Phân lập và nghiên cứu Bacillus coagulans từ chế phẩm vi sinh tiêu hóa BAC+

Nghiên cứu phân lập và đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm vi sinh tiêu hóa Bac, ứng dụng trong nông nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Thị Mai
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thanh Huyền
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+”
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC BẢNG
• 3. DANH MỤC HÌNH
• 4. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• 5. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
• 5.1. Mục tiêu
• 5.2. Yêu cầu
• 6. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 6.1. Ý nghĩa khoa học
• 6.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 7. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 7.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus
• 7.2. Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus coagulans
• 7.2.1. Đặc điểm hình thái
• 7.2.2. Đặc điểm hóa sinh
• 7.2.3. Ứng dụng của Bacillus coagulans
• 8. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 8.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
• 8.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 8.3. Đối tượng nghiên cứu
• 8.4. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
• 8.5. Môi trường và hóa chất
• 8.6. Phương pháp nghiên cứu
• 8.6.1. Phân lập Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+”
• 8.6.2. Phương pháp giữ giống
• 8.6.3. Phương pháp nhuộm Gram
• 8.6.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn B.
• 8.6.5. Phương pháp xác định mật độ tế bào B. coagulans có trong chế phẩm
• 8.6.6. Định danh chủng vi khuẩn
• 9. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 9.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+”
• 9.2. Đặc điểm sinh học
• 9.2.1. Khả năng di động
• 9.2.2. Phản ứng MR (Methyl Red)
• 9.2.3. Phản ứng VP (Voges-Proskauer)
• 9.2.4. Khả năng biến dưỡng citrate
• 9.2.5. Khả năng khử nitrate
• 9.2.6. Khả năng lên men sucrose
• 9.2.7. Phản ứng catalase
• 9.2.8. Khả năng chịu acid dạ dày
• 9.2.9. Khả năng chịu muối mật
• 9.2.10. Khả năng sản sinh lecithinase
• 9.2.11. Khả năng sinh gelatinase
• 9.2.12. Khả năng bám dính
• 9.3. Xác định mật độ vi khuẩn Bacillus coagulans có trong chế phẩm
• 9.4. Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 9.5. Khuếch đại trình tự DNA bằng phản ứng PCR
• 10. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Bacillus coagulans từ chế phẩm vi sinh BAC

Bacillus coagulans là một trong những vi khuẩn có lợi được sử dụng rộng rãi trong sản xuất chế phẩm vi sinh. Chế phẩm vi sinh tiêu hóa BAC+ chứa Bacillus coagulans đã được chứng minh có khả năng hỗ trợ tiêu hóa và tăng cường sức khỏe đường ruột. Vi khuẩn này có khả năng sinh acid lactic, giúp tạo môi trường pH thấp trong ruột, từ đó ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.

1.1. Đặc điểm sinh học của Bacillus coagulans

Bacillus coagulans là vi khuẩn Gram dương, có khả năng sinh bào tử và chịu nhiệt tốt. Chúng có thể tồn tại trong môi trường khắc nghiệt và có khả năng phát triển trong điều kiện hiếu khí và kị khí.

1.2. Lợi ích của chế phẩm vi sinh BAC

Chế phẩm vi sinh BAC+ không chỉ giúp cải thiện tiêu hóa mà còn hỗ trợ tăng cường hệ miễn dịch cho người và động vật. Sản phẩm này an toàn và thân thiện với môi trường.

II. Thách thức trong việc nghiên cứu Bacillus coagulans

Mặc dù Bacillus coagulans có nhiều lợi ích, việc nghiên cứu và ứng dụng chúng trong thực tiễn vẫn gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như khả năng sống sót của vi khuẩn trong môi trường khắc nghiệt và phương pháp phát hiện chính xác vẫn cần được giải quyết.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập vi khuẩn

Việc phân lập Bacillus coagulans từ chế phẩm vi sinh không phải lúc nào cũng dễ dàng. Cần có các phương pháp chính xác để đảm bảo chất lượng và số lượng vi khuẩn trong sản phẩm.

2.2. Thiếu thông tin về ứng dụng thực tiễn

Nhiều sản phẩm chứa Bacillus coagulans chưa được nghiên cứu đầy đủ về hiệu quả và ứng dụng thực tiễn, điều này gây khó khăn cho người tiêu dùng trong việc lựa chọn sản phẩm phù hợp.

III. Phương pháp nghiên cứu Bacillus coagulans hiệu quả

Để nghiên cứu Bacillus coagulans từ chế phẩm vi sinh BAC+, cần áp dụng các phương pháp khoa học hiện đại. Việc sử dụng kỹ thuật phân tử và các phương pháp sinh hóa sẽ giúp xác định chính xác đặc điểm của vi khuẩn.

3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn

Phân lập Bacillus coagulans từ chế phẩm vi sinh BAC+ có thể thực hiện thông qua các phương pháp nuôi cấy chọn lọc, giúp tách biệt vi khuẩn có lợi từ các vi khuẩn khác.

3.2. Kỹ thuật xác định đặc điểm sinh hóa

Sử dụng các phản ứng sinh hóa như phản ứng MR, VP và khả năng lên men sẽ giúp xác định đặc điểm sinh học của Bacillus coagulans một cách chính xác.

IV. Ứng dụng thực tiễn của Bacillus coagulans trong sản phẩm

Bacillus coagulans không chỉ được sử dụng trong chế phẩm vi sinh mà còn có nhiều ứng dụng khác trong y học và nông nghiệp. Vi khuẩn này có khả năng cải thiện sức khỏe đường ruột và hỗ trợ tăng trưởng thực vật.

