Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Bối cảnh thực tiễn và lý do chọn đề tài
Theo định nghĩa của Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công bố năm 2002, probiotics là các vi sinh vật sống mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ khi được bổ sung với số lượng đầy đủ. Các vi khuẩn probiotic truyền thống thuộc nhóm vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium...) thường có nhược điểm lớn là mẫn cảm với nhiệt độ, hầu như không sống sót qua quá trình xử lý nhiệt ở ngưỡng 75°C. Để khắc phục hạn chế này, các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt và chống chịu điều kiện khắc nghiệt đã được đẩy mạnh ứng dụng. Trong đó, Bacillus coagulans là loài đặc biệt khi mang đồng thời các đặc tính của chi Bacillus (tạo bào tử bền nhiệt, bền acid) và đặc tính của nhóm vi khuẩn lactic (lên men sinh acid lactic, tạo môi trường pH thấp ức chế vi khuẩn gây bệnh).
Tại Việt Nam, các sản phẩm probiotics chứa B. coagulans được lưu hành thương mại dưới nhiều dạng (dung dịch, viên nang, bột) dùng cho người, vật nuôi và thủy sản (như chế phẩm "Vi sinh tiêu hóa BAC+" dùng cho cá cảnh, tôm, tép). Tuy nhiên, các quy trình chuẩn hóa về phát hiện, tuyển chọn, đánh giá đặc tính sinh học và định lượng chính xác mật độ vi khuẩn B. coagulans trong các chế phẩm thương mại còn hạn chế và chưa được công bố rộng rãi. Do đó, việc nghiên cứu phân lập, khảo sát đặc tính sinh học và định danh B. coagulans từ chế phẩm thương mại là yêu cầu thực tiễn cấp thiết.
Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu:
- Tuyển chọn chủng và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus coagulans phân lập từ chế phẩm "Vi sinh tiêu hóa BAC+".
- Xác định mức độ duy trì mật độ vi khuẩn B. coagulans thực tế có trong chế phẩm.
Yêu cầu và nhiệm vụ cụ thể:
- Phân lập và làm thuần chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus coagulans từ chế phẩm "Vi sinh tiêu hóa BAC+".
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc và các đặc tính sinh hóa, sinh lý (khả năng di động, phản ứng MR, VP, citrate, nitrate, catalase, gelatinase, lecithinase, lên men sucrose, khả năng chịu acid, chịu muối mật, khả năng bám dính niêm mạc ruột).
- Xác định mật độ tế bào B. coagulans sống trong chế phẩm theo phương pháp đếm khuẩn lạc.
- Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn ở cấp độ phân tử thông qua kỹ thuật khuếch đại gen 16S rRNA bằng phản ứng PCR và đối chiếu dữ liệu giải trình tự trên GenBank.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn Bacillus coagulans hiện diện trong mẫu thương mại của chế phẩm sinh học "Vi sinh tiêu hóa BAC+".
- Phạm vi thời gian: Từ tháng 07/2022 đến tháng 02/2023.
- Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khung lý thuyết và phân loại học
Khóa luận áp dụng hệ thống phân loại học vi khuẩn theo Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (tái bản lần 2, 2001) đối với loài Bacillus coagulans:
- Giới: Bacteria
- Ngành: Firmicutes
- Lớp: Bacilli
- Bộ: Bacillales
- Họ: Bacillaceae
- Chi: Bacillus
- Loài: Bacillus coagulans
Khung lý thuyết về tiêu chuẩn probiotic đường ruột bao gồm khả năng sống sót qua hàng rào acid dạ dày (pH 2,0–5,0), dung nạp muối mật (0,3% bile salts), khả năng bám dính vào biểu mô ruột và tính an toàn sinh học (không sinh độc tố gelatinase, lecithinase).
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
Khóa luận sử dụng các phương pháp thực nghiệm vi sinh vật và sinh học phân tử chuẩn hóa:
- Phương pháp phân lập và giữ giống: Pha loãng mẫu chế phẩm theo dải nồng độ thập phân ($10^{-1}$ đến $10^{-5}$), cấy trang $100\ \mu\text{l}$ trên môi trường thạch De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) có bổ sung $0,5%\ \text{CaCO}_3$, ủ $30^\circ\text{C}$ trong 24–48 giờ. Giữ giống trên thạch nghiêng MRS ở $4^\circ\text{C}$ và bảo quản sâu trong dung dịch glycerol 30% ở $-80^\circ\text{C}$.
