Đặt vấn đề Trong bộ quy tắc được xây dựng bởi tổ chức Nông Lương Liên hợp quốc (Food and Agricultrure Organization of the United Nation (FAO)) và tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization (WHO)) năm 2002 về đánh giá probiotics trong thực phẩm, probiotics được định nghĩa là “các sinh vật sống được đưa vào cơ thể với một lượng đủ sẽ mang lại lợi ích về sức khỏe cho vật chủ” (Araya & cs. Các vi khuẩn probiotic giúp người và một số loài động vật có thể ngăn ngừa các bệnh đường ruột, chống nhiễm trùng đường tiết liệu và sinh dục (Hilton & cs., 2010), giảm nhiễm trùng đường hô hấp và dị ứng (Bengmark, 2000; Hatakka & cs., 2001), tăng cường khả năng đề kháng với bệnh nhiễm trùng (Perdigon & cs., 1995; Arunachalam and Chandra, 2000) và giúp ngăn chặn việc sinh trưởng của hệ vi sinh vật không có lợi hay điều chỉnh trạng thái miễn dịch ở mô niêm mạc khoang miệng (Meurman, 2005).Các vi khuẩn lactic như Lactobacillus, Bifidobacterium,… là những vi sinh vật được dùng phổ biến trong sản xuất probiotics. Tuy nhiên, những vi sinh vật này rất nhạy cảm với nhiệt độ và gần như không thể sống sót trong quá trình xử lý nhiệt ở ngưỡng 75°C. Để khắc phục được những hạn chế này, các nhà nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật có lợi có khả năng tạo bào tử nhờ khả năng hình thành bào tử, các vi khuẩn Bacillus sống sót và ổn định trong các điều kiện khắc nghiệt cũng như nhiệt độ cao.
Một số loài Bacillus không gây bệnh là lựa chọn lý tưởng để sản xuất các sản phẩm probiotics. coagulans là một trong những vi khuẩn thuộc chi Bacillus được sử dụng để sản xuất các sản phẩm probiotics (Hong & cs. Cũng giống như một số vi khuẩn Bacillus sp. coagulans cũng là loài vi khuẩn có khả năng làm tăng cường sức đề kháng và bảo vệ cơ thể khỏi các hiện tượng nhiễm 1 trùng, cũng như điều trị tiêu chảy và có thể ngăn chặn một số mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản.
Vì vậy, hiện nay việc sử dụng các sản phẩm probiotics cho người hay cho động vật có chứa B. cogulans bắt đầu được quan tâm, khá phổ biến tại Việt Nam. Nhiều nhà sản xuất đang sản xuất ra các sản phẩm có thành phần B. coagulans dưới các dạng khác nhau, gồm dạng viên, dạng lỏng hay dạng bột; nhưng phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn B.
coagulans có trong các sản phẩm này hiện nay vẫn chưa được công bố rộng rãi. Vì vậy, việc nghiên cứu thiết lập phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn B. coagulans trong mẫu chế phẩm vi sinh ở điều kiện Việt Nam là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và ứng dụng. Xuất phát từ lý do đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+””.
Mục tiêu và yêu cầu 1. Mục tiêu - Tuyển chọn chủng và nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn Bacillus coagulans phân lập từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+”. - Xác định mức độ duy trì mật độ vi khuẩn B. coagulans trong chế phẩm.
Yêu cầu - Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus coagulans từ chế phẩm “Vi sinh tiêu hóa BAC+”. - Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, đặc điểm hóa sinh của chủng vi khuẩn được tuyển chọn. - Định danh vi khuẩn B. coagulans được tuyển chọn chọn bằng kỹ thuật phân tử.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp nguồn thông tin quan trọng về vi khuẩn B. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài được thực hiện sẽ góp phần bổ sung thông tin về chủng vi khuẩn B. Đồng thời các kết quả nghiên cứu cũng có thể phục vụ cho mục đích nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm sinh học có hiệu quả hơn trong tương lai.
Từ đó góp phần nâng cao năng suất sản xuất, nâng cao sức khỏe cho người và động vật, bảo vệ môi trường. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus thuộc họ Bacillaceae, bộ Bacillales, lớp Bacilli, ngành Firmicutes. Vi khuẩn Bacillus bao gồm các loài trực khuẩn, gram dương có tế bào hình que với kích thước 0.
Các tế bào thường xếp thành chuỗi hoặc các cặp, đầu hơi vuông hoặc tròn, di động nhờ tiêm mao. Tế bào của các loài riêng lẻ thường có kích thước khá nhỏ. Ví dụ, tế bào của Bacillus pumilus thường có kích thước 0,6 - 0,7 x 2,0 - 3,0 µm, trong khi tế bào của Bacillus megaterium thường là 1,2 - 1,5 x 2,0 - 5,0 µm (Aldridge & cs. Mỗi bào vi khuẩn Bacillus chỉ có một nội bào tử và nội bào tử có hình trụ hoặc hình oval, tồn tại được trong các điều kiện bất lợi.
Các bào tử của chúng có khả năng tồn tại ở điều kiện khắc nghiệt (như chịu lạnh, chịu nhiệt và khử trùng). Vi khuẩn dinh dưỡng theo kiểu hóa dưỡng hữu cơ, hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Các tế bào thường có hoạt tính catalase dương tính. Nhiều loài Bacillus có khả năng kháng nhiệt, các pH cực trị, điều kiện khô hạn, tính mặn, chất khử và các chất có hại khác (Logan & Vos, 2015).
