Nghiên Cứu Bệnh Phytoplasma Hại Sắn (Manihot esculenta Crantz) Tại Một Số Tỉnh Đông Nam Bộ

Nghiên cứu ảnh hưởng của phytoplasma đến cây sắn Manihot esculenta Crantz tại Đông Nam Bộ, cung cấp thông tin quan trọng cho nông nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Đức Thành
• Người hướng dẫn: PGS. Hà Viết Cường
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Bệnh Do Phytoplasma Hại Sắn Tại Một Số Tỉnh Đông Nam Bộ
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. PHẦN 1: TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.3. Những đóng góp mới của đề tài
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Lược sử nguồn gốc và phân loại cây sắn
• 2.2. Giá trị sử dụng và giá trị dinh dưỡng
• 2.3. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới
• 2.4. Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam
• 2.5. Phytoplasma hại thực vật
• 2.6. Lịch sử phát hiện phytoplasma
• 2.7. Phân loại phytoplasma
• 2.8. Tầm quan trọng của phytoplasma
• 2.9. Đặc điểm hình thái phytoplasma
• 2.10. Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra
• 2.11. Cơ chế gây bệnh của phytoplasma
• 2.12. Sự đa dạng của phytoplasma
• 2.13. Lan truyền của phytoplasma
• 2.14. Phương pháp chẩn đoán phytoplasma
• 2.15. Biện pháp phòng chống
• 2.16. Một số nghiên cứu về bệnh phytoplasma hại sắn
• 2.17. Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật ở Việt Nam
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
• 3.6. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR
• 3.7. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn
• 3.8. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn
• 3.9. Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra
• 3.10. Phương pháp nghiên cứu
• 3.11. Phương pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
• 3.12. Phương pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR
• 3.13. Phương pháp định danh phân tử và phân tích phả hệ
• 3.14. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn
• 3.15. Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra
• 3.16. Phương pháp tính và xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Mô tả triệu chứng và điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
• 4.2. Mô tả triệu chứng bệnh
• 4.3. Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
• 4.4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR
• 4.5. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử
• 4.6. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô
• 4.7. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR
• 4.8. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn
• 4.9. Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR
• 4.10. Kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP
• 4.11. Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide
• 4.12. Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide
• 4.13. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn
• 4.14. Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII
• 4.15. Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP
• 4.16. Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra
• 4.17. Ảnh hưởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh
• 4.18. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép cây
• 4.19. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng
• 4.20. Khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn qua một số loài côn trùng
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 5.1. Kiến nghị
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Bệnh Phytoplasma Sắn Tại Đông Nam Bộ

Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây trồng quan trọng tại Đông Nam Bộ, mang lại thu nhập và góp phần ổn định kinh tế - xã hội. Cây sắn cung cấp lương thực, nguyên liệu cho công nghiệp chế biến, xuất khẩu và năng lượng sinh học. Tuy nhiên, những năm gần đây, bệnh Phytoplasma sắn, đặc biệt là bệnh chổi rồng (bệnh chổi phù thuỷ), gây thiệt hại đáng kể. Bệnh làm giảm năng suất củ từ 10-30% và giảm hàm lượng tinh bột 20-30% (Nguyên Khê, 2011). Việc quản lý bệnh còn gặp nhiều khó khăn do chưa xác định chính xác tác nhân gây bệnh, dẫn đến các biện pháp phòng trừ chưa hiệu quả. Bệnh Phytoplasma gây hại cho sắn đã được ghi nhận ở nhiều nơi trên thế giới, gây ra các bệnh như vàng lá, chổi phù thủy và da cóc. Nghiên cứu về bệnh này là vô cùng cấp thiết để bảo vệ ngành trồng sắn.

1.1. Tầm Quan Trọng Kinh Tế Của Cây Sắn Tại Đông Nam Bộ

Cây sắn đóng vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp của Đông Nam Bộ, là nguồn thu nhập chính của nhiều hộ gia đình. Sắn cung cấp nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chế biến, xuất khẩu, góp phần tăng trưởng kinh tế địa phương. Việc bảo vệ cây sắn khỏi các bệnh hại, đặc biệt là bệnh Phytoplasma, có ý nghĩa to lớn trong việc duy trì và phát triển kinh tế khu vực. Cần đầu tư nghiên cứu về bệnh sắn để có các giải pháp quản lý hiệu quả.

1.2. Sự Xuất Hiện Và Lây Lan Của Bệnh Chổi Rồng Sắn

Bệnh chổi rồng sắn, hay còn gọi là bệnh chổi phù thủy, do Phytoplasma gây ra, đã xuất hiện và lây lan nhanh chóng tại nhiều vùng trồng sắn ở Đông Nam Bộ từ năm 2005, đặc biệt là trên giống KM94. Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng củ, đe dọa sinh kế của người trồng sắn. Theo nghiên cứu, tỷ lệ bệnh có thể lên đến 85% ở một số vùng, gây thất thu lớn cho người nông dân.

II. Bệnh Phytoplasma Hại Sắn Thách Thức Lớn Cho Nông Nghiệp

Bệnh Phytoplasma hại sắn là một thách thức lớn đối với nông nghiệp Đông Nam Bộ. Do tác nhân gây bệnh chưa được xác định rõ ràng, việc phòng trừ gặp nhiều khó khăn. Các biện pháp truyền thống như sử dụng thuốc trừ nấm không mang lại hiệu quả. Theo tác giả Nguyễn Đức Thành, bệnh lây lan chủ yếu qua hom giống, đòi hỏi cần có biện pháp quản lý và kiểm soát chặt chẽ nguồn giống. Bệnh chổi rồng làm giảm đáng kể năng suất và chất lượng sắn, ảnh hưởng trực tiếp đến thu nhập của người nông dân. Cần có những nghiên cứu sâu rộng hơn về đặc điểm sinh học của Phytoplasma sắn và các biện pháp phòng trừ hiệu quả.

2.1. Những Khó Khăn Trong Xác Định Tác Nhân Gây Bệnh Phytoplasma Sắn

Việc xác định chính xác tác nhân gây bệnh Phytoplasma sắn là một thách thức lớn do Phytoplasma không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo. Điều này gây khó khăn cho việc nghiên cứu đặc điểm sinh học và phát triển các biện pháp phòng trừ đặc hiệu. Các phương pháp chẩn đoán phân tử, như PCR, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và phân loại Phytoplasma gây bệnh trên sắn.

2.2. Ảnh Hưởng Của Bệnh Chổi Rồng Đến Năng Suất Và Chất Lượng Sắn

Bệnh chổi rồng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sắn. Cây bị bệnh thường còi cọc, sinh trưởng kém, số lượng củ ít và kích thước nhỏ. Hàm lượng tinh bột trong củ cũng giảm đáng kể, làm giảm giá trị thương phẩm của sắn. Theo thống kê, năng suất có thể giảm đến 70% ở những vùng bị bệnh nặng, gây thiệt hại lớn cho người nông dân.

2.3. Sự Lúng Túng Trong Các Biện Pháp Phòng Trừ Hiện Tại

Do chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh, các biện pháp phòng trừ hiện tại thường mang tính chất thử nghiệm và không mang lại hiệu quả cao. Việc sử dụng thuốc trừ nấm, thuốc trừ sâu thường không có tác dụng đối với bệnh Phytoplasma. Các biện pháp canh tác truyền thống cũng không đủ để ngăn chặn sự lây lan của bệnh. Do đó, cần có những nghiên cứu chuyên sâu hơn để tìm ra các giải pháp phòng trừ hiệu quả.