- Phương pháp khảo sát hình thái: Nhuộm Gram (sử dụng dung dịch tím gentian, lugol, cồn $96^\circ$, dung dịch fuchsin) và quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại $\times 100$ có dầu soi.
- Phương pháp khảo sát đặc tính sinh lý - sinh hóa:
- Khả năng di động: Cấy đâm xuyên trên môi trường MRS thạch mềm chứa $0,5%$ agar, ủ $30^\circ\text{C}$, đọc kết quả sau 24 giờ.
- Phản ứng Methyl Red (MR) và Voges-Proskauer (VP): Nuôi cấy trong môi trường Clark – Lubs ở $30^\circ\text{C}$ từ 2–3 ngày; thử MR bằng chỉ thị methyl red; thử VP bằng chỉ thị VP và dung dịch $\text{NaOH}\ 40%$.
- Khả năng biến dưỡng citrate: Nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng Simmon’s Citrate Agar (SCA) ở $30^\circ\text{C}$ trong 24–48 giờ.
- Khả năng khử nitrate: Nuôi cấy trong môi trường Nitrate Broth 24 giờ ở $30^\circ\text{C}$, thử nghiệm bằng thuốc thử Griess A và Griess B.
- Khả năng lên men sucrose: Môi trường bổ sung $10%$ sucrose và chất chỉ thị phenol red, ủ $36^\circ\text{C}$ trong 1–3 ngày.
- Phản ứng Catalase: Nhỏ trực tiếp dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2\ 3%$ lên sinh khối vi khuẩn tươi trên lam kính, quan sát sủi bọt khí.
- Khả năng chịu acid dạ dày: Nuôi cấy dịch vi khuẩn trong môi trường MRS lỏng có dải pH hiệu chỉnh từ 2,0 đến 5,0; đo độ đục quang học ($\text{OD}_{620\text{nm}}$) và xác định mật độ CFU/ml tại các thời điểm 0h, 3h, 6h, 9h.
- Khả năng chịu muối mật: Nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng bổ sung $0,3%$ muối mật ở $30^\circ\text{C}$ trong 4 giờ; đánh giá thông qua độ biến thiên mật độ quang ($\Delta\text{OD}{620\text{nm}} = \text{OD}{4\text{h}} - \text{OD}_{0\text{h}} \ge 0,3$).
- Khả năng sinh lecithinase: Cấy trên môi trường thạch MYP (Mannitol Egg Yolk Polymyxin) chứa nhũ tương lòng đỏ trứng gà và chất chỉ thị phenol red.
- Khả năng sinh gelatinase: Nuôi cấy trong môi trường gelatin ($15\ \text{g/l}$ gelatin), ủ $37^\circ\text{C}$ trong 48 giờ và ủ lạnh $4^\circ\text{C}$ để kiểm tra hiện tượng hóa lỏng gelatin.
- Khả năng bám dính biểu mô ruột: Thử nghiệm trên mẫu niêm mạc ruột gà tươi đã qua xử lý đệm PBS; ủ dịch tế bào vi khuẩn ở $37^\circ\text{C}$ trong 90 phút, rửa loại tạp và đếm mật độ tế bào bám dính thông qua cấy trang dịch rửa.
- Phương pháp định lượng mật độ vi sinh vật: Thực hiện theo quy chuẩn TCVN 8736:2011, đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng trên các đĩa ở hai độ pha loãng liên tiếp ($10^{-5}$ và $10^{-6}$) để tính trị số $N\ (\text{CFU/ml})$.
- Phương pháp sinh học phân tử:
- Tách chiết DNA tổng số theo quy trình sử dụng phenol:chloroform:isoamylalcohol ($25:24:1$) và kết tủa bằng ethanol lạnh.
- Phản ứng PCR khuếch đại phân đoạn gen 16S rRNA với cặp mồi phổ biến $27\text{F}$ ($5'\text{-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'}$) và $1492\text{R}$ ($5'\text{-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'}$).
