủy Xuân Tiên (huyện Chương Mỹ) và xã Đồng Tháp (huyện Đan Phượng) qua các vụ xuân từ 2007 đến 2010; điều tra trên tập đoàn giống ngô trung ngày tại Viện Nghiên cứu Ngô trong các vụ xuân và vụ thu từ 2007 đến 2010; theo dõi biến động mật độ rệp cờ ngô (Rhopalosiphum maydis).
5. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo và xác định đặc điểm lan truyền:
   • Tiếp xúc cơ học: Nghiền mô bệnh trong dung dịch đệm photphat, cọ xát dịch chiết lên bề mặt lá có rắc bột carborundum đối với các cây chỉ thị (Nicotiana tabacum, mía đỏ, Hoàng Tinh, ngô KK 159, LVN 14, cỏ dại...).
   • Côn trùng môi giới: Cho rệp ngô Rhopalosiphum maydis nhịn đói, sau đó cho ăn hút trên cây bệnh trong thời gian ngắn (vài phút đến 1–2 giờ) rồi chuyển sang lây truyền trên cây ngô và cây thuốc lá khỏe.
   • Lây truyền qua nguồn hạt: Gieo hạt thu từ cây ngô bị bệnh và đánh giá tỷ lệ cây con biểu hiện triệu chứng khảm.
6. Phương pháp đánh giá tác hại sinh trưởng, sinh hóa và năng suất: Đo đếm các chỉ tiêu sinh trưởng (chiều cao cây, đường kính thân, số lá); phân tích hàm lượng diệp lục lá và các thành phần hóa sinh hạt ngô (protein, tinh bột, đường khử, lipid) trên giống LVN 10; xác định các yếu tố cấu thành năng suất (chiều dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt/bắp, số hạt/hàng, khối lượng 1000 hạt) và năng suất thực thu trên các giống ngô LVN 10, LVN 14, LVN 99 và KK 159.
7. Phương pháp tinh chiết virus và sản xuất kháng huyết thanh:
   • Tinh chiết SCMV: Đồng nhất mô lá bệnh trong dung dịch đệm Na-citrate 0,05M chứa 0,05% mercaptoethanol, xử lý dịch chiết bằng chloroform (tỷ lệ 1:1 v/v), ly tâm phân đoạn tốc độ thấp để loại bỏ cặn tế bào, kết tủa virus bằng PEG 6000 (4% w/v), ly tâm và siêu ly tâm qua đệm thang nồng độ đường sucrose (10–40%) hoặc dung dịch CsCl.
   • Gây miễn dịch trên thỏ: Tiêm dịch virus SCMV tinh sạch trộn với chất bổ trợ Freund's adjuvant vào thỏ thí nghiệm theo phác đồ định kỳ (tiêm ven tai và tiêm bắp); theo dõi hiệu giá kháng thể hình thành qua các tuần sau tiêm; lấy máu tách huyết thanh.
   • Tối ưu hóa phản ứng và xử lý hấp phụ chéo: Thử nghiệm xác định ngưỡng pha loãng dịch cây và kháng huyết thanh; tiến hành kỹ thuật hấp phụ chéo dịch cây khỏe (có ly tâm và không ly tâm) để loại bỏ kháng thể không đặc hiệu đối với protein thực vật; thử nghiệm trên mẫu mô tươi và mô khô.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 cung cấp bức tranh toàn diện về tình hình sản xuất ngô và các nghiên cứu bệnh virus hại ngô trên phạm vi quốc tế và tại Việt Nam:

• Tình hình sản xuất ngô: Sản lượng ngô thế giới tăng trưởng liên tục từ 204,2 triệu tấn (năm 1961) lên 853,03 triệu tấn (năm 2010), với năng suất tăng từ 2,00 tấn/ha lên 5,24 tấn/ha. Tại Việt Nam, từ thập niên 1980 đến 2010, nhờ chuyển đổi sang các giống ngô lai do Viện Nghiên cứu Ngô chọn tạo (LVN10, LVN99, LVN4, LVN14, VN8960...), năng suất bình quân đã nâng từ 1,1 tấn/ha lên 4,09 tấn/ha.
• Tổng quan 12 bệnh virus ngô trên thế giới: Chương này phân tích chi tiết cơ chế lây truyền, cấu trúc virion, vật chủ và tác hại của các virus nguy hiểm như Maize mosaic virus (MMV, dạng đầu đạn 48 × 242 nm, truyền bởi rầy Peregrinus maidis); Maize streak virus (MSV, dạng hạt đôi 20 × 30 nm, truyền bởi rầy Cicadulina mbila); Maize Rayado fino virus (MRFV, dạng cầu 31,5–33 nm, truyền bởi rầy xanh Dalbulus maydis); Maize chlorotic mottle virus (MCMV, truyền bởi bọ cánh cứng Diabrotica spp., Systena frontalis và bọ trĩ Frankliniella williamsii); và Maize chlorotic dwarf virus (MCDV, dạng cầu 30 nm).
• Đặc điểm sinh học và phân tử của SCMV: SCMV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae. Virion dạng sợi mềm dài 700–760 nm, rộng 13–14 nm. Bộ gen là phân tử ssRNA cực dương kích thước chiếm 5% khối lượng, mã hóa polyprotein cắt thành các protein chức năng (protein vỏ CP, thể vùi hình trụ CI, thể vùi nhân NIa/NIb, protein trợ giúp HC-Pro). Bệnh gây hại làm giảm năng suất ngô từ 20% đến 80% (tại Trung Quốc), giảm 10–20% trên ngô ngọt (tại Pháp), và giảm 3–50% trên cây mía.
• Kỹ thuật chẩn đoán: Luận giải chi tiết cơ chế huyết thanh học của phản ứng kháng nguyên - kháng thể, các dạng kỹ thuật ELISA (DAS-ELISA, PTA-ELISA), nguyên lý phản ứng chuỗi polymerase RT-PCR (các pha biến tính, gắn mồi, kéo dài) và ứng dụng kính hiển vi điện tử trong phát hiện virion và thể vùi tế bào chất.