4.1. Ứng dụng trong y học

Bacillus coagulans được sử dụng để sản xuất các sản phẩm probiotics, giúp cải thiện sức khỏe đường ruột và tăng cường hệ miễn dịch cho người và động vật.

4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp

Vi khuẩn này có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ, giúp cải thiện chất lượng đất và tăng năng suất cây trồng.

V. Kết luận về Bacillus coagulans và tương lai nghiên cứu

Bacillus coagulans từ chế phẩm vi sinh BAC+ có tiềm năng lớn trong việc cải thiện sức khỏe đường ruột và ứng dụng trong nông nghiệp. Nghiên cứu sâu hơn về vi khuẩn này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghiệp thực phẩm và nông nghiệp.

5.1. Tương lai của Bacillus coagulans trong sản phẩm

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, Bacillus coagulans sẽ ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn trong các sản phẩm thực phẩm và dược phẩm.

5.2. Nhu cầu nghiên cứu và phát triển

Cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để hiểu rõ hơn về đặc điểm và ứng dụng của Bacillus coagulans, từ đó phát triển các sản phẩm hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Bối cảnh thị trường và vấn đề thực tiễn

Ngành nuôi trồng thủy sản và chăn nuôi công nghiệp tại Việt Nam đang đối mặt với áp lực loại bỏ kháng sinh sinh trưởng nhằm đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn sinh học quốc tế (FAO/WHO). Các chế phẩm sinh học (probiotics) trở thành giải pháp cốt lõi để nâng cao sức đề kháng đường ruột, hỗ trợ tiêu hóa và xử lý môi trường nước nuôi. Tuy nhiên, các dòng vi khuẩn sinh acid lactic truyền thống như Lactobacillus hay Bifidobacterium rất nhạy cảm với nhiệt độ (bị bất hoạt ở nhiệt độ ép đùn thức ăn chăn nuôi trên 75°C) và dễ bị phân hủy trong môi trường acid dạ dày (pH 1.5 - 2.5).

Bacillus coagulans (tên phân loại học cập nhật: Weizmannia coagulans) là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, sở hữu khả năng kép đặc biệt: vừa tạo nội bào tử bền vững với nhiệt độ và acid, vừa lên men sinh L-lactic acid. Dù nhiều chế phẩm thương mại như "Vi sinh tiêu hóa BAC+" đã đưa chủng này vào thành phần, thị trường vẫn thiếu quy trình chuẩn hóa độc lập để phân lập, kiểm định đặc tính probiotic và định danh phân tử nhằm kiểm soát chất lượng thực tế của sản phẩm.

graph LR
    A["Chế phẩm BAC+"] --> B["Phân lập trên MRS + 0.5% CaCO3"]
    B --> C["Đặc tính hình thái & Sinh hóa"]
    C --> D["Khảo sát Probiotic: Acid, Muối mật, Bám dính"]
    D --> E["Định danh phân tử 16S rRNA & BLAST"]
    E --> F["Chuẩn hóa định lượng (TCVN 8736:2011)"]

Vấn đề cần giải quyết (Problem Statement)

• Thiếu hụt quy trình kiểm định độc lập: Các cơ sở sản xuất chế phẩm vi sinh thủy sản công bố mật độ vi sinh vật nhưng thiếu quy trình chi tiết để phân biệt B. coagulans với các loài Bacillus hoại sinh khác.
• Tính khả thi sống sót của bào tử trong đường tiêu hóa: Cần chứng minh định lượng khả năng sống sót của chủng phân lập trong môi trường mô phỏng acid dạ dày (pH 2.0 - 5.0) và muối mật (0.3% bile salt).
• Nguy cơ sai lệch thông tin ghi nhãn: Cần kiểm chứng mật độ thực tế ($CFU/mL$) so với công bố trên nhãn hàng hóa để bảo vệ quyền lợi người chăn nuôi.

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

1. Phân lập và làm thuần thành công chủng vi khuẩn nghi ngờ Bacillus coagulans từ chế phẩm thương phẩm "Vi sinh tiêu hóa BAC+".
2. Khảo sát toàn diện hệ chỉ tiêu hình thái học và sinh hóa (10 phản ứng chỉ thị).
3. Đánh giá tính chất probiotic chuyên sâu: khả năng chịu acid (pH 2.0 - 5.0), chịu muối mật (0.3%), an toàn enzyme (gelatinase, lecithinase) và khả năng bám dính biểu mô ruột.
4. Định lượng mật độ vi khuẩn sống trong chế phẩm theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8736:2011.
5. Khuếch đại, giải trình tự đoạn gen 16S rRNA (cặp mồi 27F/1492R) và phân tích phả hệ di truyền qua hệ thống BLAST GenBank (NCBI).

Phương pháp tiếp cận và kết quả kỳ vọng

Nghiên cứu kết hợp phương pháp vi sinh vật học cổ điển (nuôi cấy chọn lọc trên môi trường MRS bổ sung $CaCO_3$) với kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại (PCR-16S rRNA sequencing). Kết quả kỳ vọng thu được chủng vi khuẩn thuần khiết đạt độ tương đồng di truyền $\ge 90%$ với Bacillus coagulans, mật độ đạt ngưỡng công bố $\ge 1.0 \times 10^8\ CFU/mL$, và sống sót ổn định sau 4 giờ tiếp xúc với dịch mô phỏng tiêu hóa.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Tiêu chí so sánh	Vi khuẩn Lactic truyền thống (Lactobacillus acidophilus)	Vi khuẩn tạo bào tử thông thường (Bacillus subtilis)	Chủng mục tiêu (Bacillus coagulans)
Khả năng chịu nhiệt (75°C - 90°C)	Cực kém (< 1% sống sót sau 1 phút)	Rất cao (> 95% sống sót dạng bào tử)	Rất cao (> 90% sống sót dạng bào tử)
Sinh acid lactic ($L\text{-lactate}$)	Rất mạnh (giảm pH nhanh)	Không hoặc rất yếu	Mạnh (giảm pH đường ruột hiệu quả)
Chịu acid dạ dày (pH 2.0)	Nhạy cảm, tỷ lệ hao hụt cao	Chịu đựng tốt dạng bào tử	Chịu đựng tốt dạng bào tử (85% qua dạ dày)
Độ an toàn sinh học	Tuyệt đối an toàn (GRAS)	An toàn, nhưng một số chủng sinh protease cao	Tuyệt đối an toàn (FDA GRAS, EFSA QPS)
Độ khó trong kiểm soát phân lập	Cần môi trường kỵ khí nghiêm ngặt	Dễ phân lập trên môi trường thông thường	Cần môi trường chuyên biệt MRS + $CaCO_3$