- Kiểm tra sản phẩm qua điện di thạch agarose, giải trình tự nucleotide và so sánh độ đồng nhất bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).
Nội dung chính theo từng chương
Tổng quan tài liệu
Chương này tổng hợp cơ sở lý thuyết về chi Bacillus và loài Bacillus coagulans:
- Phân tích các đặc điểm phân loại học, hình thái, cấu trúc nội bào tử hình bầu dục nằm ở cực tế bào giúp vi khuẩn sống sót trong điều kiện cực hạn (chịu nhiệt, chịu pH thấp, bền với dịch dạ dày).
- Lịch sử phát hiện từ năm 1915 bởi B. Hammer (phân lập từ sữa hỏng), từng được định danh là Lactobacillus sporogenes vào năm 1935 do có khả năng sinh acid lactic, trước khi được xếp chính thức vào chi Bacillus trong Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.
- Đánh giá vai trò của B. coagulans trong các ứng dụng: y học (cải thiện hệ vi sinh đường ruột, sinh chuỗi acid béo ngắn SCFAs, sản sinh chất xơ sinh học/biofilm phòng chống táo bón), nuôi trồng thủy sản (tăng cường miễn dịch cho tôm cá, tiết enzyme protease, amylase, lipase, ức chế vi khuẩn gây bệnh) và chăn nuôi gia súc, gia cầm (giảm tỷ lệ tiêu chảy ở heo con cai sữa, cải thiện hệ số chuyển hóa thức ăn FCR).
Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Trình bày chi tiết toàn bộ vật liệu, hóa chất, thiết bị và quy trình kỹ thuật thực hiện tại phòng thí nghiệm:
- Chi tiết nguồn mẫu: Chế phẩm "Vi sinh tiêu hóa BAC+".
- Thành phần môi trường nuôi cấy và thử nghiệm sinh hóa: Môi trường MRS, Clark – Lubs, SCA, Nitrate Broth, MYP, môi trường thử gelatinase, đệm PBS.
- Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA:
- Giai đoạn biến tính ban đầu: $95^\circ\text{C}$ trong 5 phút.
- 29 chu kỳ lặp lại gồm: tách mạch ($94^\circ\text{C}$ trong 30 giây), gắn mồi ($48^\circ\text{C}$ trong 1 phút), kéo dài mạch ($72^\circ\text{C}$ trong 1 phút).
- Giai đoạn kéo dài kết thúc: $72^\circ\text{C}$ trong 10 phút.
Kết quả và thảo luận
Chương này trình bày toàn bộ số liệu thu được từ các thực nghiệm phân lập, khảo sát sinh học và phân tích phân tử:
- Phân lập thành công một chủng vi khuẩn thuần khiết ký hiệu là B1 từ chế phẩm. Chủng tạo khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, mép nguyên, hình thành vòng phân giải $\text{CaCO}_3$ rõ rệt sau 12 giờ nuôi cấy.
- Quan sát vi thể xác định B1 là trực khuẩn hình que ngắn, Gram dương ($+$), đứng đơn lẻ, xếp đôi hoặc tạo chuỗi.