Chương 2. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả hệ thống vật liệu, thiết bị và quy trình kỹ thuật đã áp dụng:

• Vật liệu và địa điểm: Sử dụng các giống ngô lai thương phẩm (LVN-4, LVN 10, LVN 14, LVN 99, KK 159), tập đoàn giống ngô trung ngày, các loài cây chỉ thị (Nicotiana tabacum, mía đỏ, cây Hoàng Tinh), côn trùng môi giới rệp cờ ngô (Rhopalosiphum maydis), thỏ New Zealand khỏe mạnh để gây miễn dịch. Địa điểm thực hiện gồm các vùng chuyên canh ngô Chương Mỹ, Đan Phượng (Hà Nội), Viện Nghiên cứu Ngô và phòng thí nghiệm Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới (Đại học Nông nghiệp Hà Nội).
• Quy trình phương pháp: Thiết lập chi tiết 8 quy trình thí nghiệm chuẩn hóa:
  1. Giám định ELISA gián tiếp phát hiện SCMV.
  2. Tách chiết RNA và phản ứng RT-PCR nhân bản đoạn gen vỏ capsid protein của SCMV.
  3. Chuẩn bị mẫu hiển vi điện tử (mẫu tinh khiết nhuộm âm bản và mẫu mô cắt lát siêu mỏng).
  4. Phương pháp điều tra dịch tễ đồng ruộng theo các giai đoạn sinh trưởng của cây ngô.
  5. Phương pháp lây truyền cơ học bằng dịch chiết có chất mài mòn carborundum.
  6. Phương pháp lây truyền bằng rệp ngô Rhopalosiphum maydis qua các thời gian ăn hút khác nhau.
  7. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu sinh trưởng, sinh hóa hạt và cấu thành năng suất.
  8. Quy trình tinh sạch virus qua ly tâm phân đoạn, phác đồ tiêm thỏ đa dòng, thu nhận và tinh chế kháng huyết thanh, kết hợp kỹ thuật hấp phụ chéo dịch cây khỏe có ly tâm.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm chi tiết qua 5 nội dung chính:

1. Kết quả xác định nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô

• Triệu chứng bệnh: Cây ngô nhiễm bệnh biểu hiện triệu chứng khảm sọc màu xanh sáng hoặc vàng nhạt chạy dọc theo gân lá; lá non xuất hiện các đốm hoặc vệt khảm rõ rệt; toàn cây bị biến dạng, lóng thân co ngắn lại làm cây lùn thấp; bắp ngô phát triển kém, ngắn, hạt teo lép hoặc không ra bắp.
• Kiểm tra ELISA gián tiếp: Thử nghiệm trên các mẫu lá ngô và cây ký chủ ngoài đồng ruộng vụ xuân 2009–2010 đã xác định phản ứng dương tính mạnh với kháng thể đặc hiệu SCMV.
• Kiểm tra bằng RT-PCR: Phản ứng RT-PCR trên các mẫu ngô, mía và cỏ dại thu thập ngoài đồng vụ xuân 2010–2011 khuếch đại thành công phân đoạn DNA đặc hiệu của gen mã hóa vỏ protein của SCMV.
• Quan sát hiển vi điện tử: Hình ảnh kính hiển vi điện tử khẳng định mẫu virus tinh khiết thu thập tại Chương Mỹ và Đồng Tháp (Đan Phượng) có cấu trúc dạng sợi mềm, kích thước chiều dài 700–760 nm và chiều rộng 13–14 nm. Trong các lát cắt siêu mỏng mô lá ngô và lá mía nhiễm bệnh, quan sát thấy rõ các thể vùi tế bào chất (CI) hình hoa thị đặc trưng cho chi Potyvirus. Đồng thời, phương pháp này đã giúp phân biệt rõ SCMV với tiểu thể phytoplasma (thu thập trên ngô tại Lạng Sơn) và các thể virus lùn sọc đen ngô (thu thập tại Nghệ An).