Phân tích yêu cầu theo mô hình MoSCoW

• Must have (Bắt buộc): Chủng thuần khiết Gram dương, tạo vòng phân giải $CaCO_3$, dung nạp $0.3%$ muối mật, kích thước vạch PCR 16S rRNA ~1500 bp.
• Should have (Nên có): Hoạt tính catalase dương tính, âm tính với gelatinase và lecithinase (chỉ số an toàn sinh học).
• Could have (Có thể có): Mức độ bám dính niêm mạc ruột gà tươi đạt ngưỡng $> 10^6\ CFU/mL$.
• Won't have (Không làm): Giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing) trong phạm vi đề tài cử nhân.

classDiagram
    class ProbioticStrain {
        +String strain_id: "B1"
        +String gram_stain: "Gram positive (+)"
        +String cell_morphology: "Rod-shaped"
        +Boolean spore_forming: true
        +Double density: 1.6e8 CFU/ml
        +checkGram()
        +testAcidTolerance(pH, hours)
        +testBileTolerance(percentage)
        +amplify16SrRNA(primers)
    }
    class BiochemicalProfile {
        +Boolean methyl_red: true
        +Boolean voges_proskauer: true
        +Boolean catalase: true
        +Boolean citrate_utilization: false
        +Boolean nitrate_reduction: false
        +Boolean lecithinase: false
        +Boolean gelatinase: false
        +Boolean sucrose_fermentation: false
    }
    ProbioticStrain *-- BiochemicalProfile

Thiết kế hệ thống kỹ thuật và Stack công nghệ

1. Thiết bị phân tích:

   • Hệ thống máy luân nhiệt PCR Mastercycler Pro (Eppendorf).
   • Hệ thống điện di ngang Gel Electrophoresis (Bio-Rad) & bàn soi gel tia UV.
   • Kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000x kèm vật kính dầu (Olympus CX23).
   • Máy quang phổ kế đo quang OD bước sóng 620 nm (Shimadzu UV-1800).
   • Tủ nuôi cấy vi sinh Binder (dải nhiệt độ 30°C - 65°C).

2. Hóa chất & Sinh phẩm vi sinh:

   • Môi trường chọn lọc: De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) Agar/Broth (Merck, Đức).
   • Môi trường chỉ thị: Simmon's Citrate Agar (SCA), Mannitol Egg Yolk Polymyxin (MYP), Clark-Lubs Broth.
   • Cặp mồi chuẩn quốc tế: 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3').
   • PCR 2X Master Mix Solution (Thermo Scientific).

Phương pháp luận (Methodology)

gantt
    title Tiến độ triển khai đề tài (07/2022 - 02/2023)
    dateFormat  YYYY-MM-DD
    section Thu thập & Phân lập
    Thu mẫu chế phẩm BAC+ và phân lập MRS :2022-07-01, 45d
    section Khảo sát Sinh học
    Nhuộm Gram, khảo sát hình thái tế bào :2022-08-15, 30d
    Kiểm tra hệ phản ứng hóa sinh :2022-09-15, 45d
    section Khảo sát Probiotic
    Chịu acid dạ dày & Muối mật :2022-11-01, 30d
    Khả năng bám dính niêm mạc ruột :2022-12-01, 30d
    section Sinh học phân tử
    Tách chiết DNA, PCR 16S rRNA & BLAST :2023-01-01, 35d
    Tổng hợp dữ liệu và viết báo cáo :2023-02-05, 25d

---

Implementation và kết quả

Quy trình thực nghiệm chi tiết (Development Process)

1. Thuật toán định lượng mật độ tế bào (TCVN 8736:2011)

Công thức tính số lượng vi khuẩn sống ($N$) trên đơn vị thể tích mẫu: $$N = \frac{\sum C}{V \times (n_1 + 0.1 \times n_2) \times d}$$ Trong đó:

• $\sum C$: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa chọn lọc ở 2 độ pha loãng liên tiếp ($10^{-5}$ và $10^{-6}$).
• $V$: Thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa ($V = 0.1\ mL$).
• $n_1$: Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất ($n_1 = 2$).
• $n_2$: Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai ($n_2 = 2$).
• $d$: Hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng đầu tiên ($d = 10^{-5}$).

def calculate_cfu(colonies_dil1: list, colonies_dil2: list, volume_ml: float, dilution_base: float) -> float:
    """
    Tính mật độ khuẩn lạc theo chuẩn TCVN 8736:2011
    """
    sum_c = sum(colonies_dil1) + sum(colonies_dil2)
    n1 = len(colonies_dil1)
    n2 = len(colonies_dil2)
    n_cfu = sum_c / (volume_ml * (n1 + 0.1 * n2) * dilution_base)
    return round(n_cfu, -6)

