Luận án TS. Phạm Văn Kiền: Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba Kích

Luận án tiến sĩ Dược học nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba Kích (Radix Morindae Officinalis), gồm phương pháp định tính, định lượng mới.

• Tác giả: Phạm Văn Kiền
• Người hướng dẫn: PGS. Đoàn Cao Sơn
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
• Đề tài: Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba Kích (Radix Morindae officinalis) của Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis)
• 1.1.1. Vị trí phân loại của Ba kích
• 1.1.2. Đặc điểm hình thái
• 1.1.3. Phân bố, thu hái, chế biến
• 1.1.4. Thành phần hoá học
• 1.1.5. Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích
• 1.2. Monotropein và nystose
• 1.3. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose
• 1.3.1. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose trên thế giới và tại Việt Nam
• 1.3.2. Phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ Ba kích
• 1.4. Phương pháp phân tích trình tự ADN trong định danh loài Morinda officinalis How
• 1.4.1. Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật
• 1.4.2. Phương pháp khuếch đại gen (PCR)
• 1.4.3. Các trình tự gen thường dùng cho thực vật
• 1.4.4. Nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Morinda officinalis How
• 1.5. Tính cấp thiết của luận án
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương tiện nghiên cứu
• 2.2.1. Chất chuẩn và dược liệu chuẩn
• 2.2.2. Hóa chất và thuốc thử
• 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose
• 2.3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích
• 2.3.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose
• 2.3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN
• 2.3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính, định lượng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Xây dựng, thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose
• 3.1.1. Xây dựng, thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein
• 3.1.2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose
• 3.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu rễ Ba kích bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
• 3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích
• 3.2.1. Chiết xuất cao chiết toàn phần chứa monotropein và nystose
• 3.2.2. Phân lập và tinh chế monotropein
• 3.2.3. Phân lập và tinh chế nystose
• 3.2.4. Xác định bộ dữ liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn
• 3.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose
• 3.3.1. Thiết lập chất chuẩn monotropein
• 3.3.2. Thiết lập chất chuẩn nystose
• 3.4. Định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích
• 3.5. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN
• 3.5.1. Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu
• 3.5.2. Nhân bản đoạn gen
• 3.5.3. Giải trình tự gen và định danh dược liệu
• 3.6. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính và định lượng
• 3.6.1. Bổ sung các chỉ tiêu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam
• 3.6.2. Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam VI
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose
• 4.1.1. Phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích
• 4.1.2. Phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích
• 4.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu bằng TLC
• 4.2. Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích
• 4.2.1. Chiết cao toàn phần
• 4.2.2. Phân lập, tinh chế monotropein
• 4.2.3. Phân lập, tinh chế nystose
• 4.2.4. Xác minh cấu trúc monotropein và nystose tinh chế được
• 4.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose
• 4.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN
• 4.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính, định lượng
• 4.5.1. Bổ sung chỉ tiêu định tính
• 4.5.2. Bổ sung chỉ tiêu định lượng
• Những đóng góp mới của luận án
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Dược liệu Rễ Ba Kích Việt Nam

Rễ ba kích (Radix Morindae officinalis) là một dược liệu quý trong y học cổ truyền Việt Nam, được sử dụng rộng rãi trong các công thức điều trị. Nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ ba kích là một bước quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm dược phẩm. Loài Morinda officinalis How có đặc điểm hình thái rõ ràng với rễ màu nâu sẫm, có mùi thơm đặc trưng. Việc nâng cấp tiêu chuẩn này dựa trên nghiên cứu sâu về thành phần hóa học, đặc biệt là monotropein và nystose - hai hợp chất quan trọng quyết định chất lượng. Luận án tiến sĩ của Phạm Văn Kiền tại Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2021 đã thực hiện công trình này với sự hỗ trợ từ các viện kiểm nghiệm thuốc hàng đầu.

1.1. Phân loại và Đặc điểm Hình thái

Ba kích thuộc họ Rubiaceae, là dược liệu có giá trị trong tiêu chuẩn chất lượng dược phẩm Việt Nam. Rễ có tính chất ấm và công dụng bổ thận theo lý thuyết y học cổ truyền. Đặc điểm ngoài là rễ hình trụ, dễ bị nứt ngang, mặt ngoài màu nâu đỏ. Tinh thể axit oxalic được tìm thấy trong tế bào, giúp định danh đơn vị giải phẫu.