2. Điều tra bệnh virus khảm lùn ngô ngoài đồng tại Đan Phượng và Chương Mỹ

• Diễn biến bệnh trên giống ngô LVN-4: Điều tra tại xã Thủy Xuân Tiên (Chương Mỹ) và xã Đồng Tháp (Đan Phượng) trong vụ xuân các năm từ 2007 đến 2010 cho thấy bệnh khảm lùn ngô xuất hiện thường xuyên qua các năm. Tỷ lệ bệnh có xu hướng tăng dần từ giai đoạn cây con 3–4 lá đến giai đoạn trỗ cờ đóng bắp và đạt cao nhất ở thời kỳ chín sáp.
• Đánh giá trên bộ giống ngô trung ngày: Theo dõi tập đoàn giống ngô trung ngày tại Viện Nghiên cứu Ngô qua 4 năm (2007, 2008, 2009, 2010) ở cả hai vụ xuân và vụ thu cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về mức độ nhiễm bệnh giữa các giống; tỷ lệ bệnh trong vụ thu thường cao hơn vụ xuân do điều kiện thời tiết thuận lợi cho quần thể côn trùng môi giới phát triển.
• Tương quan với rệp môi giới: Kết quả điều tra vụ xuân 2008 tại Chương Mỹ và Đan Phượng ghi nhận tỷ lệ cây bị rệp cờ ngô (Rhopalosiphum maydis) xâm nhiễm có mối tương quan thuận rõ rệt với tỷ lệ cây biểu hiện triệu chứng bệnh virus khảm lùn trên đồng ruộng.

3. Ảnh hưởng của bệnh đến sinh trưởng, sinh hóa và năng suất ngô

Bệnh khảm lùn SCMV gây tác hại nghiêm trọng đến mọi chỉ tiêu sinh lý và năng suất của cây ngô:

• Chỉ tiêu sinh trưởng: Trên cả 4 giống ngô nghiên cứu (LVN 10, LVN 14, LVN 99, KK 159), cây bị nhiễm virus đều bị suy giảm nghiêm trọng về chiều cao cây, đường kính thân và tổng số lá so với cây khỏe cùng độ tuổi.
• Hàm lượng diệp lục và hóa sinh hạt (trên giống LVN 10): Bệnh làm giảm mạnh hàm lượng diệp lục tổng số trong mô lá. Chất lượng hóa sinh của hạt ngô thu từ cây bệnh bị suy giảm đáng kể: hàm lượng protein tổng số, hàm lượng tinh bột và hàm lượng lipid đều giảm rõ rệt so với hạt từ cây khỏe mạnh.
• Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất: Bệnh làm suy giảm toàn diện các chỉ tiêu năng suất trên các giống ngô LVN 10, LVN 14, LVN 99 và KK 159, bao gồm chiều dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt/bắp, số hạt/hàng và khối lượng 1000 hạt (P1000). Năng suất thực thu của các ruộng ngô bị nhiễm bệnh nặng giảm sâu so với các ruộng sạch bệnh.

4. Đặc điểm lan truyền của virus SCMV

• Lây truyền cơ học: Thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo bằng dịch ép lá bệnh cho thấy SCMV có khả năng lây truyền cơ giới thành công sang các giống ngô thí nghiệm (KK 159, LVN 14), cây mía đỏ, cây Hoàng Tinh và các dòng cây thuốc lá (Nicotiana tabacum N., N.25). Triệu chứng khảm xuất hiện rõ sau 2–3 tuần lây nhiễm.
• Lây truyền qua côn trùng môi giới: Rệp cờ ngô (Rhopalosiphum maydis) truyền thành công virus SCMV từ cây ngô bệnh sang cây ngô khỏe và cây thuốc lá theo phương thức không bền vững; côn trùng có thể tiếp nhận và truyền virus chỉ sau thời gian ăn hút ngắn.
• Lây truyền qua hạt giống: Khảo sát khả năng truyền bệnh qua nguồn hạt thu từ cây mẹ bị nhiễm SCMV xác nhận virus có thể truyền qua hạt với tỷ lệ thấp, tạo nguồn bệnh sơ khởi trên đồng ruộng.

