Nghiên Cứu Bệnh Phytoplasma Hại Sắn (Manihot esculenta Crantz) Tại Một Số Tỉnh Đông Nam Bộ

Nghiên cứu ảnh hưởng của phytoplasma đến cây sắn Manihot esculenta Crantz tại Đông Nam Bộ, cung cấp thông tin quan trọng cho nông nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Đức Thành
• Người hướng dẫn: PGS. Hà Viết Cường
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Bệnh Do Phytoplasma Hại Sắn Tại Một Số Tỉnh Đông Nam Bộ
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. PHẦN 1: TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.3. Những đóng góp mới của đề tài
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Lược sử nguồn gốc và phân loại cây sắn
• 2.2. Giá trị sử dụng và giá trị dinh dưỡng
• 2.3. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới
• 2.4. Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam
• 2.5. Phytoplasma hại thực vật
• 2.6. Lịch sử phát hiện phytoplasma
• 2.7. Phân loại phytoplasma
• 2.8. Tầm quan trọng của phytoplasma
• 2.9. Đặc điểm hình thái phytoplasma
• 2.10. Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra
• 2.11. Cơ chế gây bệnh của phytoplasma
• 2.12. Sự đa dạng của phytoplasma
• 2.13. Lan truyền của phytoplasma
• 2.14. Phương pháp chẩn đoán phytoplasma
• 2.15. Biện pháp phòng chống
• 2.16. Một số nghiên cứu về bệnh phytoplasma hại sắn
• 2.17. Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật ở Việt Nam
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
• 3.6. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR
• 3.7. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn
• 3.8. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn
• 3.9. Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra
• 3.10. Phương pháp nghiên cứu
• 3.11. Phương pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
• 3.12. Phương pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR
• 3.13. Phương pháp định danh phân tử và phân tích phả hệ
• 3.14. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn
• 3.15. Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra
• 3.16. Phương pháp tính và xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Mô tả triệu chứng và điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
• 4.2. Mô tả triệu chứng bệnh
• 4.3. Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
• 4.4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR
• 4.5. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử
• 4.6. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô
• 4.7. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR
• 4.8. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn
• 4.9. Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR
• 4.10. Kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP
• 4.11. Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide
• 4.12. Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide
• 4.13. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn
• 4.14. Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII
• 4.15. Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP
• 4.16. Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra
• 4.17. Ảnh hưởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh
• 4.18. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép cây
• 4.19. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng
• 4.20. Khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn qua một số loài côn trùng
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 5.1. Kiến nghị
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Bệnh Phytoplasma Sắn Tại Đông Nam Bộ

Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây trồng quan trọng tại Đông Nam Bộ, mang lại thu nhập và góp phần ổn định kinh tế - xã hội. Cây sắn cung cấp lương thực, nguyên liệu cho công nghiệp chế biến, xuất khẩu và năng lượng sinh học. Tuy nhiên, những năm gần đây, bệnh Phytoplasma sắn, đặc biệt là bệnh chổi rồng (bệnh chổi phù thuỷ), gây thiệt hại đáng kể. Bệnh làm giảm năng suất củ từ 10-30% và giảm hàm lượng tinh bột 20-30% (Nguyên Khê, 2011). Việc quản lý bệnh còn gặp nhiều khó khăn do chưa xác định chính xác tác nhân gây bệnh, dẫn đến các biện pháp phòng trừ chưa hiệu quả. Bệnh Phytoplasma gây hại cho sắn đã được ghi nhận ở nhiều nơi trên thế giới, gây ra các bệnh như vàng lá, chổi phù thủy và da cóc. Nghiên cứu về bệnh này là vô cùng cấp thiết để bảo vệ ngành trồng sắn.

1.1. Tầm Quan Trọng Kinh Tế Của Cây Sắn Tại Đông Nam Bộ

Cây sắn đóng vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp của Đông Nam Bộ, là nguồn thu nhập chính của nhiều hộ gia đình. Sắn cung cấp nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chế biến, xuất khẩu, góp phần tăng trưởng kinh tế địa phương. Việc bảo vệ cây sắn khỏi các bệnh hại, đặc biệt là bệnh Phytoplasma, có ý nghĩa to lớn trong việc duy trì và phát triển kinh tế khu vực. Cần đầu tư nghiên cứu về bệnh sắn để có các giải pháp quản lý hiệu quả.