- Kết quả khảo sát các đặc tính sinh hóa và sinh lý học của chủng B1:
| Chỉ tiêu khảo sát |
Điều kiện / Thuốc thử |
Kết quả chủng B1 |
Ý nghĩa sinh học |
| Nhuộm Gram |
Tím gentian, lugol, cồn, fuchsin |
$+$ |
Trực khuẩn Gram dương |
| Khả năng di động |
Thạch mềm $0,5%$ agar |
$+$ |
Vi khuẩn mọc lan rộng, làm đục môi trường |
| Phản ứng MR |
Clark – Lubs, Methyl Red |
$+$ |
Lên men glucose tạo acid hỗn hợp bền |
| Phản ứng VP |
Clark – Lubs, $\alpha$-naphthol, NaOH |
$+$ |
Sinh acetoin trong quá trình chuyển hóa |
| Biến dưỡng citrate |
Thạch nghiêng SCA |
$-$ |
Không sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất |
| Khử nitrate |
Nitrate broth, thuốc thử Griess |
$-$ |
Không khử $\text{NO}_3^-$ thành $\text{NO}_2^-$ |
| Phản ứng Catalase |
Dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2\ 3%$ |
$+$ |
Có enzyme catalase phân giải $\text{H}_2\text{O}_2$, giải độc tế bào |
| Lên men sucrose |
Môi trường $10%$ sucrose, phenol red |
$-$ |
Không lên men tạo acid từ đường sucrose |
| Sinh Lecithinase |
Thạch MYP, nhũ tương lòng đỏ trứng |
$-$ |
Lên men mannitol (đổi vàng), không phân giải lecithin |
| Sinh Gelatinase |
Môi trường gelatin $15\ \text{g/l}$ |
$-$ |
Không làm hóa lỏng gelatin ở $4^\circ\text{C}$ (an toàn sinh học) |
- Khả năng chịu acid dạ dày: Chủng B1 thể hiện sức sống bền vững ở dải pH 2,0–5,0 trong suốt 9 giờ theo dõi; sinh trưởng tốt nhất ở pH 5,0; mật độ tế bào duy trì trong khoảng $3 \times 10^7$ đến $3,8 \times 10^8\ \text{CFU/ml}$.
- Khả năng chịu muối mật: Nuôi cấy trong môi trường chứa $0,3%$ muối mật sau 4 giờ cho kết quả $\Delta\text{OD}_{620\text{nm}} = 0,313$ (đạt tiêu chuẩn dung nạp $> 0,3$), mật độ tế bào đạt $4 \times 10^5\ \text{CFU/ml}$.
- Khả năng bám dính niêm mạc ruột: Mật độ vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột gà thu được từ dịch rửa đạt $29,3 \times 10^5\ \text{CFU/ml}$ ở độ pha loãng $10^{-4}$.
- Định lượng mật độ tế bào trong chế phẩm:
| Độ pha loãng |
Số lượng khuẩn lạc đĩa 1 |
Số lượng khuẩn lạc đĩa 2 |
Thể tích cấy ($V$) |
Mật độ tính toán ($N$) |
| $10^{-5}$ |
153 |
167 |
$0,1\ \text{ml}$ |
$1,6 \times 10^8\ \text{CFU/ml}$ |
| $10^{-6}$ |
27 |
22 |
$0,1\ \text{ml}$ |
|
Mật độ tính toán $1,6 \times 10^8\ \text{CFU/ml}$ hoàn toàn tương thích và đạt chuẩn so với chỉ tiêu công bố của nhà sản xuất trên nhãn chế phẩm "Vi sinh tiêu hóa BAC+".
- Định danh sinh học phân tử: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA hiển thị vạch điện di sắc nét tại kích thước khoảng $1500\ \text{bp}$. Kết quả so sánh trình tự bằng công cụ BLAST trên GenBank (NCBI) xác định chủng B1 có độ tương đồng $92%$ với loài Weizmannia coagulans strain CAU7838 (danh pháp đồng nghĩa hiện đại của Bacillus coagulans), xác nhận chủng phân lập chính là Bacillus coagulans.
Kết luận và kiến nghị
- Tổng kết các kết quả thực nghiệm về hình thái, sinh hóa, khả năng chống chịu stress sinh học, định lượng và định danh phân tử của chủng B1.
- Đưa ra các khuyến nghị nghiên cứu mở rộng về hệ thống mồi đặc hiệu và quy trình tiêu chuẩn hóa phát hiện cho các chế phẩm vi sinh thương phẩm khác.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm
- Phân lập thành công chủng vi khuẩn Bacillus coagulans B1 từ chế phẩm "Vi sinh tiêu hóa BAC+" có hoạt tính phân giải $\text{CaCO}_3$.
- Xác định đầy đủ hồ sơ sinh hóa của chủng B1: Gram ($+$), di động ($+$), MR ($+$), VP ($+$), Catalase ($+$), Citrate ($-$), Nitrate ($-$), Gelatinase ($-$), Lecithinase ($-$), Sucrose ($-$).
- Chứng minh các đặc tính probiotic ưu việt của chủng B1:
- Sống sót ở môi trường acid pH 2,0–5,0 trong 9 giờ, đạt mật độ $3 \times 10^7 - 3,8 \times 10^8\ \text{CFU/ml}$.