III. Phương Pháp Phát Hiện và Phân Loại Phytoplasma Hại Sắn

Nghiên cứu về bệnh Phytoplasma hại sắn cần các phương pháp phát hiện và phân loại chính xác. Kính hiển vi điện tử, nhuộm mô DAPI và kỹ thuật PCR là những công cụ quan trọng. Kính hiển vi điện tử giúp quan sát trực tiếp Phytoplasma trong tế bào. Nhuộm mô DAPI giúp phát hiện Phytoplasma dựa trên đặc tính gắn kết với DNA. PCR khuếch đại đoạn DNA đặc trưng của Phytoplasma, giúp xác định và phân loại chúng. Việc kết hợp các phương pháp này giúp chẩn đoán bệnh chính xác và hiểu rõ hơn về sự đa dạng di truyền của Phytoplasma sắn.

3.1. Kính Hiển Vi Điện Tử Quan Sát Trực Tiếp Phytoplasma

Kính hiển vi điện tử là công cụ hữu hiệu để quan sát trực tiếp hình thái và kích thước của Phytoplasma trong tế bào ống rây của mạch phloem. Hình ảnh từ kính hiển vi điện tử cung cấp bằng chứng trực quan về sự hiện diện của Phytoplasma trong mô cây bị bệnh. Phương pháp này giúp xác định Phytoplasma ở cấp độ tế bào.

3.2. Nhuộm Mô DAPI Phát Hiện Phytoplasma Dựa Trên DNA

Nhuộm mô DAPI là phương pháp phát hiện Phytoplasma dựa trên đặc tính gắn kết của DAPI với DNA. Khi nhuộm mô cây bị bệnh bằng DAPI, Phytoplasma sẽ phát sáng dưới kính hiển vi huỳnh quang, giúp xác định sự hiện diện của chúng. Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả để sàng lọc mẫu.

3.3. Kỹ Thuật PCR Chẩn Đoán Phân Tử Chính Xác Phytoplasma Sắn

Kỹ thuật PCR (Phản ứng chuỗi trùng hợp) là phương pháp chẩn đoán phân tử chính xác để xác định và phân loại Phytoplasma gây bệnh trên sắn. PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn DNA đặc trưng của Phytoplasma. Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose. PCR là công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu bệnh Phytoplasma sắn.

IV. Ứng Dụng LAMP PCR Chẩn Đoán Nhanh Bệnh Phytoplasma Sắn

LAMP-PCR (Loop-mediated isothermal amplification PCR) là kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt, hứa hẹn cho việc chẩn đoán nhanh bệnh Phytoplasma sắn. Phương pháp này có ưu điểm là thực hiện ở nhiệt độ không đổi, không cần thiết bị phức tạp như PCR truyền thống. LAMP-PCR có độ nhạy cao, cho phép phát hiện Phytoplasma ở nồng độ thấp. Nghiên cứu đã thiết kế và thử nghiệm thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu cho Phytoplasma nhóm 16SrII, giúp chẩn đoán bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ một cách nhanh chóng và hiệu quả.

4.1. Ưu Điểm Của Kỹ Thuật LAMP PCR So Với PCR Truyền Thống

LAMP-PCR có nhiều ưu điểm so với PCR truyền thống, bao gồm: thực hiện ở nhiệt độ không đổi, không cần thiết bị phức tạp, độ nhạy cao, thời gian phản ứng ngắn và dễ dàng thực hiện tại hiện trường. LAMP-PCR là công cụ chẩn đoán tiềm năng cho bệnh Phytoplasma sắn.

4.2. Thiết Kế Mồi LAMP PCR Đặc Hiệu Cho Phytoplasma Nhóm 16SrII

Nghiên cứu đã thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu cho Phytoplasma nhóm 16SrII, nhóm Phytoplasma phổ biến gây bệnh trên sắn tại Đông Nam Bộ. Bộ mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen 16S rRNA của Phytoplasma, đảm bảo tính đặc hiệu và độ nhạy cao.

4.3. Đánh Giá Hiệu Quả Của LAMP PCR Trong Chẩn Đoán Bệnh Chổi Rồng Sắn

Kết quả nghiên cứu cho thấy LAMP-PCR có hiệu quả cao trong chẩn đoán bệnh chổi rồng sắn do Phytoplasma nhóm 16SrII gây ra. LAMP-PCR có thể phát hiện Phytoplasma trong các mẫu sắn khác nhau, bao gồm lá, thân và củ, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. LAMP-PCR là công cụ chẩn đoán hữu ích cho việc quản lý bệnh Phytoplasma sắn.

V. Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học và Lan Truyền Bệnh Chổi Rồng Sắn

Nghiên cứu về đặc điểm sinh học và lan truyền của bệnh chổi rồng sắn là rất quan trọng để xây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả. Bệnh lan truyền chủ yếu qua hom giống bị nhiễm bệnh. Môi trường đất và các loài côn trùng cũng có thể đóng vai trò trong sự lan truyền của bệnh. Theo nghiên cứu, bệnh lan truyền qua việc sử dụng hom giống đã bị nhiễm bệnh là con đường chính. Cần có các biện pháp kiểm soát chặt chẽ nguồn giống và quản lý côn trùng môi giới để hạn chế sự lây lan của bệnh chổi rồng sắn.

5.1. Vai Trò Của Hom Giống Bị Nhiễm Bệnh Trong Lan Truyền Phytoplasma Sắn

Hom giống bị nhiễm Phytoplasma là con đường lan truyền chính của bệnh chổi rồng sắn. Việc sử dụng hom giống từ cây bị bệnh sẽ dẫn đến sự lây lan của bệnh sang các vụ trồng tiếp theo. Cần có các biện pháp kiểm soát và chọn lọc hom giống khỏe mạnh để hạn chế sự lây lan của bệnh.

5.2. Ảnh Hưởng Của Đất Trồng Đến Khả Năng Lan Truyền Bệnh Chổi Rồng

Đất trồng có thể ảnh hưởng đến khả năng lan truyền của bệnh chổi rồng. Một số loại đất có thể tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của Phytoplasma hoặc các loài côn trùng môi giới. Cần có các biện pháp cải tạo đất và quản lý dinh dưỡng hợp lý để hạn chế sự lây lan của bệnh.

5.3. Vai Trò Của Côn Trùng Trong Việc Truyền Bệnh Phytoplasma Sắn

Một số loài côn trùng, đặc biệt là rầy, có thể đóng vai trò trong việc truyền bệnh Phytoplasma sắn. Các loài rầy này hút nhựa cây bị bệnh và truyền Phytoplasma sang các cây khỏe mạnh. Cần có các biện pháp quản lý côn trùng môi giới để hạn chế sự lây lan của bệnh.