1.2. Sự Xuất Hiện Và Lây Lan Của Bệnh Chổi Rồng Sắn

Bệnh chổi rồng sắn, hay còn gọi là bệnh chổi phù thủy, do Phytoplasma gây ra, đã xuất hiện và lây lan nhanh chóng tại nhiều vùng trồng sắn ở Đông Nam Bộ từ năm 2005, đặc biệt là trên giống KM94. Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng củ, đe dọa sinh kế của người trồng sắn. Theo nghiên cứu, tỷ lệ bệnh có thể lên đến 85% ở một số vùng, gây thất thu lớn cho người nông dân.

II. Bệnh Phytoplasma Hại Sắn Thách Thức Lớn Cho Nông Nghiệp

Bệnh Phytoplasma hại sắn là một thách thức lớn đối với nông nghiệp Đông Nam Bộ. Do tác nhân gây bệnh chưa được xác định rõ ràng, việc phòng trừ gặp nhiều khó khăn. Các biện pháp truyền thống như sử dụng thuốc trừ nấm không mang lại hiệu quả. Theo tác giả Nguyễn Đức Thành, bệnh lây lan chủ yếu qua hom giống, đòi hỏi cần có biện pháp quản lý và kiểm soát chặt chẽ nguồn giống. Bệnh chổi rồng làm giảm đáng kể năng suất và chất lượng sắn, ảnh hưởng trực tiếp đến thu nhập của người nông dân. Cần có những nghiên cứu sâu rộng hơn về đặc điểm sinh học của Phytoplasma sắn và các biện pháp phòng trừ hiệu quả.

2.1. Những Khó Khăn Trong Xác Định Tác Nhân Gây Bệnh Phytoplasma Sắn

Việc xác định chính xác tác nhân gây bệnh Phytoplasma sắn là một thách thức lớn do Phytoplasma không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo. Điều này gây khó khăn cho việc nghiên cứu đặc điểm sinh học và phát triển các biện pháp phòng trừ đặc hiệu. Các phương pháp chẩn đoán phân tử, như PCR, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và phân loại Phytoplasma gây bệnh trên sắn.

2.2. Ảnh Hưởng Của Bệnh Chổi Rồng Đến Năng Suất Và Chất Lượng Sắn

Bệnh chổi rồng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sắn. Cây bị bệnh thường còi cọc, sinh trưởng kém, số lượng củ ít và kích thước nhỏ. Hàm lượng tinh bột trong củ cũng giảm đáng kể, làm giảm giá trị thương phẩm của sắn. Theo thống kê, năng suất có thể giảm đến 70% ở những vùng bị bệnh nặng, gây thiệt hại lớn cho người nông dân.

2.3. Sự Lúng Túng Trong Các Biện Pháp Phòng Trừ Hiện Tại

Do chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh, các biện pháp phòng trừ hiện tại thường mang tính chất thử nghiệm và không mang lại hiệu quả cao. Việc sử dụng thuốc trừ nấm, thuốc trừ sâu thường không có tác dụng đối với bệnh Phytoplasma. Các biện pháp canh tác truyền thống cũng không đủ để ngăn chặn sự lây lan của bệnh. Do đó, cần có những nghiên cứu chuyên sâu hơn để tìm ra các giải pháp phòng trừ hiệu quả.

III. Phương Pháp Phát Hiện và Phân Loại Phytoplasma Hại Sắn

Nghiên cứu về bệnh Phytoplasma hại sắn cần các phương pháp phát hiện và phân loại chính xác. Kính hiển vi điện tử, nhuộm mô DAPI và kỹ thuật PCR là những công cụ quan trọng. Kính hiển vi điện tử giúp quan sát trực tiếp Phytoplasma trong tế bào. Nhuộm mô DAPI giúp phát hiện Phytoplasma dựa trên đặc tính gắn kết với DNA. PCR khuếch đại đoạn DNA đặc trưng của Phytoplasma, giúp xác định và phân loại chúng. Việc kết hợp các phương pháp này giúp chẩn đoán bệnh chính xác và hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của Phytoplasma sắn.

3.1. Kính Hiển Vi Điện Tử Quan Sát Trực Tiếp Phytoplasma

Kính hiển vi điện tử là công cụ hữu hiệu để quan sát trực tiếp hình thái và kích thước của Phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch phloem. Hình ảnh từ kính hiển vi điện tử cung cấp bằng chứng trực quan về sự hiện diện của Phytoplasma trong mô cây bị bệnh. Phương pháp này giúp xác định Phytoplasma ở cấp độ tế bào.