- Chịu nồng độ muối mật $0,3%$ với chỉ số tăng trưởng $\Delta\text{OD}_{620\text{nm}} = 0,313$ và mật độ sống sót đạt $4 \times 10^5\ \text{CFU/ml}$ sau 4 giờ.
- Khả năng bám dính niêm mạc ruột đạt $29,3 \times 10^5\ \text{CFU/ml}$.
- Định lượng chính xác mật độ B. coagulans sống trong chế phẩm thương mại đạt $1,6 \times 10^8\ \text{CFU/ml}$, kiểm chứng sự trung thực về chất lượng công bố của nhà sản xuất.
- Khuếch đại thành công đoạn gen 16S rRNA kích thước $\sim 1500\ \text{bp}$ và định danh chính xác loài bằng đối chiếu BLAST (độ tương đồng $92%$ với Weizmannia coagulans strain CAU7838).
Đóng góp học thuật và thực tiễn
- Bổ sung dữ liệu khoa học thực nghiệm về đặc tính sinh học, khả năng dung nạp môi trường khắc nghiệt và đặc điểm phân tử của các chủng B. coagulans lưu hành trong các chế phẩm thương phẩm tại Việt Nam.
- Thiết lập quy trình phân lập, kiểm tra sinh hóa và định lượng mật độ vi sinh vật khả thi, có thể áp dụng trong công tác kiểm soát chất lượng chế phẩm sinh học phục vụ nuôi trồng thủy sản và chăn nuôi.
Kiến nghị của tác giả
- Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện các thí nghiệm sinh hóa chuyên sâu để phân biệt nhanh các biến chủng B. coagulans.
- Thiết kế và ứng dụng các cặp mồi PCR đặc hiệu loài nhằm nhận diện trực tiếp các gen chức năng đặc trưng của B. coagulans mà không cần thông qua giải trình tự toàn phần 16S rRNA.
- Mở rộng phương pháp phát hiện và định lượng B. coagulans trên nhiều dạng bào chế khác nhau (viên nang, bột đông khô, hỗn dịch men tiêu hóa).
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế: Nghiên cứu chỉ tập trung trên 01 mẫu chế phẩm thương mại ("Vi sinh tiêu hóa BAC+") và phân lập được 01 chủng đơn lẻ (B1); độ tương đồng BLAST đạt $92%$, cần thêm các cặp mồi chuyên biệt hoặc giải trình tự đa vùng để tối ưu hóa độ phân giải phân loại; các thử nghiệm bám dính niêm mạc mới thực hiện in vitro trên mẫu ruột gà tươi, chưa triển khai thử nghiệm in vivo trên động vật thủy sản (tôm, cá).
- Hướng nghiên cứu tiếp: Thiết kế mồi Real-time PCR định lượng trực tiếp không qua nuôi cấy; đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro đối với các vi khuẩn gây bệnh thủy sản cụ thể (Vibrio, Aeromonas); nghiên cứu động học lên men và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất sinh khối bào tử quy mô phòng thí nghiệm.
Giá trị tham khảo
- Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh học ứng dụng, Thú y, Nuôi trồng Thủy sản và Công nghệ Thực phẩm.
- Nội dung tham khảo giá trị:
- Quy trình phân lập chọn lọc vi khuẩn sinh acid lactic tạo bào tử trên môi trường thạch $\text{MRS} + \text{CaCO}_3$.
- Bộ quy trình thử nghiệm đánh giá các chỉ tiêu probiotic (in vitro): thử nghiệm chịu acid dạ dày nhiều mức pH theo thời gian, đo mức độ tăng trưởng trong muối mật $0,3%$, và kỹ thuật đánh giá bám dính trên biểu mô ruột tươi.
- Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn Gram dương sinh bào tử bằng phenol:chloroform và chu trình nhiệt PCR khuếch đại gen 16S rRNA.
