MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Trong nhiều năm trở lại đây, ngành thủy sản đã phát triển và trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của cả nƣớc, đứng thứ ba sau dầu khí và dệt may. Việc xuất khẩu thủy sản không ngừng tăng trong những năm nhƣ: năm 2007 đạt trên 3,65 tỷ USD, năm 2008 đạt 4,5 tỷ USD, năm 2009 đạt 4,4 tỷ USD, năm 2010 đạt 5,034 tỷ USD, năm 2011 đạt 6 tỷ USD và năm 2012 phấn đấu đạt 6,3 – 6,5 tỷ USD. Để đạt đƣợc chỉ tiêu trên thì chiến lƣợc của ngành đƣợc đƣa ra là tăng cƣờng chế biến các sản phẩm xuất khẩu do vậy đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu chất lƣợng cao nhằm đạt đƣợc mục tiêu trên. Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) là loài cá có giá trị dinh dƣỡng cao, đã và đang đƣợc sự quan tâm của rất nhiều cá nhân, đơn vị nuôi trồng thủy sản tại các tỉnh ven biển Nam Trung bộ nhƣ Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận.
Loài cá này là đối tƣợng nuôi mới và mang lại lợi ích kinh tế rất lớn cho ngƣời nuôi trồng thủy sản và đã đƣợc sản xuất giống và nuôi thƣơng phẩm ở một số tỉnh nói trên. Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, một số bệnh bắt đầu xuất hiện và có những diễn biến phức tạp trên đàn cá thƣơng phẩm, trong đó đặc biệt là bệnh đốm trắng nội tạng nhƣ lách, gan, thận, và trong khoang bụng cá chim vây vàng gây chết hàng loạt gây thiệt hại rất lớn về kinh tế. Vì vậy nhu cầu cần đặt ra đó là xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh Norcadiosis và chính xác loài vi khuẩn gây bệnh, đồng thời xác định quan hệ di truyền của các chủng vi khuẩn Norcadia sp. phân lập đƣợc ở các vùng địa lý khác nhau, từ đó đƣa ra biện pháp phòng và trị bệnh do vi khuẩn này gây ra.
Để đáp ứng những nhu cầu cấp thiết trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu bệnh Nocardiosis ở cá chim vây vàng nuôi tại tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên” 2. Mục tiêu - Xác định tình hình dịch tễ học bệnh đốm trắng (Nocardiosis) ở cá chim vây vàng đƣợc nuôi ở tỉnh Khánh Hòa và Phú yên - Xác định loài vi khuẩn Nocardia sp. gây bệnh đốm trắng ở cá chim vây vàng. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu dịch tễ học bệnh đốm trắng (Nocardiosis) ở cá chim vây vàng 1 Luận Văn Thạc Sĩ Phan Nguyễn Minh Thư Nội dung 2: Nghiên cứu biển đổi mô, phân lập, định danh và xác định quan hệ di truyền của vi khuẩn Nocardia sp.
Ý nghĩa khoa học: Xác định chính xác ở mức độ loài vi khuẩn gây ra bệnh đốm trắng ở nội tạng cá chim vây vàng, tìm hiểu chuyên sâu hơn về tác nhân gây bệnh đốm trắng nội trên cá chim vây vàng và từ đó đƣa ra biện pháp phòng chống bệnh. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả là cơ sở cho việc phòng chống bệnh đốm trắng nội tạng của cá chim vây vàng nuôi ở Khánh Hòa và Phú Yên. 2 Luận Văn Thạc Sĩ Phan Nguyễn Minh Thư CHƢƠNG 1. Tổng quan về chivi khuẩn Nocardia 1.
Đặc điểm phân loại học của Nocardia Vi khuẩn Nocardia đƣợc nhà khoa học ngƣời Pháp Edmond Nocard (1850 – 1903) và là bác sĩ thú y phát hiện và phân lập đầu tiên ở bò vào năm 1888. Sau đó năm 1890, Eppinger phát hiện bệnh do vi khuẩn Nocardia gây ra ở ngƣời. Theo phân loại học, Nocardia đƣợc xếp vào: Giới: Bacteria Ngành : Actinobacteria Lớp: Actinobacteria Bộ: Actinomycetales Họ: Nocardiaceae Chi: Nocardia Loài: Nocardia aerocolonigenes Chi Nocardia có tổng cộng khoảng 85 loài đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp định danh truyền thống và sinh học phân tử, trong đó có một số loài gây bệnh ở động vật nhƣ: chó, trâu, bò, ngựa, dê, cừu, và chƣa có tài liệu nào cho thấy Nocardia gây bệnh ở lợn. Bốn loài gây bệnh trên cá đã đƣợc phát hiện là: Nocardia seriola(trƣớc đây là Nocardia kampachi), Nocardia asteroids, Nocardia salmonicida và Nocardia crassostreae [15,28].