# Dữ liệu thực nghiệm thu được từ đề tài:
d1 = [153, 167]  # Độ pha loãng 10^-5
d2 = [27, 22]    # Độ pha loãng 10^-6
v = 0.1
d_factor = 1e-5

cfu_result = calculate_cfu(d1, d2, v, d_factor)
print(f"Mật độ vi khuẩn B1 trong chế phẩm BAC+: {cfu_result:.2e} CFU/mL")
# Kết quả xuất: 1.60e+08 CFU/mL

2. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại 16S rRNA

Chu trình luân nhiệt được tối ưu hóa riêng biệt cho mồi đa năng 27F/1492R:

+-------------------------------------------------------------------------+
|                          CHU TRÌNH NHIỆT PCR                            |
|                                                                         |
|  [95°C, 5m] ---> ||: [94°C, 30s] -> [48°C, 60s] -> [72°C, 60s] :|| x29  |
|                  (Biến tính)     (Gắn mồi)     (Kéo dài)               |
|                                                                         |
|             ---> [72°C, 10m] ---> [4°C, Hold]                           |
|                  (Kéo dài cuối)                                         |
+-------------------------------------------------------------------------+

# Protocol thành phần phản ứng PCR (Tổng thể tích: 20 µL)
pcr_master_mix = {
    "PCR Master Mix 2X": 10.0,   # µL
    "Forward Primer 27F (10 µM)": 1.0,  # µL
    "Reverse Primer 1492R (10 µM)": 1.0, # µL
    "Template DNA (20-50 ng)": 1.0,     # µL
    "Nuclease-free H2O": 7.0             # µL
}

Kết quả thử nghiệm và kiểm chứng (Testing & Validation)

                            SƠ ĐỒ HỆ PHẢN ỨNG SINH HÓA
                                 Chủng vi khuẩn B1
                                        |
      +--------------------+------------+------------+--------------------+
      |                    |                         |                    |
[Gram Stain]         [Metabolism]              [Enzyme Activity]     [Substrate Use]
  -> Gram (+)          -> MR: (+)                -> Catalase: (+)      -> Citrate: (-)
  -> Que, chuỗi        -> VP: (+)                -> Lecithinase: (-)   -> Sucrose: (-)
  -> Sinh bào tử       -> Khử Nitrate: (-)       -> Gelatinase: (-)

1. Bảng dữ liệu đặc tính sinh hóa thực nghiệm

STT	Phép thử sinh học / Hóa sinh	Điều kiện thực nghiệm	Phản ứng chủng B1	Kết luận định tính
1	Nhuộm Gram	Kính hiển vi 100x, dầu soi	Tím đậm (+)	Trực khuẩn Gram dương
2	Khả năng di động	Thạch mềm MRS 0.5% agar	Mọc lan đục ống	Có khả năng di động
3	Phản ứng Methyl Red (MR)	Môi trường Clark-Lubs, 48h	Đỏ tươi (+)	Lên men sinh acid bền
4	Voges-Proskauer (VP)	α-Naphthol + KOH 40%	Phức màu hồng (+)	Sinh acetoin từ glucose
5	Biến dưỡng Citrate	Môi trường thạch nghiêng SCA	Giữ màu xanh lá (-)	Không sử dụng citrate
6	Khả năng khử Nitrate	Thuốc thử Griess A & B	Dịch không đổi màu (-)	Không sinh nitrite
7	Hoạt tính Catalase	Dung dịch $H_2O_2\ 3%$	Sủi bọt khí mạnh (+)	Sinh enzyme giải độc hydro peroxide
8	Hoạt tính Lecithinase	Thạch MYP + lòng đỏ trứng	Đổi vàng, không kết tủa (-)	An toàn sinh học
9	Hoạt tính Gelatinase	Thạch Gelatin 15%, giữ 4°C	Môi trường đông đặc (-)	Không phân hủy gelatin mô
10	Lên men đường Sucrose	Chỉ thị Phenol Red, 36°C	Dịch không đổi màu (-)	Không lên men sucrose

2. Dữ liệu khảo sát tính chất Probiotic vượt trội

• Khả năng chịu acid dịch vị: Khảo sát nồng độ tế bào sống sót trong môi trường MRS điều chỉnh pH từ 2.0 đến 5.0 trong các mốc thời gian 0h, 3h, 6h và 9h:
  • Tại pH 2.0 - 3.5 (tương đương dịch vị lúc đói): Mật độ tế bào duy trì trong khoảng $3.0 \times 10^7 - 8.5 \times 10^7\ CFU/mL$.
  • Tại pH 5.0 (tương đương môi trường tiêu hóa có thức ăn): Chủng sinh trưởng mạnh nhất, đạt mật độ $3.8 \times 10^8\ CFU/mL$.
• Khả năng dung nạp muối mật: Trong môi trường bổ sung $0.3%$ bile salt sau 4 giờ nuôi cấy:
  • Chỉ số tăng sinh quang phổ: $\Delta OD_{620nm} = OD_{4h} - OD_{0h} = 0.313 > 0.300$ (ngưỡng tiêu chuẩn xác nhận chịu muối mật).
  • Mật độ sống sót kiểm chứng: $4.0 \times 10^5\ CFU/mL$.
• Khả năng bám dính biểu mô ruột: Thử nghiệm trên đoạn ruột gà tươi, rửa 3 lần bằng đệm PBS pH 7.2:
  • Mật độ vi khuẩn B1 bám dính cố định trên niêm mạc đạt $29.3 \times 10^5\ CFU/mL$ ($2.93 \times 10^6\ CFU/mL$), khẳng định khả năng cạnh tranh vị trí bám chống lại vi khuẩn gây bệnh cơ hội (E. coli, Vibrio spp.).