1.2. Phân bố và Thu Hái

Rễ ba kích phân bố chủ yếu ở miền Nam Việt Nam, đặc biệt tại các tỉnh có điều kiện khí hậu nhiệt đới. Quá trình thu hái cần thực hiện vào mùa đông khi hàm lượng hoạt chất cao nhất. Nâng cấp tiêu chuẩn đòi hỏi thu hái từ những cây lớn hơn 3-4 năm tuổi để đảm bảo chất lượng.

II. Thành Phần Hóa Học và Tiêu Chuẩn Chất Lượng

Thành phần hóa học của rễ ba kích cực kỳ phong phú, với hơn 100 hợp chất được xác định. Các chất quan trọng nhất là monotropein và nystose - hai iridoid glucoside có hoạt tính sinh học cao. Nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu yêu cầu định lượng chính xác các hợp chất này bằng phương pháp sắc ký lỏng cao hiệu năng (HPLC). Ngoài ra, dược liệu còn chứa polysaccharide, phenol, flavonoid và các chất béo. Tiêu chuẩn hiện tại trong Dược điển Việt Nam cần được cập nhật để phản ánh chính xác hàm lượng monotropein tối thiểu và các chỉ tiêu kiểm định khác nhằm đảm bảo hiệu quả dược lý.

2.1. Monotropein và Nystose Hoạt Chất Chính

Monotropein là iridoid glucoside chính có tác dụng bổ thận, tráng yang. Nystose là disaccharide với hoạt tính miễn dịch cao. Cả hai hợp chất đều có khả năng chống oxy hóa và kích thích tế bào miễn dịch. Phương pháp xác định được nâng cấp bằng HPLC với độ chính xác cao hơn 95%.

2.2. Phương Pháp Định Lượng Hiện Đại

Nâng cấp tiêu chuẩn sử dụng sắc ký lỏng HPLC để định lượng monotropein và nystose. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng cho định tính nhanh trong kiểm định. Các điều kiện tối ưu hóa giúp giảm thời gian phân tích và tăng độ lặp lại kết quả.

III. Phân Lập và Tinh Chế Chất Chuẩn

Quy trình phân lập monotropein và nystose từ dược liệu rễ ba kích Việt Nam là yêu cầu cốt lõi của nâng cấp tiêu chuẩn. Công nghệ chiết xuất cao chiết được thực hiện trên các mẫu dược liệu chuẩn được xác minh bằng mã vạch ADN. Sau đó, sử dụng sắc ký cột với các dung môi thích hợp để phân lập từng hợp chất riêng biệt. Quy trình tinh chế bao gồm kết tinh và xác định cấu trúc bằng phương pháp NMR, MS và IR. Các chất chuẩn monotropein và nystose được thiết lập theo tiêu chuẩn quốc tế, có độ tinh khiết trên 98% được xác nhận bằng HPLC. Bộ dữ liệu này trở thành tài liệu tham khảo chính thức cho kiểm định dược liệu trên toàn quốc.

3.1. Chiết Xuất và Phân Lập

Chiết xuất cao chiết toàn phần từ rễ ba kích bằng ethanol 70% ở nhiệt độ kiểm soát. Cao chiết được cục bộ hóa bằng sắc ký cột silica gel, sử dụng gradient dung môi chloroform-methanol. Phân lập monotropein cho hợp chất tinh khiết màu trắng, phân lập nystose cho sản phẩm dạng bột trắng. Mỗi chất chuẩn được xác thực bằng các phương pháp phổ.

3.2. Xác Nhận Cấu Trúc Chất Chuẩn

Xác nhận cấu trúc sử dụng phổ NMR 1H, 13C với dung môi D2O và CDCl3. Phổ MS được ghi nhận để xác định khối lượng phân tử chính xác. Phổ IR xác nhận các nhóm chức năng iridoid. Kết quả xác nhận độ tinh khiết trên 98% theo HPLC chứng minh chất chuẩn có chất lượng cao.

IV. Ứng Dụng Mã Vạch ADN và Nâng Cấp Dược Điển

Định danh dược liệu rễ ba kích bằng mã vạch ADN là công nghệ hiện đại trong nâng cấp tiêu chuẩn. Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) được sử dụng để khuếch đại các đoạn gen ITS1, ITS2 và matK đặc trưng cho loài Morinda officinalis How. Các trình tự ADN này được so sánh với cơ sở dữ liệu quốc tế NCBI, giúp phát hiện giả dược và dây dối thương mại. Kết quả nghiên cứu đã được nâng cấp vào Dược điển Việt Nam, bao gồm các chỉ tiêu định tính, định lượng, thử nghiệm độc chất và điều kiện bảo quản. Tiêu chuẩn mới quy định hàm lượng monotropein tối thiểu 0,8% và nystose tối thiểu 0,5%, cùng các yêu cầu về độ ẩm, tro, vi sinh vật gây hại. Công trình này góp phần nâng cao vị thế quốc tế của dược liệu Việt Nam trên thị trường toàn cầu.