Và một số gây bệnh cho ngƣời trong đó có 13 loài: Nocardia abscessus, Nocardia africana, Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia brevicatena, Nocardia cyriacigeorgica, Nocardia farcinica, Nocardia nova, Nocardia otitidiscaviarum, Nocardia paucivarans, Nocardia pseudo brasiliensis, Nocardia transvalensis, Nocardia veteran [48,46,25]. Đặc điểm sinh học của chi Nocardia 1. Đặc điểm hình thái và sinh trƣởng Chi Nocardia là vi khuẩn hiếu khí, Gram dƣơng (+), sinh bào tử, các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tƣơng tự bó sợi của nấm (ở Actinosynnema, Actinomadura) thƣờng có tỷ lệ GC trong ADN là 64% - 72%, hình que, dạng sợi, nhánh, không di chuyển và thuộc vi sinh vật hoại sinh. Chi Nocardia đƣợc tìm thấy khắp nơi trên thế giới, rộng rãi trong tự nhiên nhƣ: đất (nhất là đất đồi núi), cây, cỏ và 3 Luận Văn Thạc Sĩ Phan Nguyễn Minh Thư gỗ mục, vật liệu hữu cơ chết hoặc đang phân hủy.
Mô tế bào động vật và con ngƣời là môi trƣờng lý tƣởng để chúng phát triển và gây bệnh [5, 45].1: Hình ảnh vi khuẩn Nocardia bắt màu nhuộm Gram [7] Nocardia thƣờng đƣợc phân lập và nuôi cấy trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ: thạch Sabouraud có glucose, thạch máu, thạch Lowenstein - Jensen, BHI, Ogawa và phát triển khá chậm trong các môi trƣờng nuôi cấy không chọn lọc [23]. Vi khuẩn Nocardia có thể sinh trƣởng trong phạm vi nhiệt độ rộng từ 15 - 37ºC. Tùy theo từng loài mà nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng của chúng khác nhau, ví dụ nhƣ Nocardia asteroid; Nocardia brasiliensis; Nocardia farcinica; Nocardia caviae gây bệnh trên ngƣời sinh trƣởng tốt ở 37ºC [44, 47]. Cấu trúc Cấu trúc tế bào của vi khuẩn Nocardia gồm: màng, thành tế bào, màng nguyên sinh, tế bào chất, thể nhân, các thể ẩn nhập trong nguyên sinh chất.
Đặc biệt trong thành tế bào của Nocardia chứa acid mycolic với 3 liên kết đôi và chuỗi mạch thẳng 40 – 60 carbon, meso-acid diaminopimelic (meso-A2pm), arabinogalactan - là hợp chất đƣợc tổng hợp từ arabinose và galactose (hình 1. 4 Luận Văn Thạc Sĩ Phan Nguyễn Minh Thư Hình 1.2: Cấu trúc thành tế bào của Nocardia [55] Thành phần phospholipid đặc trƣng của vi khuẩn là phosphatidylethanolamine. Nocardia chứa menaquinone, không chứa ubiquinone. Loại menaquinone chiếm ƣu thế trong các loài Nocardia là MK-8(H2) (menaquinone chứa một trong số tám đơn vị isoprene bị hydroxyl hóa) [5, 20].
Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn Nocardia Nocardia thƣờng là khuẩn lạc khô, chắc, xù xì, nhăn nheo hoặc nhẵn bóng, đa số có dạng vôi, dạng da hoặc dạng màng dẻo.Khuẩn lạc của Nocardia có màu sắc rất đa dạng nhƣ đỏ, vàng, trắng tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh. Khuẩn lạc Nocardia có kích thƣớc không đều nhau, có thể thay đổi tùy từng loài và điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, độ ẩm). Đƣờng kính mỗi khuẩn lạc khoảng 0,5 – 2 mm nhƣng cũng có khuẩn lạc đạt tới đƣờng kính 1 cm hoặc lớn hơn [5, 20]. 5 Luận Văn Thạc Sĩ Phan Nguyễn Minh Thư Hình 1.4: Khuẩn lạc của Nocardia steroides phân lập trên cùng một môi trường TSB và nhiệt độ nhưng đa dạng về kích thước, màu sắc, hình dạng [53] 1.