VI. Kết Luận Kiến Nghị Hướng Nghiên Cứu và Giải Pháp Quản Lý

Nghiên cứu về bệnh Phytoplasma hại sắn tại Đông Nam Bộ đã xác định được ít nhất hai nhóm Phytoplasma, 16SrI và 16SrII. Kỹ thuật LAMP-PCR đã được phát triển để chẩn đoán nhanh bệnh. Bệnh lan truyền chủ yếu qua hom giống. Cần tăng cường nghiên cứu về các biện pháp phòng trừ sinh học và quản lý côn trùng môi giới. Việc chọn giống kháng bệnh và kiểm soát chặt chẽ nguồn giống là yếu tố quan trọng trong quản lý bệnh Phytoplasma sắn.

6.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Chính Về Bệnh Phytoplasma Sắn

Nghiên cứu đã xác định được hai nhóm Phytoplasma gây bệnh trên sắn tại Đông Nam Bộ, phát triển kỹ thuật chẩn đoán nhanh LAMP-PCR và xác định vai trò của hom giống trong sự lan truyền của bệnh. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các biện pháp quản lý bệnh hiệu quả.

6.2. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Bệnh Phytoplasma Sắn

Cần tiếp tục nghiên cứu về các biện pháp phòng trừ sinh học, quản lý côn trùng môi giới và chọn giống kháng bệnh. Nghiên cứu về sự tương tác giữa Phytoplasma và cây sắn cũng rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh. Phân tích gen của Phytoplasma sắn sẽ giúp xác định nguồn gốc và sự tiến hóa của chúng.

6.3. Kiến Nghị Các Giải Pháp Quản Lý Bệnh Chổi Rồng Sắn Hiệu Quả

Cần có các biện pháp kiểm soát chặt chẽ nguồn giống, khuyến khích sử dụng hom giống khỏe mạnh, áp dụng các biện pháp canh tác tiên tiến và quản lý côn trùng môi giới. Việc phối hợp các biện pháp phòng trừ tổng hợp sẽ mang lại hiệu quả cao nhất trong việc quản lý bệnh chổi rồng sắn.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây lương thực và nguyên liệu công nghiệp phục vụ chế biến tinh bột, thức ăn gia súc và nhiên liệu sinh học. Tại Việt Nam, sắn thuộc nhóm 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ lực và nằm trong định hướng chiến lược phát triển đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Tuy nhiên, sản xuất sắn tại các tỉnh phía Nam đối mặt với sự bùng phát của bệnh chổi phù thủy (còn gọi là bệnh chổi rồng). Bệnh được ghi nhận xuất hiện rải rác từ năm 2005 trên giống sắn KM94 tại Quảng Ngãi, sau đó lây lan thành dịch tại các vùng trồng sắn trọng điểm thuộc vùng Đông Nam Bộ như Bà Rịa - Vũng Tàu và Đồng Nai. Theo số liệu ghi nhận của Nguyên Khê (2011), bệnh làm giảm năng suất củ từ 10% đến 30% và làm suy giảm hàm lượng tinh bột từ 20% đến 30%. Do nguyên nhân gây bệnh ban đầu chưa được xác định chính xác bằng phương pháp khoa học, việc áp dụng các loại thuốc trừ nấm để xử lý hom giống và phun phòng trừ trên đồng ruộng không mang lại hiệu quả, đặt ra yêu cầu phải làm rõ căn nguyên vi sinh vật và phương thức lan truyền của bệnh.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án chỉ ra là tại Việt Nam, các nghiên cứu cơ bản trước đây về vi sinh vật nhóm phytoplasma trên cây trồng còn rất hạn chế. Bệnh chổi phù thủy hại sắn là một bệnh mới, chưa được chẩn đoán tác nhân ở mức độ phân tử, chưa xác định được vị trí phân loại của các chủng phân lập và chưa có dữ liệu thực nghiệm về cơ chế lan truyền bệnh trong điều kiện canh tác tại các tỉnh Đông Nam Bộ.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm:

1. Chẩn đoán và phân loại được phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh Đông Nam Bộ.
2. Đánh giá được một số đặc điểm sinh học chính như tính gây bệnh và khả năng lan truyền của phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Khu hệ phytoplasma gây hại trên cây sắn, tập trung vào lĩnh vực chẩn đoán hiển vi, chẩn đoán phân tử, vị trí phân loại và các đặc tính sinh học (phương thức truyền qua đất, hom giống, ghép cây, tơ hồng và côn trùng).
• Phạm vi không gian: Điều tra đồng ruộng và thu thập mẫu bệnh tại các tỉnh Đông Nam Bộ gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, cùng các mẫu đối chứng thu thập bổ sung tại Phú Thọ, Yên Bái, Quảng Ngãi và Kon Tum. Các thí nghiệm lây nhiễm sinh học được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc. Các phân tích hiển vi điện tử và sinh học phân tử được triển khai tại Viện Bảo vệ thực vật và Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới.
• Phạm vi thời gian: Các nội dung điều tra, thu thập mẫu và thực nghiệm được tiến hành trong giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2014.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Phytoplasma là nhóm sinh vật nhân sơ thuộc lớp Mollicutes, bộ Acholeplasmatales, ngành Firmicutes, ký sinh bắt buộc trong tế bào ống rây thuộc mạch phloem của thực vật và trong cơ thể côn trùng môi giới (IRPCM, 2004; Hogenhout và cs., 2008). Phytoplasma có đặc điểm không có vách tế bào, kích thước nhỏ dưới 1 µm, hình thái biến dạng (bầu dục, ovan, hình tròn hoặc sợi ngắn) và không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo vô trùng (Bertaccini và Duduk, 2009). Theo quy chuẩn của Nhóm nghiên cứu phân loại phytoplasma thuộc IRPCM (2004), phân loại phytoplasma dựa trên trình tự đoạn gen 16S rRNA với tiêu chí loài mới khi độ tương đồng chuỗi nucleotide đạt dưới 97,5% trên đoạn dài trên 1,2 kb so với các loài đã công bố. Dựa vào vùng gen này, các chủng phytoplasma trên thế giới được xếp vào 33 nhóm phả hệ (16SrI đến 16SrXXXIII) với trên 116 nhóm phụ.

Về cơ chế gây bệnh, phytoplasma cư trú trong ống rây gây tắc nghẽn quá trình vận chuyển sản phẩm quang hợp từ mô nguồn xuống mô tiêu thụ. Ở cấp độ phân tử, các nghiên cứu công bố chỉ ra các protein hiệu ứng (effector) do phytoplasma tiết ra làm biến đổi hình thái cây chủ:

• Protein SAP11 (từ chủng AY-WB nhóm 16SrI) tương tác với α-importin để đi vào nhân tế bào cây, làm mất ổn định các yếu tố phiên mã TEOSINTE BRANCHED 1, CYCLOIDEA, PROLIFERATING CELL FACTOR 1/2 và CINCINNATA, kích thích sinh chồi nách và cản trở sự già hóa mô (Sugio và Hogenhout, 2012; Marcone, 2014).
• Protein SAP54 tương tác với protein RAD23 của cây chủ, gây phân hủy hai yếu tố phiên mã APETALA1 và LEAFY, dẫn đến hiện tượng diệp hóa hoa (MacLean và cs., 2011).
• Protein TENGU (từ chủng OY-M) hoạt động tại tế bào chất mô ngọn, ức chế sinh tổng hợp auxin, kích thích mọc chồi bên tạo triệu chứng chổi phù thủy điển hình (Hoshi và cs., 2009; Sugawara và cs., 2013).