5. Thử nghiệm sản xuất và ứng dụng kháng huyết thanh đặc hiệu SCMV

• Tinh chiết virus: Quy trình tinh sạch kết hợp kết tủa PEG 6000 và ly tâm gradient nồng độ sucrose đã thu được chế phẩm virion SCMV có độ tinh khiết cao, loại bỏ phần lớn protein tạp của cây ký chủ (được kiểm chứng qua ELISA và soi kính hiển vi điện tử).
• Hiệu giá kháng thể trên thỏ: Kiểm tra huyết thanh thỏ sau các tuần tiêm định kỳ cho thấy nồng độ kháng thể đặc hiệu IgG kháng SCMV tăng dần theo thời gian gây miễn dịch và đạt hiệu giá cao sau tuần tiêm thứ 4–6.
• Tối ưu hóa điều kiện phản ứng ELISA:
  • Xác định được ngưỡng pha loãng thích hợp của dịch chiết mẫu cây và độ pha loãng làm việc tối ưu của kháng huyết thanh SCMV đã chế tạo.
  • Thử nghiệm hấp phụ chéo dịch cây khỏe có ly tâm giúp loại bỏ hoàn toàn các phản ứng dương tính giả do kháng thể kháng protein thực vật tự do, nâng cao độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng chẩn đoán.
  • Kháng huyết thanh cho kết quả phản ứng tin cậy trên cả mẫu lá tươi và mẫu mô bảo quản khô.
• Ứng dụng giám định SCMV: Kháng huyết thanh chế tạo đã được ứng dụng thành công để kiểm tra nồng độ virus SCMV trên các bộ phận khác nhau của cây ngô non 3–4 lá, cây ngô giai đoạn trỗ cờ đóng bắp, các giai đoạn phát triển của cây, trên các loài ký chủ phụ (mía, cao lương, cỏ voi), các lứa tuổi của rệp cờ ngô Rhopalosiphum maydis và đánh giá mức độ nhiễm virus trên tập đoàn giống ngô tại Viện Nghiên cứu Ngô năm 2011.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các kết quả khoa học và đóng góp mới nổi bật:

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

1. Cung cấp dẫn liệu khoa học đầy đủ, chính xác và có hệ thống về nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô tại vùng Chương Mỹ và Đan Phượng (Hà Nội) là do Sugarcane mosaic virus (SCMV) thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae.
2. Xác định toàn diện các đặc điểm hình thái học của SCMV phân lập tại Hà Nội dưới kính hiển vi điện tử (hạt virion dạng sợi mềm kích thước 700–760 × 13–14 nm, hình thành thể vùi tế bào chất hình hoa thị đặc trưng), phân biệt với phytoplasma và virus lùn sọc đen ngô.
3. Làm sáng tỏ quy luật dịch tễ học của SCMV trên đồng ruộng qua nhiều năm (2007–2010), xác định phương thức lan truyền cơ giới, truyền qua rệp cờ ngô Rhopalosiphum maydis theo kiểu không bền vững, truyền qua nguồn hạt và phổ ký chủ gồm ngô, mía, cao lương, cỏ voi và một số cây chỉ thị.
4. Định lượng chính xác mức độ thiệt hại của SCMV đối với các chỉ tiêu sinh trưởng, hàm lượng diệp lục, thành phần hóa sinh hạt (protein, tinh bột, lipid) và các yếu tố cấu thành năng suất trên các giống ngô lai chủ lực (LVN 10, LVN 14, LVN 99, KK 159).

Đóng góp về mặt thực tiễn

1. Lần đầu tiên tại Việt Nam đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình tinh sạch virus SCMV và sản xuất được kháng huyết thanh đa dòng đặc hiệu trên thỏ để chẩn đoán nhanh bệnh virus khảm lùn ngô bằng kỹ thuật ELISA.
2. Hoàn thiện kỹ thuật hấp phụ chéo dịch cây khỏe có ly tâm, tạo ra bộ công cụ chẩn đoán huyết thanh học có độ nhạy và độ tin cậy cao, áp dụng hiệu quả cho cả mẫu tươi và mẫu khô.
3. Cung cấp công cụ phục vụ công tác giám định bệnh nhanh, kiểm dịch thực vật, kiểm nghiệm độ sạch bệnh của lô hạt giống ngô và hỗ trợ các nhà chọn giống đánh giá, sàng lọc các dòng/giống ngô kháng bệnh SCMV.

Kiến nghị và đề xuất

• Ứng dụng kháng huyết thanh SCMV đã sản xuất vào công tác kiểm tra, chẩn đoán nhanh bệnh khảm lùn ngô tại các trung tâm sản xuất giống và các vùng trồng ngô tập trung.
• Khuyến cáo sử dụng các giống ngô có mức độ nhiễm bệnh thấp, áp dụng biện pháp phòng trừ rệp cờ ngô Rhopalosiphum maydis kịp thời và tiêu hủy triệt để tàn dư cây bệnh, cỏ dại ký chủ phụ quanh ruộng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của luận án: Phạm vi khảo sát dịch tễ và thu thập mẫu thực địa tập trung chủ yếu tại hai huyện Chương Mỹ và Đan Phượng (Hà Nội); kháng thể sản xuất là kháng huyết thanh đa dòng (polyclonal antibody), do đó quy trình chẩn đoán vẫn đòi hỏi bước hấp phụ chéo dịch cây khỏe để triệt tiêu hoàn toàn nền phản ứng phụ.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng điều tra dịch tễ học phân tử của SCMV tại các vùng sinh thái trồng ngô khác trên cả nước; nghiên cứu giải mã toàn bộ trình tự nucleotide hệ gen của các phân lập SCMV tại Việt Nam; phát triển sản xuất kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) để nâng cao tính ổn định thương mại; và nghiên cứu sâu hơn về các cơ chế phân tử kháng virus (như thụ thể eIF4E) trên các dòng ngô bản địa.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng và tham khảo cao đối với nhiều nhóm đối tượng:

• Giảng viên, nghiên cứu sinh và sinh viên thuộc các chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Nông học, Bệnh cây học và Công nghệ sinh học nông nghiệp: Có thể tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa giám định hình thái siêu vi, sinh học phân tử (RT-PCR) và huyết thanh học (ELISA) trong nghiên cứu virus thực vật.
• Các nhà khoa học tại các Viện nghiên cứu cây trồng (đặc biệt là Viện Nghiên cứu Ngô): Khai thác quy trình tinh sạch virus họ Potyviridae, phác đồ gây miễn dịch trên động vật máu nóng, kỹ thuật xử lý hấp phụ chéo và bộ dẫn liệu đánh giá mức độ kháng/nhiễm SCMV trên các giống ngô lai.
• Cán bộ ngành Kiểm dịch thực vật, Khuyến nông và các đơn vị sản xuất giống cây trồng: Sử dụng các dẫn liệu dịch tễ, triệu chứng nhận biết ngoài đồng và quy trình chẩn đoán huyết thanh để kiểm nghiệm chất lượng hạt giống ngô thương phẩm, phát hiện sớm ổ bệnh và xây dựng quy trình quản lý dịch hại tổng hợp.

Câu hỏi thường gặp

Câu 1: Tác nhân chính gây bệnh khảm lùn ngô tại vùng Chương Mỹ và Đan Phượng (Hà Nội) được xác định là gì và có đặc điểm hình thái như thế nào?
Trả lời: Tác nhân gây bệnh được xác định chính xác là Sugarcane mosaic virus (SCMV), thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae. Dưới kính hiển vi điện tử, virion của SCMV có cấu trúc dạng sợi mềm ngoằn ngoèo, kích thước dài 700–760 nm và rộng 13–14 nm; trong tế bào mô bệnh hình thành các thể vùi tế bào chất (CI) hình hoa thị đặc trưng.

Câu 2: Virus SCMV có thể lây lan trên đồng ruộng thông qua những con đường nào?
Trả lời: Luận án xác định SCMV lây lan qua ba phương thức chính: (1) Lây truyền cơ giới qua cọ xát tiếp xúc dịch ép mô bệnh; (2) Lây truyền qua côn trùng môi giới là rệp cờ ngô (Rhopalosiphum maydis) theo kiểu không bền vững với thời gian tiếp nhận và truyền bệnh ngắn; và (3) Lây truyền qua nguồn hạt thu từ cây mẹ bị nhiễm bệnh tạo tỷ lệ cây con nhiễm bệnh sơ khởi.

Câu 3: Bệnh khảm lùn SCMV gây ảnh hưởng cụ thể như thế nào đến phẩm chất sinh hóa hạt và năng suất ngô?
Trả lời: Bệnh làm suy giảm hàm lượng diệp lục trong lá; trên giống LVN 10, hạt thu từ cây bệnh bị giảm rõ rệt hàm lượng protein tổng số, tinh bột và lipid. Trên các giống LVN 10, LVN 14, LVN 99 và KK 159, bệnh làm giảm chiều dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt, số hạt/hàng, khối lượng 1000 hạt và làm giảm nghiêm trọng năng suất thực thu.

Câu 4: Điểm mấu chốt trong quy trình sản xuất và tối ưu hóa kháng huyết thanh chẩn đoán SCMV của luận án là gì?
Trả lời: Luận án đã tinh sạch virion SCMV từ mô bệnh qua xử lý chloroform, kết tủa PEG 6000 và siêu ly tâm gradient nồng độ đường sucrose, sau đó tiêm định kỳ cho thỏ kết hợp chất bổ trợ Freund's adjuvant. Để khắc phục hiện tượng phản ứng chéo với protein thực vật, luận án đã hoàn thiện kỹ thuật hấp phụ chéo dịch cây khỏe có ly tâm, tạo ra kháng huyết thanh có độ đặc hiệu và độ nhạy cao dùng trong xét nghiệm ELISA.