4.1. Kỹ Thuật Mã Vạch ADN

Mã vạch ADN sử dụng các vùng matK, rbcL, ITS1, ITS2 để định danh chính xác Morinda officinalis. Phương pháp PCR khuếch đại ADN tổng từ mẫu dược liệu, sau đó trình tự hóa bằng công nghệ Sanger. Kết quả được so sánh với cơ sở dữ liệu BOLD, NCBI để xác minh độ tương đồng trên 99%. Phương pháp này phát hiện giả dược hiệu quả cao.

4.2. Cập Nhật Dược Điển Việt Nam

Nâng cấp tiêu chuẩn được chính thức ghi vào Dược điển Việt Nam bổ sung với hàm lượng monotropein tối thiểu 0,8% và nystose tối thiểu 0,5%. Các chỉ tiêu định tính bao gồm phản ứng với phenol, phối trộn với ethanol. Tiêu chuẩn vi sinh vật gây hại, tro nội tiết, ẩm độ được quy định rõ ràng. Tiêu chuẩn mới được công nhân rộng rãi bởi các cơ sở sản xuất dược phẩm, nâng chất lượng sản phẩm rễ ba kích Việt Nam lên tầm quốc tế.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu khoa học về tiêu chuẩn hóa dược liệu đóng vai trò nền tảng trong việc bảo đảm hiệu quả điều trị và an toàn của các sản phẩm thuốc cổ truyền. Luận án tiến sĩ dược học "Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) của Việt Nam" do Nghiên cứu sinh Phạm Văn Kiền thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Đoàn Cao Sơn và PGS. Bùi Hồng Cường (thuộc Đề tài Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước mã số CNHD.075/16-18), đã giải quyết triệt để bài toán kiểm soát chất lượng của một trong những vị thuốc quý hàng đầu trong hệ thống y dược học cổ truyền.

Thực trạng phân tích cho thấy một khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi: "Chuyên luận Ba kích trong Dược điển Việt Nam V mới chỉ có một số chỉ tiêu cơ bản về mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, chưa có chỉ tiêu định lượng thành phần hóa học" (Dược điển Việt Nam V, 2017). Trong khi nhu cầu thị trường đối với rễ Ba kích ngày càng gia tăng và tình trạng nhầm lẫn, pha trộn với các loài thuộc chi Morinda hoặc các chi lân cận diễn ra phức tạp, hệ thống kiểm nghiệm quốc gia hoàn toàn thiếu vắng các chuẩn đối chiếu hóa học đơn chất trong nước. Sự phụ thuộc vào nguồn chuẩn ngoại nhập từ Sigma-Aldrich hay Chemfaces với chi phí đắt đỏ ($45 - $290 USD/lọ quy cách 5 mg - 25 mg) cùng thời gian nhập khẩu kéo dài (6 - 8 tuần) đã tạo ra rào cản nghiêm trọng cho công tác kiểm nghiệm thường quy.

Luận án đã xác lập và thực thi thành công ba câu hỏi và mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và thiết lập bộ dữ liệu phân tích toàn diện cho 02 chất chuẩn hóa học đối chiếu gồm monotropein (đại diện nhóm iridoid) và nystose (đại diện nhóm oligosaccharid) từ dược liệu rễ Ba kích Việt Nam theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).
2. Xây dựng và tối ưu hóa hệ thống nhận diện, định danh sinh học phân tử cho dược liệu rễ Ba kích thông qua kỹ thuật giải trình tự mã vạch ADN (DNA barcoding) trên các chỉ thị gen nhân và lạp thể.
3. Nâng cấp toàn diện chuyên luận dược liệu rễ Ba kích dự thảo cho Dược điển Việt Nam VI thông qua việc tích hợp các chỉ tiêu định tính và định lượng hóa học hiện đại bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diod (HPLC-DAD) và đầu dò tán xạ bay hơi (HPLC-ELSD).