3.2. Nhuộm Mô DAPI Phát Hiện Phytoplasma Dựa Trên DNA

Nhuộm mô DAPI là phương pháp phát hiện Phytoplasma dựa trên đặc tính gắn kết của DAPI với DNA. Khi nhuộm mô cây bị bệnh bằng DAPI, Phytoplasma sẽ phát sáng dưới kính hiển vi huỳnh quang, giúp xác định sự hiện diện của chúng. Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả để sàng lọc mẫu.

3.3. Kỹ Thuật PCR Chẩn Đoán Phân Tử Chính Xác Phytoplasma Sắn

Kỹ thuật PCR (Phản ứng chuỗi trùng hợp) là phương pháp chẩn đoán phân tử chính xác để xác định và phân loại Phytoplasma gây bệnh trên sắn. PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn DNA đặc trưng của Phytoplasma. Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose. PCR là công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu bệnh Phytoplasma sắn.

IV. Ứng Dụng LAMP PCR Chẩn Đoán Nhanh Bệnh Phytoplasma Sắn

LAMP-PCR (Loop-mediated isothermal amplification PCR) là kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt, hứa hẹn cho việc chẩn đoán nhanh bệnh Phytoplasma sắn. Phương pháp này có ưu điểm là thực hiện ở nhiệt độ không đổi, không cần thiết bị phức tạp như PCR truyền thống. LAMP-PCR có độ nhạy cao, cho phép phát hiện Phytoplasma ở nồng độ thấp. Nghiên cứu đã thiết kế và thử nghiệm thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu cho Phytoplasma nhóm 16SrII, giúp chẩn đoán bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ một cách nhanh chóng và hiệu quả.

4.1. Ưu Điểm Của Kỹ Thuật LAMP PCR So Với PCR Truyền Thống

LAMP-PCR có nhiều ưu điểm so với PCR truyền thống, bao gồm: thực hiện ở nhiệt độ không đổi, không cần thiết bị phức tạp, độ nhạy cao, thời gian phản ứng ngắn và dễ dàng thực hiện tại hiện trường. LAMP-PCR là công cụ chẩn đoán tiềm năng cho bệnh Phytoplasma sắn.

4.2. Thiết Kế Mồi LAMP PCR Đặc Hiệu Cho Phytoplasma Nhóm 16SrII

Nghiên cứu đã thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu cho Phytoplasma nhóm 16SrII, nhóm Phytoplasma phổ biến gây bệnh trên sắn tại Đông Nam Bộ. Bộ mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen 16S rRNA của Phytoplasma, đảm bảo tính đặc hiệu và độ nhạy cao.

4.3. Đánh Giá Hiệu Quả Của LAMP PCR Trong Chẩn Đoán Bệnh Chổi Rồng Sắn

Kết quả nghiên cứu cho thấy LAMP-PCR có hiệu quả cao trong chẩn đoán bệnh chổi rồng sắn do Phytoplasma nhóm 16SrII gây ra. LAMP-PCR có thể phát hiện Phytoplasma trong các mẫu sắn khác nhau, bao gồm lá, thân và củ, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. LAMP-PCR là công cụ chẩn đoán hữu ích cho việc quản lý bệnh Phytoplasma sắn.

V. Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học và Lan Truyền Bệnh Chổi Rồng Sắn

Nghiên cứu về đặc điểm sinh học và lan truyền của bệnh chổi rồng sắn là rất quan trọng để xây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả. Bệnh lan truyền chủ yếu qua hom giống bị nhiễm bệnh. Môi trường đất và các loài côn trùng cũng có thể đóng vai trò trong sự lan truyền của bệnh. Theo nghiên cứu, bệnh lan truyền qua việc sử dụng hom giống đã bị nhiễm bệnh là con đường chính. Cần có các biện pháp kiểm soát chặt chẽ nguồn giống và quản lý côn trùng môi giới để hạn chế sự lây lan của bệnh chổi rồng sắn.

5.1. Vai Trò Của Hom Giống Bị Nhiễm Bệnh Trong Lan Truyền Phytoplasma Sắn

Hom giống bị nhiễm Phytoplasma là con đường lan truyền chính của bệnh chổi rồng sắn. Việc sử dụng hom giống từ cây bị bệnh sẽ dẫn đến sự lây lan của bệnh sang các vụ trồng tiếp theo. Cần có các biện pháp kiểm soát và chọn lọc hom giống khỏe mạnh để hạn chế sự lây lan của bệnh.

5.2. Ảnh Hưởng Của Đất Trồng Đến Khả Năng Lan Truyền Bệnh Chổi Rồng

Đất trồng có thể ảnh hưởng đến khả năng lan truyền của bệnh chổi rồng. Một số loại đất có thể tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của Phytoplasma hoặc các loài côn trùng môi giới. Cần có các biện pháp cải tạo đất và quản lý dinh dưỡng hợp lý để hạn chế sự lây lan của bệnh.