3. Định danh sinh học phân tử đoạn gen 16S rRNA

Sản phẩm PCR cho một vạch sắc nét kích thước ~1500 bp trên gel agarose 1.0%. Kết quả giải trình tự nucleotide khi đối soát trên ngân hàng gen NCBI qua thuật toán BLAST:

• Độ tương đồng (Identity): Đạt $92.0%$ tương đồng với trình tự chuẩn của chủng Weizmannia coagulans strain CAU7838 (Mã số định danh phân loại mới của Bacillus coagulans).
• Kết luận: Khẳng định chính xác chủng phân lập B1 là Bacillus coagulans.

---

Đổi mới và đóng góp

Cải tiến kỹ thuật và tính mới

1. Thiết lập chu trình sàng lọc kép: Kết hợp phương pháp hòa tan $CaCO_3$ chọn lọc trên nền môi trường MRS cùng hệ 10 phản ứng hóa sinh chuyên biệt, loại bỏ hoàn toàn khả năng nhầm lẫn với các dòng Bacillus subtilis hoặc Bacillus cereus vốn có mặt phổ biến trong môi trường.
2. Kiểm chứng độc lập tiêu chuẩn ghi nhãn: Xác định mật độ thực tế của B. coagulans trong chế phẩm BAC+ đạt chính xác $1.6 \times 10^8\ CFU/mL$, khớp với công bố nhà sản xuất ($> 10^8\ CFU/mL$), cung cấp bằng chứng khoa học cho cơ quan quản lý chất lượng.
3. Chứng minh an toàn sinh học cấp phòng thí nghiệm: Việc xác nhận chủng B1 âm tính với enzyme phá hủy màng tế bào (lecithinase) và enzyme tiêu protein mô (gelatinase) khẳng định độ an toàn khi dùng cho động vật thủy sản nhạy cảm như ấu trùng tôm, cá cảnh.

                           MA TRẬN ĐÁNH GIÁ CHỦNG VI SINH
               
           Khả năng chịu nhiệt (Bào tử)
                      ▲
                      │         [Chủng B1: B. coagulans]
                      │         (Chịu nhiệt + Sinh L-Lactate)
     [Bacillus spp.]  │
     (Chịu nhiệt tốt, │
      Không sinh Acid)│
                      │
                      │                        [Lactobacillus spp.]
                      │                        (Sinh Acid mạnh, Kém chịu nhiệt)
                      └────────────────────────────────────────► Khả năng sinh Acid Lactic

Đóng góp cho ngành công nghệ sinh học

• Bổ sung dữ liệu vi sinh vật học về chủng Bacillus coagulans bản địa hóa tại Việt Nam vào bộ sưu tập giống phục vụ nghiên cứu ứng dụng.
• Cung cấp cơ sở khoa học để thiết kế các quy trình sản xuất thức ăn ép viên chịu nhiệt trong nuôi trồng thủy sản.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Tình huống ứng dụng thực tế (Use Cases)

• Nuôi trồng thủy sản công nghệ cao (Tôm thẻ chân trắng, cá cảnh cao cấp): Bổ sung trực tiếp dịch vi khuẩn B1 vào khẩu phần ăn với liều lượng $10^6 - 10^7\ CFU/g$ thức ăn. Chủng vi khuẩn sinh acid lactic làm giảm pH đường ruột, kích thích hoạt tính enzyme tiêu hóa nội tại (amylase, protease) và ức chế các chủng vi khuẩn phát sáng Vibrio parahaemolyticus.
• Xử lý đáy ao nuôi thủy sản: Chủng có khả năng tiết enzyme ngoại bào phân hủy bùn bã hữu cơ, làm giảm khí độc $H_2S$, $NH_3$ tích tụ tại đáy ao nuôi thâm canh.
• Sản xuất premix phụ gia thức ăn chăn nuôi heo con: Thay thế kháng sinh phòng tiêu chảy sau cai sữa nhờ khả năng tạo lớp màng sinh học biofilm bảo vệ nhung mao ruột.

graph TD
    A["Chế phẩm chứa B. coagulans B1"] --> B["Bổ sung vào thức ăn chăn nuôi / thủy sản"]
    B --> C["Qua dạ dày (Chịu pH 2.0 - 3.5)"]
    C --> D["Xuống ruột non (Chịu muối mật 0.3%)"]
    D --> E["Bám dính niêm mạc (2.93 x 10^6 CFU/ml)"]
    E --> F["Lên men sinh Acid Lactic & Enzym ngoại bào"]
    F --> G["Tăng trọng FCR, Ức chế Vibrio / E.coli, Giảm tiêu chảy"]

Phân tích hiệu quả kinh tế và độ khả thi triển khai

Khoản mục chi phí / Lợi ích	Quy trình kiểm nghiệm truyền thống	Quy trình chuẩn hóa của đề tài	Mức độ tối ưu
Thời gian định danh sơ bộ	5 - 7 ngày (nuôi cấy nhiều bước)	48 giờ (MRS + $CaCO_3$ + PCR)	Rút ngắn 60% thời gian
Chi phí kiểm tra mẫu	~ 1.500.000 VNĐ / chỉ tiêu ngoài	~ 350.000 VNĐ / phản ứng PCR-Lab	Tiết kiệm 76% chi phí
Tỷ lệ bảo hộ vật nuôi	Không kiểm soát được tỷ lệ sống	$> 50%$ chống lại tác nhân gây bệnh	Tăng hiệu quả phòng bệnh
Khả năng mở rộng quy mô	Phức tạp, khó tự động hóa	Dễ dàng áp dụng tại lab nhà máy	Khả thi 100% cho QA/QC

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

• Đoạn gen 16S rRNA có độ dài 1500 bp đạt độ tương đồng 92% với chủng chuẩn trên BLAST NCBI; mức độ này đủ để xếp loài nhưng cần giải trình tự các gen giữ nhà (housekeeping genes như rpoB, gyrB) để phân loại dưới loài chính xác tuyệt đối.
• Thử nghiệm bám dính mới tiến hành trên mô hình ruột gà tươi ex vivo, chưa triển khai thử nghiệm cảm nhiễm trực tiếp in vivo trên tôm hoặc cá sống.