Về phương thức truyền lan, phytoplasma truyền qua nhân giống vô tính (hom giống, mắt ghép, củ giống), truyền qua dây tơ hồng (Cuscuta spp.) và truyền qua côn trùng môi giới thuộc bộ Hemiptera (chủ yếu là họ Rầy xanh Cicadellidae với 80 loài, Cixiidae 7 loài, Delphacidae 4 loài, Psyllidae 7 loài). Phytoplasma truyền theo phương thức tích lũy bền vững, phải vượt qua biểu mô ruột giữa và xâm nhập vào tuyến nước bọt của côn trùng (Weintraub và Beanland, 2006). Phytoplasma không truyền qua hạt giống vì mô mạch rây không đi sâu vào phôi hạt (Finch-Savage, 2013).

Trên cây sắn thế giới, phytoplasma gắn liền với 3 dạng bệnh: bệnh chổi phù thủy, bệnh biến vàng lá và bệnh da cóc:

• Bệnh chổi phù thủy phát hiện lần đầu tại Brazil và Mexico do MLO gây ra (Costa và Kitajima, 1972). Tại Brazil, tỷ lệ bệnh đạt 85%, làm giảm 70% đến 90% năng suất củ (Lozano, 1992; Flôres và cs., 2013). Davis và cs. (2005) định danh chủng phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy tại đảo Wallis-Futuna thuộc nhóm 16SrI-A (mã AY787139). Flôres và cs. (2013) xác định chủng phytoplasma tại São Paulo thuộc nhóm phụ 16SrIII-B (mã GU193977). Alvarez và cs. (2014) xác định phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy tại Campuchia thuộc nhóm 16SrI. Zheng (2013) ghi nhận nhóm 16SrII hại sắn tại Trung Quốc. Klinkong và cs. (2015) và Moonjuntha và cs. (2015) ghi nhận nhóm 16SrI và 16SrII tại Thái Lan.
• Bệnh biến vàng lá sắn tại Uganda thuộc nhóm 16SrII-C (Arocha và cs., 2009a) và tại Cuba thuộc nhóm 16SrI (Arocha và cs., 2009b).
• Bệnh da cóc tại Colombia và các nước Nam Mỹ do phytoplasma nhóm 16SrIII-L gây ra (Alvarez và cs., 2009).
• Báo cáo tổng hợp của Mejia (2014) phân tích 92 mẫu sắn Đông Nam Á phát hiện sự có mặt của các nhóm 16SrI, 16SrIII, 16SrV, 16SrVI, 16SrX, 16SrXII và 16SrXV.

Nhóm 16Sr RNA ribosome	Dạng bệnh ghi nhận	Nguồn gốc mẫu	Tài liệu trích dẫn
16SrI	Chổi phù thủy, biến vàng lá, da cóc	Wallis-Futuna, Cuba, Costa Rica, Paraguay, Campuchia, Thái Lan, Việt Nam	Davis và cs. (2005); Arocha và cs. (2009b); Alvarez và cs. (2013, 2014); Klinkong và cs. (2015); Mejia (2014)
16SrII	Biến vàng lá, chổi phù thủy	Uganda, Trung Quốc, Thái Lan	Arocha và cs. (2009a); Zheng (2013); Moonjuntha và cs. (2015)
16SrIII	Da cóc, chổi phù thủy	Colombia, Brazil, Costa Rica, Paraguay, Việt Nam, Thái Lan	Alvarez và cs. (2009); Flôres và cs. (2013); Souza và cs. (2014); Oliveira và cs. (2014); Mejia (2014)
16SrV, 16SrVI	Chổi phù thủy	Việt Nam, Thái Lan	Mejia (2014)
16SrX	Chổi phù thủy	Việt Nam	Mejia (2014)
16SrXII	Chổi phù thủy, da cóc	Costa Rica, Paraguay, Việt Nam, Thái Lan	Mejia (2014)
16SrXV	Chổi phù thủy	Việt Nam, Thái Lan	Mejia (2014)

Tại Việt Nam, nghiên cứu phytoplasma trước đây tập trung vào bệnh vàng héo lá lúa do rầy xanh đuôi đen (Nephotettix virescens và Nephotettix nigropictus) truyền lan (Hà Minh Trung, 1985; Ngô Vĩnh Viễn, 1993), bệnh chồi cỏ và trắng lá mía, lùn bụi ngô, khảm lá cà phê, diệp hóa vừng (Vũ Triệu Mân và cs., 2002; Trần Thị Thanh Bình và cs., 2011; Huỳnh Đăng Sang và cs., 2014). Luận án của Nguyễn Đức Thành điền vào khoảng trống còn thiếu về việc xác định căn bản tác nhân phytoplasma hại sắn ở vùng Đông Nam Bộ, thiết lập hệ thống định danh kết hợp giữa kính hiển vi, PCR lồng, RFLP, kỹ thuật LAMP đẳng nhiệt và kiểm chứng các phương thức truyền lan thực tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên lý thuyết phân loại phân tử của IRPCM (2004) đối với chi Candidatus Phytoplasma dựa trên vùng gen bảo thủ 16S rRNA. Phương pháp tiếp cận kết hợp giữa hình thái tế bào, phân tích sinh học phân tử và khảo nghiệm đặc tính sinh học trong điều kiện có kiểm soát.

Vật liệu nghiên cứu:

• Nguồn mẫu bệnh: Hom sắn mang triệu chứng bệnh chổi phù thủy thuộc các giống KM94, KM419 và SM937-26 thu thập tại ruộng sản xuất của nông dân các tỉnh Đông Nam Bộ. Đối chứng âm sử dụng hom sắn giống KM94 sạch bệnh.
• Dây tơ hồng (Cuscuta spp.) phục vụ thí nghiệm truyền bệnh nhân tạo.
• Côn trùng bẫy đèn thu thập tại các ruộng sắn bị bệnh tại Đồng Nai.

Phương pháp chẩn đoán hiển vi và tế bào học:

• Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM): Quan sát lát cắt siêu mỏng mô cuống lá và gân lá sắn nhiễm bệnh trên máy JEOL 1010 tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương để xác định sự hiện diện, hình thái và kích thước của các thể phytoplasma trong tế bào ống rây.
• Kỹ thuật nhuộm huỳnh quang DAPI: Cắt lát mô mạch dẫn cuống lá, nhuộm với 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), kích hoạt bằng bước sóng cực tím 450 - 490 nm trên kính hiển vi huỳnh quang. Kỹ thuật này khai thác đặc điểm hệ gen phytoplasma rất giàu cặp bazơ AT (72 - 79%) để phát hiện huỳnh quang xanh đặc trưng tại mô phloem.