5.3. Vai Trò Của Côn Trùng Trong Việc Truyền Bệnh Phytoplasma Sắn

Một số loài côn trùng, đặc biệt là rầy, có thể đóng vai trò trong việc truyền bệnh Phytoplasma sắn. Các loài rầy này hút nhựa cây bị bệnh và truyền Phytoplasma sang các cây khỏe mạnh. Cần có các biện pháp quản lý côn trùng môi giới để hạn chế sự lây lan của bệnh.

VI. Kết Luận Kiến Nghị Hướng Nghiên Cứu và Giải Pháp Quản Lý

Nghiên cứu về bệnh Phytoplasma hại sắn tại Đông Nam Bộ đã xác định được ít nhất hai nhóm Phytoplasma, 16SrI và 16SrII. Kỹ thuật LAMP-PCR đã được phát triển để chẩn đoán nhanh bệnh. Bệnh lan truyền chủ yếu qua hom giống. Cần tăng cường nghiên cứu về các biện pháp phòng trừ sinh học và quản lý côn trùng môi giới. Việc chọn giống kháng bệnh và kiểm soát chặt chẽ nguồn giống là yếu tố quan trọng trong quản lý bệnh Phytoplasma sắn.

6.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Chính Về Bệnh Phytoplasma Sắn

Nghiên cứu đã xác định được hai nhóm Phytoplasma gây bệnh trên sắn tại Đông Nam Bộ, phát triển kỹ thuật chẩn đoán nhanh LAMP-PCR và xác định vai trò của hom giống trong sự lan truyền của bệnh. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các biện pháp quản lý bệnh hiệu quả.

6.2. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Bệnh Phytoplasma Sắn

Cần tiếp tục nghiên cứu về các biện pháp phòng trừ sinh học, quản lý côn trùng môi giới và chọn giống kháng bệnh. Nghiên cứu về sự tương tác giữa Phytoplasma và cây sắn cũng rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh. Phân tích gen của Phytoplasma sắn sẽ giúp xác định nguồn gốc và sự tiến hóa của chúng.

6.3. Kiến Nghị Các Giải Pháp Quản Lý Bệnh Chổi Rồng Sắn Hiệu Quả

Cần có các biện pháp kiểm soát chặt chẽ nguồn giống, khuyến khích sử dụng hom giống khỏe mạnh, áp dụng các biện pháp canh tác tiên tiến và quản lý côn trùng môi giới. Việc phối hợp các biện pháp phòng trừ tổng hợp sẽ mang lại hiệu quả cao nhất trong việc quản lý bệnh chổi rồng sắn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP, NĂM 2016 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Mã số: 62 62 01 12 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. HÀ VIẾT CƢỜNG 2. TRỊNH XUÂN HOẠT HÀ NỘI, NĂM 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành i LỜI CẢM ƠN Luận án có sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh chổi rồng và bệnh thán thƣ hại sắn” do Bộ Nông nghiệp và PTNT cấp kinh phí thực hiện cho TS. Trịnh Xuân Hoạt làm chủ nhiệm đề tài và đã đƣợc cho phép sử dụng trong luận án. Để hoàn thành bản luận án này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy, quý cô và ngƣời thân. Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.

Hà Viết Cƣờng và TS. Trịnh Xuân Hoạt đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ Viện Bảo vệ thực vật, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học đã nhiệt tình trao đổi, góp ý cho các vấn đề, giải pháp, trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ kỹ thuật và bà con nông dân tại nhiều nơi đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời tri ân tới tất cả ngƣời thân trong gia đình, những ngƣời luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN 1.

Tính cấp thiết của đề tài 1 1. Mục tiêu của đề tài 2 1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2 1. Những đóng góp mới của đề tài 3 1.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2. Lƣợc sử nguồn gốc và phân loại cây sắn 5 2. Giá trị sử dụng và giá trị dinh dƣỡng 5 2.

Tình hình sản xuất sắn trên thế giới 5 2. Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam 6 2. Phytoplasma hại thực vật 7 2. Lịch sử phát hiện phytoplasma 7 2.

Phân loại phytoplasma 7 2. Tầm quan trọng của phytoplasma 12 2. Đặc điểm hình thái phytoplasma 13 2. Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra 14 2.