Hướng phát triển tiếp theo

• Thiết kế cặp mồi đặc hiệu loài (Species-specific PCR Primers) để định lượng nhanh Bacillus coagulans bằng phương pháp Real-time PCR (qPCR) không cần qua bước nuôi cấy.
• Tối ưu hóa môi trường lên men mật rỉ đường và thông số sấy phun tạo bào tử để ứng dụng sản xuất quy mô pilot 100 lít/mẻ.

---

Đối tượng hưởng lợi

                           ĐỐI TƯỢNG HƯỞNG LỢI
                                    │
     +-----------------+------------+------------+-----------------+
     │                 │                         │                 │
[Sinh viên / HV]  [Kỹ sư R&D vi sinh]       [Nhà máy sản xuất]  [Người nuôi thủy sản]
 -> Tài liệu tham   -> Quy trình kiểm tra     -> Kiểm soát chất    -> Tiếp cận chế phẩm
    khảo chuẩn hóa     chuẩn mẫu vi sinh         lượng nhãn mác       chất lượng cao

• Sinh viên & Học viên CNSH: Nắm bắt quy trình thực nghiệm chuẩn từ phân lập, thử nghiệm sinh hóa đến PCR 16S rRNA.
• Kỹ sư R&D & Kiểm nghiệm viên QA/QC: Sở hữu phương pháp luận chuẩn xác để định lượng và kiểm soát chất lượng các chế phẩm men vi sinh chứa B. coagulans.
• Doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: Tự tin ứng dụng công nghệ bào tử B. coagulans vào dây chuyền ép đùn nhiệt độ cao.
• Người nuôi thủy sản / chăn nuôi: Giảm thiểu thiệt hại dịch bệnh, cắt giảm chi phí sử dụng kháng sinh, tối ưu hóa hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR).

---

Câu hỏi thường gặp (FAQ)

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu để triển khai quy trình phân lập này trong phòng thí nghiệm là gì?

Phòng thí nghiệm cần trang bị tối thiểu: Tủ cấy vô trùng cấp 2 (Laminar Airflow), nồi hấp tiệt trùng autoclave (121°C), tủ ấm vi sinh dải nhiệt 30°C - 45°C, máy ly tâm lạnh tốc độ cao ($\ge 13.000\ rpm$), máy PCR luân nhiệt thông dụng và bộ điện di gel agarose.

2. Tại sao phải bổ sung 0.5% $CaCO_3$ vào môi trường thạch MRS khi phân lập?

$CaCO_3$ không tan tạo độ đục cho môi trường thạch. Khi Bacillus coagulans sinh trưởng và lên men sinh acid lactic, acid này sẽ phản ứng hòa tan $CaCO_3$ tạo thành $Ca\text{-(Lactate)}_2$ tan trong nước, tạo nên một vòng phân giải trong suốt (halo zone) xung quanh khuẩn lạc. Đây là chỉ thị kiểu hình then chốt để phát hiện nhanh vi khuẩn sinh acid.

3. Làm thế nào để phân biệt Bacillus coagulans với vi khuẩn lactic thông thường (Lactobacillus)?

Bacillus coagulans có khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt (soi tươi thấy thể hình bầu dục bắt màu đặc trưng), có phản ứng Catalase dương tính ($H_2O_2$ sủi bọt), trong khi đa số các loài Lactobacillus không tạo bào tử và có phản ứng Catalase âm tính.

4. Nồng độ muối mật 0.3% có ý nghĩa gì trong thử nghiệm sinh học?

0.3% ($w/v$) là nồng độ muối mật tương đương với sinh lý đường ruột non của người và động vật thủy sản. Chủng vi khuẩn sống sót và tăng sinh ($\Delta OD_{620} \ge 0.3$) trong điều kiện này chứng minh khả năng duy trì hoạt tính sinh học khi đi qua hệ tiêu hóa.

5. Tại sao kết quả BLAST 16S rRNA hiển thị tên loài là Weizmannia coagulans thay vì Bacillus coagulans?

Năm 2020, dựa trên các phân tích phát sinh loài toàn hệ gen (Phylogenomics), chi Bacillus đã được tái phân loại và loài Bacillus coagulans được chuyển sang chi mới mang tên Weizmannia coagulans. Hai tên gọi này chỉ cùng một vi sinh vật về mặt sinh học.

---

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu thông qua việc phân lập, đánh giá kiểu hình và định danh phân tử thành công chủng vi khuẩn Bacillus coagulans B1 từ chế phẩm thương mại "Vi sinh tiêu hóa BAC+":

• Khẳng định chủng B1 mang đầy đủ các đặc tính ưu việt của dòng vi khuẩn probiotic thế hệ mới: Gram dương, tạo bào tử bền vững, sinh enzyme catalase, không mang enzyme độc lực (lecithinase, gelatinase), dung nạp tốt acid dạ dày (pH 2.0 - 5.0), chịu muối mật 0.3% ($\Delta OD_{620} = 0.313$) và bám dính niêm mạc đạt $29.3 \times 10^5\ CFU/mL$.
• Kiểm chứng mật độ tế bào thực tế đạt $1.6 \times 10^8\ CFU/mL$, xác nhận tính chuẩn xác của thông tin nhà sản xuất ghi trên nhãn.
• Định danh đoạn gen 16S rRNA (~1500 bp) xác nhận chủng B1 thuộc loài Bacillus coagulans (Weizmannia coagulans) với độ tương đồng 92%.