Đặc điểm hóa sinh của các loài vikhuẩn thuộc chi Nocardia 1. Nhuộm Acid-fast Ziehl-Neelsen Vi khuẩn thuộc chi Nocardia có cấu tạo vách tế bào không bình thƣờng, và có chứa phân tử acid mycolic. Chất nhuộm carbon fuchsin dƣới tác động của nhiệt độ sẽ gắn hữu cơ với acid mycolic và không bị mất màu, sau khi tẩy màu rồi nhuộm với xanh methylene trực khuẩn bắt màu hồng đỏ đặc trƣng cho vi khuẩn thuộc chi Nocardia [11]. 6 Luận Văn Thạc Sĩ Phan Nguyễn Minh Thư 1.
Nhuộm Gram Nhuộm Gram là phản ứng dùng để phân biệt vi khuẩn Gram dƣơng (+), hoặc Gram âm (-). Các loài thuộc chi Nocardia đều là vi khuẩn Gram dƣơng (+) nên khi quan sát dƣới kính hiển vi chúng sẽ bắt màu tím của thuốc nhuộm Gram. Phản ứng catalase Các loài thuộc chi Nocardia đều là vi sinh vật hiếu khí, có chứa chuỗi truyền điện tử cytochrome, đều có enzyme catalase, có khả năng biến dƣỡng năng lƣợng theo phƣơng thức hô hấp với oxy tạo ra H2O2. Enzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có tính độc cao này trong tế bào.
Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 đƣợc ghi nhận qua hiện tƣợng sủi bọt khí. Trên đây là một số phản ứng hóa sinh chung của vi khuẩn thuộc chi Nocardia. Ngoài ra, tùy từng loài Nocardia mà còn có phản ứng thủy phân khác nhau để phân loại và định danh chúng, ví dụ nhƣ: Các phản ứng Casein, L-tyrosine và Xanthine thủy phân để phân biệt chủng Nocardia (Bảng1.1: Một số phản ứng thủy phân để phân biệt các loài Nocardia [54] Casein thủy L-tyrosine thủy Xanthine thủy phân phân phân N. caviae - - + Streptomyces, + + + Nocardiopsis 7 Luận Văn Thạc Sĩ Phan Nguyễn Minh Thư 1.
Tổng quan về cá chim vây vàng 1. Đặc điểm cá chim vây vàng 1. Vị trí phân loại: Ngành: Vertebrata Lớp: Osteichthyes Bộ: Perciformes Họ: Carangidae Giống: Trachinotus Loài: Trachinotus blochii Lacepede, 1801 Tên tiếng anh: Snub – nose pampano Tên tiếng Việt: Cá chim vây vàng 1. Đặc điểm hình thái Cơ thể cá chim vây vàng hơi tròn, cao, dẹp chính giữa, lƣng hình vòng cung.
Trên đƣờng bên vảy sắp xếp khoảng 135 - 136 cái, chiều dài so với chiều cao 1,6 - 1,7 lần, so với chiều cao đầu 3,5 - 4 lần, cuống đuôi ngắn và dẹp, đầu nhỏ, chiều cao đầu lớn hơn chiều dài, môi tù về phía trƣớc. Hai lỗ mũi nằm gần nhau và ở môi trên: lỗ mũi trƣớc nhỏ hình tròn, lỗ mũi sau to hình bầu dục. Mép phía trƣớc xƣơng nắp mang có dạng hình cung tƣơng đối lớn, mép sau cong. Xƣơng nắp mang phía sau trơn, màng nắp mang tách rời, mỗi tia mang có 8 – 9 tơ mang ngắn.
Đầu và thân có màu trắng bạc, đỉnh đầu có màu xanh xám. Ở những cá thể trƣởng thành thỉnh thoảng có màu vàng cam đặc biệt trên cơ thể nhất là vùng miệng và nửa sau của thân. Phần đầu không có vảy, cơ thể có nhiều vảy nhỏ dính vào dƣới da. Phía trƣớc đƣờng bên có hình cung khá lớn, trên đƣờng bên vảy không có gờ.
Vây lƣng thứ 1 hƣớng về phía trƣớc, gai bằng và có 5 – 6 gai ngắn. Ở cá giống giữa các gai 12 có màng liền nhau, cá trƣởng thành màng thoái hóa thành những gai tách rời nhau. Vây lƣng thứ 2 có 1 gai và 19 – 20 tia vây, phần trƣớc của vây kéo dài hình lƣỡi liềm. Tia vây dài nhất gấp chiều dài của đầu 1,2 – 1,3 lần.
Vây hậu môn có 1 gai và 17 – 18 tia vây, phía trƣớc có hai gai ngắn. Vây hậu môn và vây lƣng thứ 2 hình dạng giống nhau, màu cam sẫm.