Vi khuẩn Bacillus đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 - 45⁰C, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65⁰C. Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH7, một số lại phát triển tốt trong môi trường pH 9 - 10 như Bacillus alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius. Các loài thuộc chi Bacillus đều có các hình thái khác nhau và điều kiện nuôi cấy, cũng như thành phần môi trường khác nhau có ảnh hưởng đến đặc điểm hình thành khuẩn lạc các vi khuẩn này. Tuy nhiên, mặc dù có sự đa dạng như vậy, các khuẩn lạc Bacillus trên các môi trường khác nhau thường không khó nhận ra.
Bề mặt khuẩn lạc trơn hoặc khô hoặc cũng có thể là nhầy hoặc kết dính. Đường kính khuẩn lạc từ 2 – 7 mm; hình dạng khác nhau từ tròn đến không đều với các mép nguyên đến không gợn sóng, gấp khúc hoặc hình sợi; chúng có kết cấu dạng hạt hoặc mờ, màu sắc thường là màu xám, trắng kem, trắng đục (Logan & Vos, 2015). 4 Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi ở trong không khí, nước, đất do có khả năng hình thành nội bào tử và sống hiếu khí, một số loài còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật (Lương Đức Phẩm, 1998). Các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ như protein nhờ sinh ra protease ngoại bào.
Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh ra amylase có thể phân giải tinh bột thành các dextrin và hỗn hợp các loại đường khác nhau. Một số chủng thuộc loài Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus… có thể có khả năng sinh ra enzym xenlulase và hemixenlulase có thể phân hủy hay sinh bacteriocin (Lương Đức Phẩm, 1998). Vai trò của vi khuẩn Bacillus Bacillus có khả năng phân giải phosphate khó tan, sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật (như sinh IAA), đồng thời các chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra enzyme ngoại bào (amylase, protase, cellulase, chitinase) và các hợp chất đối kháng với tác nhân gây bệnh. Như vậy, có thể thấy rằng, nhiều chủng vi khuẩn Bacillus sp.
có tiềm năng trong việc sản xuất các sản phẩm thương mại sử dụng trong việc kích thích sinh trưởng thực vật, kiểm soát sinh học và việc sử dụng chúng trong nông nghiệp đã được báo cáo gần đây (Lacey & cs. Đóng góp nguồn dinh dưỡng và enzym tiêu hóa: Bacillus sp. còn cung cấp nguồn dinh dưỡng trực tiếp cho vật nuôi đặc biệt như là acid béo và vitamin. Đồng thời khi bổ sung Bacillus vào thức ăn sẽ hỗ trợ tiêu hóa do sản sinh ra các enzym như: proteases, lipases, giúp cho quá trình tiêu hóa của vật chủ tốt hơn.
Ngoài ra, còn có các vi khuẩn có thể sin acid như B. coagulans làm giảm pH trong đường ruột, ức chế sự phát triển của các khuẩn có hại. Tăng cường các phản ứng miễn dịch: cụ thể là khi phát hiện khi phát hiện các vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn Bacillus sẽ phá vỡ cơ chế truyền tín hiệu của chúng và ngăn chặn những tác động do virus gây hại nào cho vật chủ. Cơ chế này giúp vi khuẩn Bacillus kháng lại vi khuẩn có hại và mang lại sự cân bằng cho hệ vi sinh đường ruột của tôm cá.
5 Giúp cải thiện môi trường: Bacillus tiết ra enzyme phân hủy các chất như carbonhydrate, chất béo và chất đạm thành những đơn vị nhỏ hơn. Chúng có khả năng phân hủy các chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm cá. Ngoài ra, Bacillus có tác dụng làm giảm hydro sulfua… trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi. Trong điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô cơ hóa hoàn toàn, bởi bên cạnh amoniac và carbon dioxide còn tích lũy nhiều loại hợp chất hữu cơ khác như: acid hữu cơ, rượu, hydro sunfua và những dẫn suất của nó như mecaptan, các chất độc như diamin và tomain, indon và scaton.
Đây là lý do luôn phải duy trì hàm lượng oxy hòa tan cao, nhất là oxy ở đáy ao luôn cao để đảm bảo quá trình phân hủy hữu cơ xảy ra hoàn toàn. Ứng dụng Bacillus trong nuôi trồng thủy sản làm tăng quá trình phân hủy hữu cơ, giảm các chất dư thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc và mùi hôi đáy ao. Phần lớn các loài Bacillus hầu như không hoặc có ít khả năng gây bệnh và hiếm khi liên quan đến bệnh ở người hoặc động vật khác. Các trường hợp ngoại lệ chính là Bacillus anthracis (bệnh than), Bacillus cereus (ngộ độc thực phẩm và nhiễm trùng cơ hội), và Bacillus thuringiensis (gây bệnh cho động vật không xương sống), nhưng một số loài khác, đặc biệt là Bacillus licheniformis, có liên quan đến ngộ độc thực phẩm và các nhiễm trùng người và động vật.
Sự kháng lại của các bào tử với nhiệt, bức xạ, chất khử trùng và hút ẩm cũng tạo ra Bacillus các loài là chất gây ô nhiễm khó chịu trong phòng phẫu thuật, trên băng vết thương, trong dược phẩm và thực phẩm (Alibek, 1999). Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus coagulans 2. Giới thiệu chung * B.coagulans là vi khuẩn Gram dương, có khả năng sinh tổng hợp acid lactic. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng B.