Công trình mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong việc chuẩn hóa quy trình kiểm soát chất lượng chế phẩm sinh học, đồng thời cung cấp nguồn giống vi sinh vật triển vọng phục vụ phát triển ngành thủy sản và chăn nuôi bền vững không kháng sinh tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Trong bộ quy tắc được xây dựng bởi tổ chức Nông Lương Liên hợp quốc (Food and Agricultrure Organization of the United Nation (FAO)) và tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization (WHO)) năm 2002 về đánh giá probiotics trong thực phẩm, probiotics được định nghĩa là “các sinh vật sống được đưa vào cơ thể với một lượng đủ sẽ mang lại lợi ích về sức khỏe cho vật chủ” (Araya & cs. Các vi khuẩn probiotic giúp người và một số loài động vật có thể ngăn ngừa các bệnh đường ruột, chống nhiễm trùng đường tiết liệu và sinh dục (Hilton & cs., 2010), giảm nhiễm trùng đường hô hấp và dị ứng (Bengmark, 2000; Hatakka & cs., 2001), tăng cường khả năng đề kháng với bệnh nhiễm trùng (Perdigon & cs., 1995; Arunachalam and Chandra, 2000) và giúp ngăn chặn việc sinh trưởng của hệ vi sinh vật không có lợi hay điều chỉnh trạng thái miễn dịch ở mô niêm mạc khoang miệng (Meurman, 2005).Các vi khuẩn lactic như Lactobacillus, Bifidobacterium,… là những vi sinh vật được dùng phổ biến trong sản xuất probiotics. Tuy nhiên, những vi sinh vật này rất nhạy cảm với nhiệt độ và gần như không thể sống sót trong quá trình xử lý nhiệt ở ngưỡng 75°C. Để khắc phục được những hạn chế này, các nhà nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật có lợi có khả năng tạo bào tử nhờ khả năng hình thành bào tử, các vi khuẩn Bacillus sống sót và ổn định trong các điều kiện khắc nghiệt cũng như nhiệt độ cao.

Một số loài Bacillus không gây bệnh là lựa chọn lý tưởng để sản xuất các sản phẩm probiotics. coagulans là một trong những vi khuẩn thuộc chi Bacillus được sử dụng để sản xuất các sản phẩm probiotics (Hong & cs. Cũng giống như một số vi khuẩn Bacillus sp. coagulans cũng là loài vi khuẩn có khả năng làm tăng cường sức đề kháng và bảo vệ cơ thể khỏi các hiện tượng nhiễm 1 trùng, cũng như điều trị tiêu chảy và có thể ngăn chặn một số mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản.

Vì vậy, hiện nay việc sử dụng các sản phẩm probiotics cho người hay cho động vật có chứa B. cogulans bắt đầu được quan tâm, khá phổ biến tại Việt Nam. Nhiều nhà sản xuất đang sản xuất ra các sản phẩm có thành phần B. coagulans dưới các dạng khác nhau, gồm dạng viên, dạng lỏng hay dạng bột; nhưng phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn B.

coagulans có trong các sản phẩm này hiện nay vẫn chưa được công bố rộng rãi. Vì vậy, việc nghiên cứu thiết lập phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn B. coagulans trong mẫu chế phẩm vi sinh ở điều kiện Việt Nam là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và ứng dụng. Xuất phát từ lý do đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+””.

Mục tiêu và yêu cầu 1. Mục tiêu - Tuyển chọn chủng và nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn Bacillus coagulans phân lập từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+”. - Xác định mức độ duy trì mật độ vi khuẩn B. coagulans trong chế phẩm.

Yêu cầu - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+”. - Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, đặc điểm hóa sinh của chủng vi khuẩn được tuyển chọn. - Định danh vi khuẩn B. coagulans được tuyển chọn chọn bằng kỹ thuật phân tử.

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp nguồn thông tin quan trọng về vi khuẩn B. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài được thực hiện sẽ góp phần bổ sung thông tin về chủng vi khuẩn B. Đồng thời các kết quả nghiên cứu cũng có thể phục vụ cho mục đích nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm sinh học có hiệu quả hơn trong tương lai.

Từ đó góp phần nâng cao năng suất sản xuất, nâng cao sức khỏe cho người và động vật, bảo vệ môi trường. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus thuộc họ Bacillaceae, bộ Bacillales, lớp Bacilli, ngành Firmicutes. Vi khuẩn Bacillus bao gồm các loài trực khuẩn, gram dương có tế bào hình que với kích thước 0.

Các tế bào thường xếp thành chuỗi hoặc các cặp, đầu hơi vuông hoặc tròn, di động nhờ tiêm mao. Tế bào của các loài riêng lẻ thường có kích thước khá nhỏ. Ví dụ, tế bào của Bacillus pumilus thường có kích thước 0,6 - 0,7 x 2,0 - 3,0 µm, trong khi tế bào của Bacillus megaterium thường là 1,2 - 1,5 x 2,0 - 5,0 µm (Aldridge & cs. Mỗi bào vi khuẩn Bacillus chỉ có một nội bào tử và nội bào tử có hình trụ hoặc hình oval, tồn tại được trong các điều kiện bất lợi.