Câu 5: Luận án đã sử dụng những phương pháp nào để chẩn đoán phân biệt SCMV với các tác nhân gây bệnh lùn khác trên ngô?
Trả lời: Luận án kết hợp đồng thời kỹ thuật ELISA gián tiếp, kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen vỏ protein của SCMV, và soi lát cắt siêu mỏng dưới kính hiển vi điện tử để phân biệt hình thái sợi mềm của SCMV với tiểu thể phytoplasma (ở mẫu ngô thu tại Lạng Sơn) và thể virus lùn sọc đen ngô (ở mẫu thu tại Nghệ An).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Trần Thị Thanh Bình đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu xác định nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô tại Hà Nội là do Sugarcane mosaic virus (SCMV), đồng thời làm rõ đặc điểm hình thái virion, thể vùi tế bào chất, phương thức lan truyền và tác hại sinh lý, hóa sinh, năng suất của bệnh trên các giống ngô lai chủ lực. Công trình đã chế tạo thành công kháng huyết thanh đa dòng đặc hiệu SCMV trên thỏ và chuẩn hóa kỹ thuật ELISA hấp phụ chéo dịch cây khỏe có ly tâm. Kết quả nghiên cứu bổ sung dữ liệu học thuật quan trọng cho danh mục bệnh virus thực vật tại Việt Nam và cung cấp công cụ chẩn đoán nhanh phục vụ kiểm định giống và quản lý bệnh khảm lùn ngô trong thực tiễn sản xuất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cơ sở khoa học của đề tài Bệnh khảm lựn ngụ là bệnh phổ biến trên cây ngô, làm giảm đáng kể đến năng suất, chất lượng ngụ trờn thế giới và ở Việt Nam. Nguyên nhân gây bệnh là virus nên việc chẩn đoán và công tác phòng trừ bệnh gặp nhiều khó khăn. Các triệu chứng cũn gõy nhầm lẫn trong quỏ trỡnh điều tra.

Ở nước ta những nghiên cứu về bệnh khảm lựn ngụ cũn ớt, các nghiên cứu trước đây chưa xác định đầy đủ về nguyên nhân gây bệnh, mức độ và chưa sản xuất được kháng huyết thanh chẩn đoán bệnh. Vì vậy, nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh bằng sử dụng kỹ thuật ELISA, RT-PCR, hiển vi điện tử và thử nghiệm chế tạo kháng huyết thanh để chẩn đoán nhanh bệnh là cần thiết hiện nay. Những nghiên cứu ngoài nước 1. Tình hình sản xuất ngụ trờn thế giới Cây ngô là một trong bốn loại cây lương thực chính của thế giới: Ngô (Zea Mays L.), lúa nước (Oryza sativa L.

Trong đó, ba loại cây gồm ngô, lúa gạo và lúa mì chiếm khoảng 87% sản lượng lương thực toàn cầu và khoảng 43% calori từ tất cả mọi lương thực, thực phẩm. Trong ba loại cây này, ngô là cây trồng có sự tăng trưởng mạnh cả về diện tích, năng suất, sản lượng và là cây có năng suất cao nhất. Vào năm 1961, năng suất ngô trung bình của thế giới chỉ xấp xỉ 2 tấn/ha, thì năm 2010 tăng gấp hơn 2,5 lần (đạt 5,24 tấn/ha), sản lượng đã tăng từ 204 triệu tấn lên 853,03 triệu tấn (gấp 4 lần), diện tích tăng từ 104 triệu lên 159,32 triệu hecta (hơn 1,5 lần). Diện tích, năng suất, sản lượng ngụ trờn thế giới từ năm 1961 - 2010 Diện tích Năng suất Sản lượng Năm (1000 ha) (tấn/ha) (1000 tấn) 1961 104,8 2,00 204,2 2004 145,0 4,90 714,8 2005 145,6 4,80 696,3 2006 148,6 4,70 704,2 2007 157,85 4,97 784,65 2008 161,01 5,10 822,712 2009 156,31 5,17 808,57 2010 159,32 5,24 853,03 Nguồn: FAOSTAST, 2010 Trong sản xuất ngô của thế giới, Hoa Kỳ là nước sản xuất gần 50% tổng sản lượng, còn lại là do các nước khác sản xuất.

Sản lượng ngô xuất khẩu trên thế giới trung bình hàng năm khoảng trên 80 triệu tấn. Trong đó, Hoa Kỳ luôn là nước xuất khẩu chiếm trên 50%. 55 - 60% tổng số và các nước khác chỉ là 40 - 45%. Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại ngụ trờn thế giới Virus hại ngô là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng cho cây ngô, nó thể làm giảm năng suất ngô từ 15 - 30% phụ thuộc vào tuổi cõy lỳc lây nhiễm, điều kiện sinh thái, canh tác, giống ngô (Wilidins, Gordon and Nauled - 1967) [96].

Ở một số nước Châu Phi bệnh virus ngô gây thiệt hại tới 25% năng suất ngô. Ở Trung Quốc bệnh virus ngô gây thiệt hại từ 20 - 80% 6 năng suất ngô. Bệnh gây thoái hóa giống, ảnh hưởng đến phẩm chất, làm giảm giỏ trị thương phẩm của cây ngô (Chen et el, 2002) [30]. Hiện nay trên thế giới theo tổ chức phân loại virus ICTV (International Comittee on Taxonomy of Viruses) và theo Van Regenmortel et al (2000) [92]; Van Regenmortel et al (2002) [93] có 12 bệnh virus hại ngụ đó được phân loại đó là: - Maize chlorotic dwarf virus (MCDV) họ Secoviridae.