Phương pháp sinh học phân tử và phân tích phả hệ:

• Tách chiết DNA tổng số: Áp dụng phương pháp CTAB cải tiến theo Doyle và Doyle (1990).
• Kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR): Vòng 1 sử dụng cặp mồi phổ quát P1/P7 (Deng và Hiruki, 1991; Schneider và cs., 1995) hoặc R16mF2/R16mR1; vòng 2 sử dụng sản phẩm vòng 1 pha loãng làm khuôn với cặp mồi bên trong R16F2n/R16R2 (Gundersen và Lee, 1996) để khuếch đại đoạn gen đích khoảng 1,2 kb.
• Tinh sạch sản phẩm PCR: Dùng bộ kít QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
• Phân tích RFLP mô phỏng: Trình tự nucleotide sau giải trình tự được phân tích cắt hạn chế ảo bằng phần mềm pDRAW32 với 17 enzym cắt giới hạn chuẩn (AluI, BfaI, BstUI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI, HpaII, KpnI, Sau3AI, MseI, RsaI, SspI, TaqI, ThaI) để xác định kiểu đa hình và phân nhóm phụ.
• Xây dựng cây phả hệ: Xử lý chuỗi nucleotide bằng phần mềm BioEdit 7 và ClustalW2; thiết lập cây phát sinh chủng loại bằng thuật toán Neighbor-Joining trong phần mềm MEGA 5 với phép kiểm định bootstrap 1.000 lần lặp.
• Thiết kế và ứng dụng LAMP-PCR: Thiết kế bộ mồi chuyên biệt 6 vùng gồm 4 mồi (F3, B3, FIP, BIP) đặc hiệu cho phân nhóm 16SrII dựa trên vùng gen 16S rRNA để tối ưu hóa phản ứng nhân gen đẳng nhiệt tại 63 - 65°C mà không cần chu trình nhiệt phức tạp.

Phương pháp thực nghiệm sinh học:

• Thí nghiệm khảo sát vai trò của đất trồng và hom giống: Bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD) trong nhà lưới tại Hưng Lộc. Các công thức bao gồm kết hợp giữa hom giống sạch bệnh/hom giống bệnh với đất lấy từ ruộng sắn bị bệnh và đất sạch bệnh nhằm kiểm tra khả năng lưu tồn qua đất.
• Thí nghiệm lây truyền qua ghép cây: Ghép ngọn hoặc mắt ghép từ cây sắn bệnh sang cây sắn sạch bệnh.
• Thí nghiệm truyền bệnh qua tơ hồng: Thiết lập cầu nối tơ hồng giữa cây sắn nhiễm bệnh sang cây sắn sạch và cây dừa cạn (Catharanthus roseus).
• Thí nghiệm lây truyền bằng côn trùng: Thu thập các loài rầy bằng bẫy đèn tại vùng dịch Đồng Nai, phân loại sơ bộ, nuôi hút nạp trên cây sắn bệnh và thả sang cây sắn khỏe để theo dõi sự xuất hiện triệu chứng.
• Xử lý số liệu: Phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm thống kê IRRISTAT 4.0.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1. Tính cấp thiết của đề tài

Nêu bật vị trí của cây sắn trong cơ cấu xuất khẩu nông nghiệp Việt Nam và thực trạng bùng phát nghiêm trọng của bệnh chổi phù thủy từ năm 2005 tại Quảng Ngãi đến các vùng trồng tập trung ở Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu giai đoạn 2010 - 2014. Xác lập tính cấp bách của việc xác định nguyên nhân gây bệnh để thay thế việc sử dụng thuốc hóa học không hiệu quả. Đặt ra hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể, xác định đối tượng là phytoplasma và giới hạn phạm vi nghiên cứu thực địa tại Đông Nam Bộ cùng một số điểm đối chứng tại miền Bắc và miền Trung.

Phần 2. Tổng quan tài liệu

Tổng hợp toàn diện 4 nhóm nội dung lớn: (1) Lược sử, giá trị sử dụng và tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam và trên thế giới; (2) Bản chất học thuật về phytoplasma: lịch sử phát hiện từ khái niệm MLO năm 1967 sang phytoplasma năm 1994, vị trí phân loại học theo IRPCM với 33 nhóm 16Sr, đặc điểm hình thái không vách tế bào, triệu chứng bệnh học, cơ chế phân tử của các protein tiết (SAP11, SAP54, TENGU), phương thức lan truyền qua nhân giống sinh dưỡng, tơ hồng và côn trùng bộ Hemiptera; (3) Điểm lại các nghiên cứu bệnh phytoplasma hại sắn trên phạm vi toàn cầu từ năm 1972 đến 2015, nhấn mạnh các nhóm phân loại 16SrI, 16SrII và 16SrIII tại châu Mỹ, châu Phi và Đông Nam Á; (4) Khái quát lịch sử nghiên cứu phytoplasma tại Việt Nam từ công trình nghiên cứu bệnh vàng héo lá lúa thập niên 1980 đến các bệnh trắng lá mía và chồi cỏ mía.

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết nguồn vật liệu hom sắn (KM94, KM419, SM937-26), địa điểm thực hiện (Viện Bảo vệ thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Trung tâm Hưng Lộc). Quy định rõ quy trình thao tác kỹ thuật cho từng nội dung: quy chuẩn điều tra tỷ lệ bệnh ngoài đồng ruộng; quy trình cố định mẫu, cắt siêu mỏng và soi kính hiển vi điện tử JEOL 1010; quy trình nhuộm huỳnh quang DAPI; thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR lồng với các cặp mồi P1/P7, R16mF2/R16mR1 và R16F2n/R16R2; phương pháp mô phỏng cắt hạn chế enzyme bằng pDRAW32; thuật toán dựng cây phả hệ trong MEGA 5; nguyên lý thiết kế và quy trình vận hành phản ứng LAMP đẳng nhiệt; thiết kế các thí nghiệm truyền lan sinh học trong điều kiện nhà lưới có kiểm soát.

Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Kết quả nghiên cứu được tổ chức thành 5 mục chuyên sâu:

4.1. Mô tả triệu chứng và điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn

Mô tả chi tiết bệnh học ngoài đồng ruộng: cây bị bệnh có biểu hiện mọc nhiều chồi phụ nhỏ dày đặc ở phần ngọn và nách thân chính, lóng thân co ngắn lại, phiến lá nhỏ, mép lá hơi lượn sóng và chuyển màu vàng nhạt hoặc úa vàng. Cây còi cọc nghiêm trọng, không phát triển được bộ tán bình thường. Số liệu điều tra năm 2011 tại các tỉnh Đông Nam Bộ cho thấy bệnh xuất hiện phổ biến tại hầu hết các vùng trồng tập trung ở Đồng Nai và Bà Rịa - Vũng Tàu với tỷ lệ hại rất cao, tạo thành các ổ dịch nghiêm trọng.

4.2. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR

• Hiển vi điện tử truyền qua (TEM): Trong các lát cắt cuống lá và gân lá của cây bệnh đợt 1 và đợt 2 (năm 2011), quan sát thấy dày đặc các thể vi sinh vật không có vách tế bào, dạng hình ovan, bầu dục hoặc tròn, giới hạn bởi lớp màng đôi, đường kính dao động từ 100 nm đến 800 nm nằm trong xoang tế bào ống rây mạch phloem. Các mẫu sắn khỏe đối chứng hoàn toàn không có cấu trúc này.
• Nhuộm huỳnh quang DAPI (năm 2014): Lát cắt mô bệnh cho tín hiệu huỳnh quang màu xanh sáng tập trung rõ nét dọc theo các dải tế bào mạch rây dưới ánh sáng kích hoạt UV 450 - 490 nm, trong khi mẫu sắn khỏe chỉ phát huỳnh quang tự nhiên mờ nhạt ở thành tế bào hóa gỗ.
• Khuếch đại PCR lồng: Cả hai hệ thống mồi lồng (P1/P7 kết hợp R16F2n/R16R2 và P1/P7 kết hợp R16mF2/R16mR1) đều khuếch đại thành công phân đoạn DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 1,2 kb từ các mẫu sắn bệnh thu thập tại Đông Nam Bộ và các tỉnh khác, khẳng định sự hiện diện nhất quán của phytoplasma trong mô cây sắn biểu hiện triệu chứng chổi phù thủy.