Cơ chế gây bệnh của phytoplasma 14 2. Sự đa dạng của phytoplasma 15 2. Lan truyền của phytoplasma 16 2. Phƣơng pháp chẩn đoán phytoplasma 20 iii 2.

Biện pháp phòng chống 26 2. Một số nghiên cứu về bệnh phytoplasma hại sắn 27 2. Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật ở Việt Nam 32 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 3.

Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 36 3. Vật liệu nghiên cứu 36 3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37 3. Nội dung nghiên cứu 37 3.

Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 37 3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 37 3. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 38 3. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 38 3.

Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra 38 3. Phƣơng pháp nghiên cứu 39 3. Phƣơng pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 39 3. Phƣơng pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 40 3.

Phƣơng pháp định danh phân tử và phân tích phả hệ 44 3. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 46 3. Phƣơng pháp xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra 47 3. Phƣơng pháp tính và xử lý số liệu 49 PHẦN 4.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51 4. Mô tả triệu chứng và điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 51 4. Mô tả triệu chứng bệnh 51 4. Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 53 4.

Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 54 4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử 54 iv 4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô 57 4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR 59 4.

Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 65 4. Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR 65 4. Kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP 75 4. Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide 84 4.

Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide 86 4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 96 4. Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 96 4. Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP 101 4.

Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra 104 4. Ảnh hƣởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh 104 4. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép cây 108 4. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 109 4.

Khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn qua một số loài côn trùng 112 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 120 5. Kiến nghị 121 Danh mục các công trình công bố 122 Tài liệu tham khảo 123 Phụ lục 141 v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Diễn giải ký hiệu, nghĩa tiếng Việt/tiếng Anh chữ viết tắt cs. Cộng sự CT Công thức µl Microliter A.

laidlawii Acholeplasma laidlawii BIP Backward internal primer (Mồi ngƣợc dòng bên trong) BLAST Basic local alignment search tool (Công cụ tìm kiếm chuỗi tƣơng đồng cơ bản cục bộ) bp Base pair (Cặp bazơ) Ca. Phytoplasma Candidatus Phytoplasma CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DAPI 4‟,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DNA Deoxy nucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtOH Ethanol FAO Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp và Lƣơng thực của Liên hiệp Quốc) FIP Forward internal primer (Mồi xuôi dòng bên trong) IRPCM International research project for comparative mycoplasmology (Dự án Nghiên cứu Quốc tế về Mycoplasma) kb Kilo base LAMP-PCR Loop mediated isothermal amplification - PCR (Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt) M. esculenta Manihot esculenta ml Mililiter nm Nanometer nts Nucleotides PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) vi RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình chiều dài của đoạn cắt giới hạn) rRNA ribosomal ribonucleic acid TAE Tris-acetate acid EDTA TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) UPGMA Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng) vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2. Phân loại phytoplasma dựa trên phân tích gen 16S RNA ribosome 8 2.

Thành phần các nhóm côn trùng bộ Hemiptera là môi giới truyền phytoplasma 17 2. Một số mồi PCR phát hiện phytoplasma đã đƣợc công bố 23 2. Danh sách các nhóm phytoplasma hại sắn đã đƣợc xác định dựa vào phân tích phân tử 32 3. Các cặp mồi đƣợc sử dụng để phát hiện phytoplasma trên cây sắn 42 4.

Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại các điểm điều tra ở một số tỉnh (năm 2011) 53 4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử 55 4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm DAPI (năm 2014) 57 4. Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7- R16F2n/R16R2 60 4.

Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7 - R16mF2/R16mR1 63 4. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 66 4. Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc của sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 67 4. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 70 4.

Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc của sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 71 4. Danh sách các mẫu phytoplasma hại sắn đã đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen 74 4. Danh sách các mẫu dùng trong phân tích RFLP mô phỏng 77 4. Mức tƣơng đồng di truyền dựa trên mô hình cắt RFLP mô phỏng vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn 83 4.

So sánh mức đồng nhất trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn 85 viii 4. Đại diện 28 nhóm phytoplasma dùng trong phân tích phả hệ 86 4. Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrI dùng trong phân tích phả hệ 89 4. Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrII dùng trong phân tích phả hệ 92 4.

Các nhóm/nhóm phụ 16S RNA ribosome của phytoplasma hại sắn tại Việt Nam 94 4. Đặc điểm 8 trình tự phù hợp trên gen mã hóa 16S RNA ribosome để thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 99 4. Trình tự các mồi LAMP cải tiến đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 100 4. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số chiết từ cây 101 4.

Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR tinh sạch 102 4. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn khác nhau bị bệnh chổi phù thuỷ 103 4.