- Maize chlorotic mottle virus (MCMV) họ Tombusviridae. - Maize dwarf mosaic virus (MDMV) họ Potyviridae. - Maize mosaic virus (MMV) họ Rhabdoviridae. - Maize Rayado fino virus (MRFV) họ Tymoviridae.

- Maize Rough dwarf virus (MRDV) họ Reoviridae. - Maize Stem borer virus (MSBV) họ Unassigned. - Maize Sterile stunt virus (MSSV) họ Rhabdoviridae. - Maize Streak virus (MSV) họ Geminiviridae.

- Maize Strip virus (MStpV) họ Unallocated ssRNA – viruses. - Maize White line mosaic satellite virus (MWlMV) họ Satellite. - Maize White line mosaic virus (MWLMV) họ Tombusviridae. Trong đó có nhiều bệnh phổ biến ở cỏc vựng trồng ngô thế giới có thể kể một số bệnh virus chính hại cây ngô sau: 1.

Virus gây bệnh khảm lỏ ngụ (Maize mosaic virus). Lịch sử nghiên cứu: Bệnh được Kunkel phát hiện, quan sát và mô tả lần đầu tiên vào năm 1921 và tiếp tục nghiên cứu vào những năm tiếp theo 1921,1922,1927 tại Hawaii (Herold, Benrgold & Weibel, 1960 và Herold, Munz ,1967a) [57]. Virus còn có tên gọi khác là: - Corn mosaic virus (Rev.1: 194) 7 - Corn yellow stripe virus (Rev.2: 33) - Corn stripe virus (Rev.7: 159) - Corn virus 1(Rev.17: 52) - Maize stripe virus (Rev.15: 528) - Mamor zeae (Rev.17: 52) Ngoài ra bệnh được Muller ghi nhận vào năm 1939 ở Venezuela dưới cái tên là: “Raya blanca” (Malaguti, 1963). Năm 1960, Herold, Bergold và Weibel đã quan sát thấy virus trên kính hiển vi điện tử, và bệnh tiếp tục được Herold và Munz nghiên cứu vào năm 1967 (Herold, 1967) [56].

Đến năm 1976, Lastra đã nghiên cứu ký và tìm ra hai chủng của MMV gây bệnh đó là: MMV - RF và MMV - RG và mô tả triệu chứng của chúng, đồng thời bệnh được Malaguti nghiên cứu tiếp về mặt dịch bệnh và những thiệt hại ở Venezuela (Lastra,1976) [41] Ở Ấn Độ, từ những năm 1952 bệnh khảm lỏ ngụ đã được Chona và Seth quan sát thấy trờn cỏc ruộng thí nghiệm của Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ. Đến năm 1962 - 1964, qua quá trình nghiên cứu người ta tìm thấy bệnh ở hầu hết các địa phương trồng ngô của Ấn Độ (Chona và Seth , 1952) 41. Qua một số tài liệu cho thấy rằng bệnh khảm lỏ ngụ cú phân bố địa lý ở: Hawaii (Kunkel, 1921); CuBa (Sahl, 1927); Trinidad (Briten - Jonộ, 1933); Tanzania (Storey, 1933); Puero Rico (Cook, 1936a, 1936b); Mauritius (Orian, 1954); Surinam (Van Hoof, 1960); Venazuena (Herold, 1963); Ấn Độ (Cherian và Kylasam, 1936) và một số nước Đông Nam Á. Bệnh xuất hiện nhiều nhất ở quần đảo Caribờ.

Nguyên nhân gây bệnh: Năm 1976, Lastra nghiên cứu kỹ và phát hiện ra hai chủng của MMV đó là: + MMV - RF gõy cỏc sọc chạy dọc gân lá với mật độ 13 - 15 sọc/cm. 8 + MMV - RG gõy cỏc sọc chạy dọc gân lá với mật độ 1 - 3 sọc/cm. Người ta cũng xác định được hình dạng, kích thước của virus. Virus gây bệnh khảm lỏ ngụ có hình đầu đạn, kích thước biến động 48 x 242 hay 90 x 225 nm (Lastra, 1976) 41.

Nguyên nhân lan truyền: Do một loài rầy trờn ngụ có tên là Peregrinus maidis loài rầy này có từ 5 - 23% là con đực nhưng con đực không truyền được bệnh mà chỉ có con cái truyền bệnh. Virus thuộc nhóm bền vững (Persistant), cụn trựng chích vào lá cây một ngày hay ít hơn có thể truyền bệnh. Trong cơ thể côn trùng thời gian tiềm phục (thời gian ủ bệnh) biến động từ 11 ngày đến 7 tuần lễ (Herold và Munz, 1965) Thời gian tồn tại của virus trong dịch cây dao động từ 24 - 48 giờ ở nhiệt độ 40C. Ngưỡng pha loãng 1/10 trong nồng độ 0,01M phosphate pH = 7,5 Các tác giả cũng xác định được phạm vi ký chủ của virus gồm toàn bộ cây trồng thuộc họ hòa thảo (Gramineae), tuy nhiên người ta tìm thấy virus xuất hiện trên cây ngô một cách tự nhiên và ở một số cây trồng, cây dại khác.