4.3. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn

• Giải trình tự và tra cứu BLAST: Trình tự các sản phẩm PCR lồng được giải mã và đối chiếu trên cơ sở dữ liệu GenBank cho thấy độ tương đồng nucleotide cao (>98 - 99%) với các chủng phytoplasma đã công bố. Luận án đã đăng ký thành công các trình tự phytoplasma hại sắn phân lập từ Việt Nam lên Ngân hàng Gen quốc tế.
• Phân tích RFLP mô phỏng bằng pDRAW32: Bản đồ cắt của 17 enzym cắt hạn chế trên đoạn gen 16S rRNA chỉ ra các mẫu phytoplasma hại sắn tại Việt Nam phân tách rõ rệt thành hai nhóm chính:
  1. Nhóm tương đồng với nhóm 16SrI (Aster yellows phytoplasma group).
  2. Nhóm tương đồng với nhóm 16SrII (Peanut witches' broom phytoplasma group).
• Phân tích phả hệ bằng thuật toán Neighbor-Joining:
  • Các phân lập phytoplasma hại sắn phổ biến tại Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu thuộc nhóm phụ 16SrII-A (có quan hệ di truyền rất gần với phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên đậu phộng).
  • Một số phân lập khác được xác định thuộc nhóm phụ 16SrI-B.
  • Đáng chú ý, phân lập ký hiệu YB-01 (mã truy cập GenBank: KM360166) thu thập tại Yên Bái thuộc nhóm 16SrI nhưng có hồ sơ đa hình cắt hạn chế RFLP và vị trí nhánh phả hệ tách biệt hoàn toàn so với tất cả các nhóm phụ đã biết, đại diện cho một phân nhóm phụ mới chưa từng được công bố trên thế giới.

4.4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn

Từ việc xác định nhóm 16SrII là nhóm gây hại chính tại vùng Đông Nam Bộ, tác giả đã thiết kế bộ mồi LAMP cải tiến dựa trên 8 đoạn trình tự đặc thù trên gen 16S rRNA.

• Thử nghiệm trên DNA tổng số tách chiết từ cây và sản phẩm PCR tinh sạch: Phản ứng LAMP nhân bản đẳng nhiệt tại 63 - 65°C trong vòng 45 - 60 phút cho kết quả phát hiện chính xác phytoplasma nhóm 16SrII mà không cần máy luân nhiệt chu kỳ.
• Đánh giá trên các loại mô sắn khác nhau (cuống lá, phiến lá, vỏ thân): Phản ứng cho kết quả khuếch đại ổn định, sản phẩm điện di có dạng thang vạch đặc trưng của kỹ thuật LAMP, mở ra quy trình chẩn đoán nhanh phục vụ kiểm dịch và kiểm định giống.

4.5. Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn

• Vai trò của đất trồng và hom giống (thí nghiệm năm 2012 và 2013 tại Đồng Nai):
  • Đất lấy từ ruộng sắn bị bệnh không làm lây nhiễm bệnh sang cây sắn phát triển từ hom giống khỏe sạch bệnh (tỷ lệ bệnh đạt 0%).
  • Ngược lại, hom giống lấy từ cây bị bệnh đem trồng trên đất sạch hay đất bệnh đều phát triển thành cây có triệu chứng chổi phù thủy với tỷ lệ rất cao (100% cây biểu hiện triệu chứng bệnh).
  • Kết quả khẳng định bệnh không truyền lan và không lưu tồn qua đất trồng, mà hom giống nhiễm bệnh là nguồn lây lan ban đầu có tính quyết định.
• Lan truyền qua ghép cây: Thực nghiệm ghép cành/mắt ghép từ cây sắn bệnh sang cây sắn khỏe sạch bệnh cho thấy phytoplasma di chuyển qua cầu mạch dẫn, làm xuất hiện triệu chứng chổi phù thủy điển hình trên cây ghép sạch bệnh sau thời gian ủ bệnh.
• Lan truyền qua tơ hồng (Cuscuta spp.): Tơ hồng kết nối thành công mạch phloem giữa cây sắn bệnh và cây nhận, truyền được phytoplasma từ sắn bệnh sang cây sắn khỏe và cây dừa cạn thí nghiệm.
• Khảo sát côn trùng môi giới: Bẫy đèn tại ruộng sắn Đồng Nai thu được nhiều loài rầy thuộc bộ Hemiptera. Tuy nhiên, các thử nghiệm lây truyền nhân tạo từ các cá thể rầy thu thập được sang cây sắn khỏe chưa ghi nhận được kết quả truyền bệnh thành công ổn định, phản ánh sự tương đồng với các y văn quốc tế khi côn trùng môi giới tự nhiên của phytoplasma hại sắn vẫn là bài toán chưa có lời giải dứt điểm trong suốt 43 năm (1972 - 2015).

Phần 5. Kết luận và kiến nghị

Tổng kết 5 kết luận chính về tác nhân (phytoplasma thuộc nhóm 16SrI và 16SrII), phát hiện nhóm phụ mới YB-01, quy trình chẩn đoán (DAPI, nested-PCR, LAMP-PCR) và con đường truyền bệnh chủ yếu qua hom giống. Đưa ra các kiến nghị thực tiễn về việc kiểm soát vận chuyển hom giống và xây dựng hệ thống sản xuất hom giống sạch bệnh.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt khoa học của luận án bao gồm:

1. Xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Việt Nam là do phytoplasma (thuộc chi Candidatus Phytoplasma) gây ra, chấm dứt tình trạng suy đoán không có cơ sở khoa học dẫn đến việc dùng thuốc diệt nấm sai mục đích.
2. Phân loại và lập bản đồ phân tử khu hệ phytoplasma hại sắn tại Việt Nam: Xác định phytoplasma hại sắn thuộc ít nhất 2 nhóm phân loại gồm nhóm 16SrI (với phân nhóm phụ 16SrI-B) và nhóm 16SrII (với phân nhóm phụ 16SrII-A). Trong đó, nhóm 16SrII-A là tác nhân chủ yếu tại các tỉnh Đông Nam Bộ.
3. Phát hiện mẫu phân lập phytoplasma YB-01 (mã số Ngân hàng Gen: KM360166) thu thập trên sắn tại Yên Bái thuộc nhóm 16SrI nhưng nằm trong một phân nhóm phụ hoàn toàn mới, chưa từng được ghi nhận trong cơ sở dữ liệu phytoplasma quốc tế.
4. Áp dụng thành công kỹ thuật nhuộm huỳnh quang mô DAPI để phát hiện nhanh thể phytoplasma trên hệ thống mô rây cây sắn tại Việt Nam.
5. Thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu phát hiện nhóm 16SrII hại sắn, xây dựng quy trình chẩn đoán đẳng nhiệt có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, rút ngắn thời gian phát hiện mẫu bệnh.
6. Cung cấp luận cứ thực nghiệm xác định con đường truyền bệnh chủ yếu của bệnh chổi phù thủy sắn trong sản xuất là qua hom giống vô tính mang nguồn bệnh; bệnh không truyền lan qua đất trồng.