Câu hỏi thường gặp
1. Vì sao việc phân lập Bacillus coagulans lại sử dụng môi trường MRS bổ sung $0,5%\ \text{CaCO}_3$?
Bacillus coagulans có đặc tính sinh lý đặc biệt là lên men sinh acid lactic (tương tự vi khuẩn lactic). Acid sinh ra sẽ phản ứng hòa tan bột đá vôi $\text{CaCO}_3$ không tan trong thạch, tạo thành một vòng phân giải trong suốt (halo zone) bao quanh khuẩn lạc sau 12–24 giờ, giúp phân biệt và tuyển chọn chính xác khuẩn lạc mục tiêu giữa các vi sinh vật khác.
2. Kết quả kiểm tra tính an toàn sinh học của chủng B1 qua phản ứng gelatinase và lecithinase như thế nào?
Chủng B1 cho kết quả âm tính ($-$) với cả hai enzyme ngoại bào này: không làm hóa lỏng môi trường gelatin ở $4^\circ\text{C}$ (không phân giải gelatin) và không tạo vòng phân giải lecithinase xung quanh khuẩn lạc trên môi trường thạch lòng đỏ trứng MYP. Điều này chứng minh chủng vi khuẩn không mang độc lực phá hủy mô và an toàn để làm chế phẩm sinh học.
3. Khả năng dung nạp muối mật của chủng vi khuẩn B1 được đánh giá qua chỉ số nào và đạt kết quả ra sao?
Khả năng chịu muối mật được đánh giá thông qua mức tăng mật độ quang sau 4 giờ nuôi cấy trong môi trường $\text{MRS} + 0,3%$ muối mật ở bước sóng $620\ \text{nm}$ ($\Delta\text{OD}{620\text{nm}} = \text{OD}{4\text{h}} - \text{OD}{0\text{h}}$). Chủng B1 đạt $\Delta\text{OD}{620\text{nm}} = 0,313$ (vượt ngưỡng tiêu chuẩn quy ước $\ge 0,3$) và duy trì mật độ tế bào sống đạt $4 \times 10^5\ \text{CFU/ml}$.
4. Mật độ vi khuẩn Bacillus coagulans định lượng được trong chế phẩm "Vi sinh tiêu hóa BAC+" là bao nhiêu?
Theo công thức tính chuẩn TCVN 8736:2011 trên hai độ pha loãng liên tiếp $10^{-5}$ (153 và 167 khuẩn lạc) và $10^{-6}$ (27 và 22 khuẩn lạc), mật độ xác định được là $1,6 \times 10^8\ \text{CFU/ml}$, hoàn toàn trùng khớp với chỉ tiêu chất lượng ghi trên nhãn bao bì sản phẩm.
5. Cặp mồi và thông số chu kỳ nhiệt nào được sử dụng để định danh chủng vi khuẩn B1?
Khóa luận sử dụng cặp mồi phổ biến $27\text{F}$ và $1492\text{R}$ khuếch đại gen 16S rRNA. Chu kỳ nhiệt thực hiện gồm biến tính $95^\circ\text{C}$ (5 phút); 29 chu kỳ gồm tách mạch $94^\circ\text{C}$ (30 giây), gắn mồi đặc hiệu ở $48^\circ\text{C}$ (1 phút), kéo dài $72^\circ\text{C}$ (1 phút); và kết thúc kéo dài ở $72^\circ\text{C}$ trong 10 phút, tạo ra phân đoạn khuếch đại có độ dài khoảng $1500\ \text{bp}$.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Mai đã phân lập thành công chủng vi khuẩn Bacillus coagulans B1 từ chế phẩm thương mại "Vi sinh tiêu hóa BAC+" và chứng minh chủng sở hữu đầy đủ các đặc tính probiotic quan trọng bao gồm khả năng chịu acid (pH 2,0–5,0), dung nạp muối mật $0,3%$, bám dính niêm mạc ruột và an toàn sinh học. Mật độ tế bào sống trong chế phẩm được định lượng chính xác ở mức $1,6 \times 10^8\ \text{CFU/ml}$, phù hợp với công bố của nhà sản xuất. Đồng thời, kết quả khuếch đại phân đoạn gen 16S rRNA kích thước $\sim 1500\ \text{bp}$ và đối chiếu BLAST với độ tương đồng $92%$ đã khẳng định vững chắc vị trí phân loại của chủng phân lập thuộc loài Bacillus coagulans.