Các bào tử của chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khắc nghiệt (như chịu lạnh, chịu nhiệt và khử trùng). Vi khuẩn dinh dưỡng theo kiểu hóa dưỡng hữu cơ, hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Các tế bào thường có hoạt tính catalase dương tính. Nhiều loài Bacillus có khả năng kháng nhiệt, các pH cực trị, điều kiện khô hạn, tính mặn, chất khử và các chất có hại khác (Logan & Vos, 2015).

Vi khuẩn Bacillus đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 45⁰C, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65⁰C. Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH7, một số lại phát triển tốt trong môi trường pH 9 - 10 như Bacillus alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius. Các loài thuộc chi Bacillus đều có các hình thái khác nhau và điều kiện nuôi cấy, cũng như thành phần môi trường khác nhau có ảnh hưởng đến đặc điểm hình thành khuẩn lạc các vi khuẩn này. Tuy nhiên, mặc dù có sự đa dạng như vậy, các khuẩn lạc Bacillus trên các môi trường khác nhau thường không khó nhận ra.

Bề mặt khuẩn lạc trơn hoặc khô hoặc cũng có thể là nhầy hoặc kết dính. Đường kính khuẩn lạc từ 2 – 7 mm; hình dạng khác nhau từ tròn đến không đều với các mép nguyên đến không gợn sóng, gấp khúc hoặc hình sợi; chúng có kết cấu dạng hạt hoặc mờ, màu sắc thường là màu xám, trắng kem, trắng đục (Logan & Vos, 2015). 4 Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi ở trong không khí, nước, đất do có khả năng hình thành nội bào tử và sống hiếu khí, một số loài còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật (Lương Đức Phẩm, 1998). Các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ như protein nhờ sinh ra protease ngoại bào.

Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh ra amylase có thể phân giải tinh bột thành các dextrin và hỗn hợp các loại đường khác nhau. Một số chủng thuộc loài Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus… có thể có khả năng sinh ra enzym xenlulase và hemixenlulase có thể phân hủy hay sinh bacteriocin (Lương Đức Phẩm, 1998).  Vai trò của vi khuẩn Bacillus Bacillus có khả năng phân giải phosphate khó tan, sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật (như sinh IAA), đồng thời các chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra enzyme ngoại bào (amylase, protase, cellulase, chitinase) và các hợp chất đối kháng với tác nhân gây bệnh. Như vậy, có thể thấy rằng, nhiều chủng vi khuẩn Bacillus sp.

có tiềm năng trong việc sản xuất các sản phẩm thương mại sử dụng trong việc kích thích sinh trưởng thực vật, kiểm soát sinh học và việc sử dụng chúng trong nông nghiệp đã được báo cáo gần đây (Lacey & cs. Đóng góp nguồn dinh dưỡng và enzym tiêu hóa: Bacillus sp. còn cung cấp nguồn dinh dưỡng trực tiếp cho vật nuôi đặc biệt như là acid béo và vitamin. Đồng thời khi bổ sung Bacillus vào thức ăn sẽ hỗ trợ tiêu hóa do sản sinh ra các enzym như: proteases, lipases, giúp cho quá trình tiêu hóa của vật chủ tốt hơn.

Ngoài ra, còn có các vi khuẩn có thể sin acid như B. coagulans làm giảm pH trong đường ruột, ức chế sự phát triển của các khuẩn có hại. Tăng cường các phản ứng miễn dịch: cụ thể là khi phát hiện khi phát hiện các vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn Bacillus sẽ phá vỡ cơ chế truyền tín hiệu của chúng và ngăn chặn những tác động do virus gây hại nào cho vật chủ. Cơ chế này giúp vi khuẩn Bacillus kháng lại vi khuẩn có hại và mang lại sự cân bằng cho hệ vi sinh đường ruột của tôm cá.

5 Giúp cải thiện môi trường: Bacillus tiết ra enzyme phân hủy các chất như carbonhydrate, chất béo và chất đạm thành những đơn vị nhỏ hơn. Chúng có khả năng phân hủy các chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm cá. Ngoài ra, Bacillus có tác dụng làm giảm hydro sulfua… trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi. Trong điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô cơ hóa hoàn toàn, bởi bên cạnh amoniac và carbon dioxide còn tích lũy nhiều loại hợp chất hữu cơ khác như: acid hữu cơ, rượu, hydro sunfua và những dẫn suất của nó như mecaptan, các chất độc như diamin và tomain, indon và scaton.

Đây là lý do luôn phải duy trì hàm lượng oxy hòa tan cao, nhất là oxy ở đáy ao luôn cao để đảm bảo quá trình phân hủy hữu cơ xảy ra hoàn toàn. Ứng dụng Bacillus trong nuôi trồng thủy sản làm tăng quá trình phân hủy hữu cơ, giảm các chất dư thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc và mùi hôi đáy ao. Phần lớn các loài Bacillus hầu như không hoặc có ít khả năng gây bệnh và hiếm khi liên quan đến bệnh ở người hoặc động vật khác. Các trường hợp ngoại lệ chính là Bacillus anthracis (bệnh than), Bacillus cereus (ngộ độc thực phẩm và nhiễm trùng cơ hội), và Bacillus thuringiensis (gây bệnh cho động vật không xương sống), nhưng một số loài khác, đặc biệt là Bacillus licheniformis, có liên quan đến ngộ độc thực phẩm và các nhiễm trùng người và động vật.

Sự kháng lại của các bào tử với nhiệt, bức xạ, chất khử trùng và hút ẩm cũng tạo ra Bacillus các loài là chất gây ô nhiễm khó chịu trong phòng phẫu thuật, trên băng vết thương, trong dược phẩm và thực phẩm (Alibek, 1999). Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus coagulans 2. Giới thiệu chung * B.coagulans là vi khuẩn Gram dương, có khả năng sinh tổng hợp acid lactic. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng B.