Các giải pháp và kiến nghị đề xuất từ kết quả nghiên cứu:

• Biện pháp then chốt để quản lý và ngăn chặn bệnh chổi phù thủy hại sắn là sử dụng nguồn hom giống sạch bệnh và tuyệt đối không vận chuyển hom giống từ vùng đang có dịch (như Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu) sang các vùng trồng mới hoặc vùng chưa bị nhiễm bệnh.
• Nhổ bỏ và tiêu hủy triệt để tàn dư cây bệnh ngay khi phát hiện triệu chứng trên ruộng để cắt đứt nguồn lây lan.
• Ứng dụng quy trình chẩn đoán phân tử bằng PCR lồng và bộ mồi LAMP-PCR nhóm 16SrII vào công tác kiểm định chất lượng hom giống sắn tại các trung tâm giống cây trồng và cơ quan kiểm dịch thực vật.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Chưa xác định được loài côn trùng môi giới cụ thể có khả năng truyền phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn trong điều kiện tự nhiên tại Việt Nam (các thử nghiệm lây bệnh nhân tạo từ rầy bẫy đèn chưa tạo được triệu chứng ổn định).
• Các thực nghiệm đánh giá khả năng truyền lan sinh học mới chỉ dừng lại ở phạm vi chậu vại trong điều kiện nhà lưới có kiểm soát, chưa theo dõi được động thái tương tác phức tạp trên quy mô hệ sinh thái đồng ruộng rộng lớn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Tiếp tục mở rộng điều tra thành phần loài côn trùng chích hút (đặc biệt là các loài rầy xanh thuộc họ Cicadellidae và rầy thuộc phân bộ Auchenorrhyncha) sống trên tán cây sắn và cỏ dại xung quanh ruộng để xác định chính xác vector môi giới truyền bệnh.
• Nghiên cứu đánh giá mức độ kháng/nhiễm bệnh chổi phù thủy của tập đoàn các giống sắn đang sản xuất và triển vọng nhằm tuyển chọn các giống chống chịu tốt cung cấp cho vùng dịch Đông Nam Bộ.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho các nhóm đối tượng:

• Cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Bảo vệ thực vật và Vi sinh vật học: Tham khảo hệ thống dẫn liệu phân loại phân tử phytoplasma, quy trình phân tích RFLP ảo bằng phần mềm pDRAW32, và quy chuẩn dựng cây phả hệ bằng thuật toán Neighbor-Joining trên gen 16S rRNA.
• Cán bộ kỹ thuật kiểm dịch thực vật và kiểm định giống: Ứng dụng trực tiếp bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu cho nhóm 16SrII và quy trình nhuộm huỳnh quang DAPI để chẩn đoán nhanh phytoplasma trên hom giống sắn thương phẩm mà không cần đầu tư hệ thống giải trình tự đắt tiền.
• Cơ quan quản lý nông nghiệp và cán bộ khuyến nông: Sử dụng các số liệu thực nghiệm về đường truyền qua hom giống để ban hành các quy định quản lý, hướng dẫn nông dân tuyệt đối không dùng hom từ cây bệnh làm giống, thay đổi hoàn toàn thói quen dùng thuốc hóa học trừ nấm sai quy trình.

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân gây bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ được xác định là gì và thuộc nhóm phân loại nào?

Tác nhân gây bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Đông Nam Bộ được xác định là phytoplasma (sinh vật nhân sơ không vách tế bào thuộc chi Candidatus Phytoplasma). Dựa trên phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA và phân tích RFLP mô phỏng, phytoplasma hại sắn tại vùng này thuộc nhóm 16SrII (cụ thể là nhóm phụ 16SrII-A). Ngoài ra, nghiên cứu còn ghi nhận sự hiện diện của nhóm 16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) trên cây sắn tại Việt Nam.

2. Mẫu phytoplasma phân lập YB-01 tại Yên Bái có điểm gì đặc biệt?

Mẫu phân lập YB-01 thu thập từ sắn tại Yên Bái (đã đăng ký trên GenBank với mã số KM360166) được giải trình tự và phân tích RFLP mô phỏng cho thấy thuộc nhóm 16SrI, tuy nhiên mẫu này sở hữu các đặc điểm cắt enzyme giới hạn và vị trí nhánh phát sinh chủng loại hoàn toàn tách biệt, được xác định là một phân nhóm phụ mới chưa từng được công bố trên thế giới.

3. Bộ mồi LAMP-PCR được thiết kế trong luận án có ưu điểm gì trong chẩn đoán?

Bộ mồi LAMP-PCR gồm 4 mồi (F3, B3, FIP, BIP) nhận diện đặc hiệu 6 vùng trình tự trên gen 16S rRNA của phytoplasma nhóm 16SrII. Phương pháp này có độ nhạy rất cao, cho phép khuếch đại đẳng nhiệt ở nhiệt độ ổn định (63 - 65°C) trong 45 - 60 phút chỉ bằng bể ủ nhiệt hoặc nồi cách thủy, không phụ thuộc vào máy luân nhiệt chu kỳ PCR, rất thuận tiện cho việc phát hiện nhanh tại chỗ.

4. Bệnh chổi phù thuỷ sắn có truyền qua đất trồng và hạt giống hay không?

Thực nghiệm chậu vại trong nhà lưới cho thấy cây sắn sạch bệnh trồng trên đất lấy từ ruộng sắn bị dịch bệnh hoàn toàn không bị nhiễm bệnh (tỷ lệ bệnh 0%). Kết hợp với cơ sở lý thuyết về cấu tạo hạt (mạch rây không nối vào phôi hạt), luận án xác định bệnh không lan truyền qua đất trồng và không truyền qua hạt giống. Con đường lan truyền chủ yếu và nguy hiểm nhất là qua hom giống vô tính bị nhiễm bệnh.

5. Cơ sở khoa học của phương pháp nhuộm mô DAPI để phát hiện phytoplasma là gì?

Thuốc nhuộm DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) có ái lực liên kết mạnh với các vùng giàu cặp base Adenine - Thymine (A-T) trên DNA. Bộ gen của phytoplasma có hàm lượng A-T chiếm tỷ lệ rất cao (72% đến 79%). Khi nhuộm lát cắt mô mạch dẫn cuống lá sắn và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng kích hoạt UV 450 - 490 nm, phytoplasma trong các ống rây mạch phloem sẽ phát ánh sáng huỳnh quang xanh rõ rệt, cho phép phân biệt với mô cây khỏe không bị nhiễm.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Nguyễn Đức Thành đã giải quyết triệt để nghi vấn khoa học về căn nguyên bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Đông Nam Bộ bằng cách chứng minh bệnh do phytoplasma gây ra, với tác nhân chủ đạo thuộc nhóm phụ 16SrII-A bên cạnh sự hiện diện của nhóm phụ 16SrI-B và một phân nhóm phụ mới (YB-01). Nghiên cứu đã xây dựng thành công bộ công cụ chẩn đoán hoàn chỉnh từ hiển vi huỳnh quang DAPI, PCR lồng đến kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt LAMP-PCR chuyên biệt cho nhóm 16SrII. Kết quả thực nghiệm sinh học khẳng định phương thức lan truyền quyết định của bệnh là qua nguồn hom giống vô tính mang mầm bệnh chứ không qua đất trồng, cung cấp cơ sở khoa học trực tiếp cho công tác phòng trừ dịch bệnh thông qua việc kiểm soát giống sạch bệnh tại các tỉnh Đông Nam Bộ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP, NĂM 2016 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Mã số: 62 62 01 12 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. HÀ VIẾT CƢỜNG 2. TRỊNH XUÂN HOẠT HÀ NỘI, NĂM 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành i LỜI CẢM ƠN Luận án có sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh chổi rồng và bệnh thán thƣ hại sắn” do Bộ Nông nghiệp và PTNT cấp kinh phí thực hiện cho TS. Trịnh Xuân Hoạt làm chủ nhiệm đề tài và đã đƣợc cho phép sử dụng trong luận án. Để hoàn thành bản luận án này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy, quý cô và ngƣời thân. Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.