Được công bố qua các kết quả thí nghiệm trờn cõy Euchlena mexicana (Nalaguti, 1963) và Sorghum (Herold). Virus được truyền đi theo đường dịch cây. Virus không truyền qua hạt giống, không truyền qua tiếp xúc cơ học và không truyền qua dây tơ hồng. Thời gian cây mẫn cảm nhất khi lây bệnh vào 4 - 6 tuần sau khi hạt nẩy mầm.

Theo Sharon et al (2005) [79], đã giải trình tự của 102 dòng vô tính từ một thư viện cDNA xây dựng từ RNA virus ngẫu nhiên đã được biên dịch vào 12.133 nucleotide (nt) bao gồm 97 trình tự trung bình chiều dài 660 bp có trình tự đọc bao gồm cả hai sợi. Trình tự còn lại được xuất phát từ duy nhất (5%) hay (2%) đọc trên cùng một sợi. Ba trong sáu ORFs cho thấy điểm tương đồng đáng kể để các chuỗi protein suy luận của các trình tự nucleocapsid, glycoprotein và polymerase rhabdoviruses khác. Trình tự gen 9 dự đoán của bộ gen của MMV là 3 -NP-3-MGL-5 '.

Giải trình tự bộ gen MMV mất khoảng 127 giờ. và chi phí 0,38 đô la (bao gồm cả lao động). Như vậy, kỹ thuật này sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho các trình tự hệ gen rhabdovirus nhiều. Tác hại: Bệnh khảm lỏ ngụ là một trong những bệnh virus gây thiệt hại lớn tới năng suất ở những vùng trồng ngô.

Khi so sánh giữa ruộng có 100% cây nhiễm với ruộng có 100% cây khỏe thì thiệt hại về năng suất lên tới 32% (Raychaudhuri, 1976). Ngoài gây thiệt hại về năng suất, bệnh khảm lỏ ngụ cũn gõy thoái hóa giống, làm giảm phẩm chất nông sản. Phòng trừ: Theo báo cáo của CTAHR tháng 9 năm 2010 [42], khuyến cáo nên thông báo cho cán bộ khuyến nông nắm rõ triệu chứng bệnh, người dân được khuyến khích trồng các giống ngô lai kháng bệnh, khuyến khích chia sẻ thông tin về virus gây bệnh này. Bệnh khảm sọc lỏ ngụ (Maize streak virus) Bệnh được Storey phát hiện và mô tả lần đầu tiên năm 1925 và được xem như là một nhân tố làm giảm năng suất ngô ở Nepan (Storey, 1925).

Từ đó, bệnh được ghi nhận nhiều vùng của Châu Phi cho tới tận Ai Cập (Smith, 1957) và đến năm 1974 Bock, Guthrie và Woods đó xác định nguyên nhân gây bệnh và mô tả chi tiết triệu chứng biểu hiện bệnh 35. Ngoài tên gọi Maize streal virus thì virus gây bệnh còn có tên gọi khác là: Maize treak monogeminivirus (Storey, 1925; Bock et al., 1974) Maize treak virus A (McClean, 1974) Maize mottlevirus (Smith, 1957; Martyn, 1968) Sugarcane streak virus (Storey, 1925) Bệnh phổ biến ở vùng Nam Châu Phi, các nước quanh sa mạc Sahara, Mauritius và đảo Madagascas, Ấn Độ và vùng Đông Nam Á 35. 10 Nguyên nhân gây bệnh: Năm 1974, Bock, Guthrie, Woods đó xác định được hình dạng kích thước của virus. Virus có dạng hình cầu hay trái lựu đạn, kích thước 20 x 30nm (Bock et al, 1974) [27].

Các thí nghiệm cho thấy virus không truyền theo kiểu tiếp xúc cơ giới, không truyền qua hạt giống và cây tơ hồng mà virus truyền bằng 5 loại rầy: Cicadulina mbila, C. Ngoài ra virus này có thể truyền qua trứng rầy (Dabrowski, 1987; Fennah, 1959; Nielson, 1986; Ruppel, 1965;Soto, 1978) 35. Cũng nghiên cứu về bệnh này, Ruppel (1965), Storey, Howland và Prosser (1966) đó xác định được virus truyền từ 15 giây đến 1 giờ, thời gian tiềm ẩn trong côn trùng từ 6 - 12 giờ 35. Theo kết quả nghiờn cứu của tác giả Bock, Guthric cho biết virus gây bệnh khảm sọc lỏ ngụ cú ngưỡng pha loãng là 1/100, nhiệt độ làm mất hoạt tính là 600C (Q10 = 600C) và thời gian tồn tại trong dạng dịch là 24 giờ ở nhiệt độ phòng 35.