Hà Viết Cƣờng và TS. Trịnh Xuân Hoạt đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ Viện Bảo vệ thực vật, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học đã nhiệt tình trao đổi, góp ý cho các vấn đề, giải pháp, trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ kỹ thuật và bà con nông dân tại nhiều nơi đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời tri ân tới tất cả ngƣời thân trong gia đình, những ngƣời luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN 1.

Tính cấp thiết của đề tài 1 1. Mục tiêu của đề tài 2 1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2 1. Những đóng góp mới của đề tài 3 1.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2. Lƣợc sử nguồn gốc và phân loại cây sắn 5 2. Giá trị sử dụng và giá trị dinh dƣỡng 5 2.

Tình hình sản xuất sắn trên thế giới 5 2. Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam 6 2. Phytoplasma hại thực vật 7 2. Lịch sử phát hiện phytoplasma 7 2.

Phân loại phytoplasma 7 2. Tầm quan trọng của phytoplasma 12 2. Đặc điểm hình thái phytoplasma 13 2. Triệu chứng bệnh do phytoplasma gây ra 14 2.

Cơ chế gây bệnh của phytoplasma 14 2. Sự đa dạng của phytoplasma 15 2. Lan truyền của phytoplasma 16 2. Phƣơng pháp chẩn đoán phytoplasma 20 iii 2.

Biện pháp phòng chống 26 2. Một số nghiên cứu về bệnh phytoplasma hại sắn 27 2. Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật ở Việt Nam 32 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 3.

Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 36 3. Vật liệu nghiên cứu 36 3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37 3. Nội dung nghiên cứu 37 3.

Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 37 3. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 37 3. Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 38 3. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 38 3.

Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra 38 3. Phƣơng pháp nghiên cứu 39 3. Phƣơng pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 39 3. Phƣơng pháp phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 40 3.

Phƣơng pháp định danh phân tử và phân tích phả hệ 44 3. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 46 3. Phƣơng pháp xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra 47 3. Phƣơng pháp tính và xử lý số liệu 49 PHẦN 4.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51 4. Mô tả triệu chứng và điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 51 4. Mô tả triệu chứng bệnh 51 4. Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 53 4.

Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR 54 4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử 54 iv 4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm mô 57 4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kỹ thuật PCR 59 4.

Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 65 4. Kết quả định danh bằng giải trình tự sản phẩm PCR 65 4. Kết quả định danh bằng kỹ thuật RFLP 75 4. Kết quả định danh bằng phân tích đồng nhất trình tự nucleotide 84 4.

Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trên trình tự nucleotide 86 4. Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn 96 4. Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 96 4. Đánh giá khả năng phát hiện phytoplasma của bộ mồi LAMP 101 4.

Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra 104 4. Ảnh hƣởng của đất và hom giống đến khả năng lan truyền của bệnh 104 4. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép cây 108 4. Khả năng lan truyền của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 109 4.

Khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn qua một số loài côn trùng 112 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 120 5. Kiến nghị 121 Danh mục các công trình công bố 122 Tài liệu tham khảo 123 Phụ lục 141 v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Diễn giải ký hiệu, nghĩa tiếng Việt/tiếng Anh chữ viết tắt cs. Cộng sự CT Công thức µl Microliter A.

laidlawii Acholeplasma laidlawii BIP Backward internal primer (Mồi ngƣợc dòng bên trong) BLAST Basic local alignment search tool (Công cụ tìm kiếm chuỗi tƣơng đồng cơ bản cục bộ) bp Base pair (Cặp bazơ) Ca. Phytoplasma Candidatus Phytoplasma CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DAPI 4‟,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DNA Deoxy nucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtOH Ethanol FAO Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp và Lƣơng thực của Liên hiệp Quốc) FIP Forward internal primer (Mồi xuôi dòng bên trong) IRPCM International research project for comparative mycoplasmology (Dự án Nghiên cứu Quốc tế về Mycoplasma) kb Kilo base LAMP-PCR Loop mediated isothermal amplification - PCR (Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt) M. esculenta Manihot esculenta ml Mililiter nm Nanometer nts Nucleotides PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) vi RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình chiều dài của đoạn cắt giới hạn) rRNA ribosomal ribonucleic acid TAE Tris-acetate acid EDTA TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) UPGMA Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng) vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2. Phân loại phytoplasma dựa trên phân tích gen 16S RNA ribosome 8 2.

Thành phần các nhóm côn trùng bộ Hemiptera là môi giới truyền phytoplasma 17 2. Một số mồi PCR phát hiện phytoplasma đã đƣợc công bố 23 2. Danh sách các nhóm phytoplasma hại sắn đã đƣợc xác định dựa vào phân tích phân tử 32 3. Các cặp mồi đƣợc sử dụng để phát hiện phytoplasma trên cây sắn 42 4.

Mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại các điểm điều tra ở một số tỉnh (năm 2011) 53 4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử 55 4. Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng nhuộm DAPI (năm 2014) 57 4. Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7- R16F2n/R16R2 60 4.

Kết quả PCR phát hiện phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7 - R16mF2/R16mR1 63 4. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 66 4. Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc của sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 67 4. Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 70 4.

Kết quả tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc của sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 71 4. Danh sách các mẫu phytoplasma hại sắn đã đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen 74 4. Danh sách các mẫu dùng trong phân tích RFLP mô phỏng 77 4. Mức tƣơng đồng di truyền dựa trên mô hình cắt RFLP mô phỏng vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn 83 4.

So sánh mức đồng nhất trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome của các mẫu phytoplasma hại sắn 85 viii 4. Đại diện 28 nhóm phytoplasma dùng trong phân tích phả hệ 86 4. Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrI dùng trong phân tích phả hệ 89 4. Đại diện các nhóm phụ nhóm 16SrII dùng trong phân tích phả hệ 92 4.

Các nhóm/nhóm phụ 16S RNA ribosome của phytoplasma hại sắn tại Việt Nam 94 4. Đặc điểm 8 trình tự phù hợp trên gen mã hóa 16S RNA ribosome để thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 99 4. Trình tự các mồi LAMP cải tiến đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 100 4. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ DNA tổng số chiết từ cây 101 4.

Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma nhóm 16SrII từ sản phẩm PCR tinh sạch 102 4. Phản ứng LAMP phát hiện phytoplasma từ các loại mẫu sắn khác nhau bị bệnh chổi phù thuỷ 103 4.