Về mặt phạm vi nghiên cứu, đề tài được triển khai trên tập mẫu dược liệu rễ Ba kích trên 3 năm tuổi thu thập tại 6 vùng sinh thái trọng điểm của miền Bắc và miền Trung Việt Nam (mã hóa từ BK1 đến BK6 tại Bắc Giang, Hà Giang, Quảng Ninh, Quảng Nam). Đóng góp mang tính đột phá của công trình là đã làm chủ quy trình công nghệ điều chế chất chuẩn quốc gia với độ tinh khiết trên 98,0%, thiết lập ngân hàng dữ liệu gen chuẩn trên NCBI, và cung cấp căn cứ thực nghiệm vững chắc để hoàn thiện tiêu chuẩn hóa dược điển, nâng cao năng lực tự chủ của ngành kiểm nghiệm dược phẩm Việt Nam.

Literature Review và Positioning

Tổng quan y văn quốc tế và trong nước về Morinda officinalis How (họ Cà phê - Rubiaceae) thể hiện sự dịch chuyển mạnh mẽ từ phân loại hình thái truyền thống sang tích hợp hóa học thực vật và sinh học phân tử. Vị trí phân loại của loài được xác lập chặt chẽ trong hệ thống phát sinh thực vật hạt kín APG II (2003) và Takhtajan (2009). Về mặt hóa học thực vật, rễ Ba kích chứa hai nhóm hoạt chất chính có hoạt tính sinh học nổi bật: nhóm iridoid với monotropein là marker chủ đạo (Choi et al., 2005; Shin et al., 2013) và nhóm fructo-oligosaccharid (FOS) với nystose là marker chiếm tỷ lệ cao nhất (Zhang et al., 2009; Shi et al., 2019). Monotropein đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm như TNF-$\alpha$, IL-1$\beta$, COX-2 và ngăn chặn con đường truyền tín hiệu NF-$\kappa$B (Shin et al., 2013), đồng thời cải thiện đáng kể mật độ khoáng xương trong mô hình chuột loãng xương (Zhang et al., 2016). Trong khi đó, nystose thể hiện hoạt tính chống trầm cảm qua mô hình bơi cưỡng bức, bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính của corticosterone và bảo vệ ADN tinh trùng người trước các tác nhân oxy hóa (Li et al., 2003; Chen et al., 2014).

Tuy nhiên, các tranh luận học thuật sâu sắc vẫn tồn tại ở hai khía cạnh:

• Thách thức định danh hình thái và sinh học phân tử: Rễ Ba kích sau chế biến rất dễ bị giả mạo hoặc nhầm lẫn với Ba kích lông (Morinda cochinchinensis Lour), cây Mặt quỷ (Morinda villosa Hook), hay cây Giang mủ (Zygostelma benthamii Baillon). Nghiên cứu đa dạng di truyền trước đây của Ding Ping et al. (2003) tại Quảng Đông và Hoàng Đăng Hiếu et al. (2014) tại Quảng Ninh chỉ dừng lại ở các chỉ thị phân tử đa hình RAPD, ISSR vốn có độ lặp lại thấp giữa các phòng thí nghiệm. Việc lựa chọn đoạn mã vạch ADN tối ưu theo khuyến cáo của Consortium for the Barcode of Life (CBOL Plant Working Group, 2009) giữa vùng gen nhân (ITS/ITS2) và các vùng gen lục lạp (rbcL, matK, trnH-psbA) đối với chi Morinda tại Việt Nam vẫn chưa được thống nhất.
• Bất đồng bộ trong phương pháp kiểm soát chất lượng dược điển quốc tế: Khi so sánh với 02 bộ tiêu chuẩn quốc tế điển hình:
  • Dược điển Trung Quốc (ChP 2015): Kiểm soát chất lượng rễ Ba kích thông qua định lượng nystose bằng HPLC-ELSD trên cột sắc ký pha đảo RP-C18 (250 mm $\times$ 4,6 mm, 5 $\mu$m) với pha động methanol - nước (3:97), yêu cầu hàm lượng nystose không dưới 2,0%.
  • Bộ tiêu chuẩn Dược liệu Hồng Kông (HKCMMS, 2014): Lựa chọn hệ thống sắc ký tương tác ưa béo/ưa nước (HILIC) kết hợp detector ELSD với chương trình rửa giải gradient acetonitril - nước, đặt ngưỡng nystose tối thiểu $\ge 2,3%$.

Công trình của NCS. Phạm Văn Kiền định vị vị thế học thuật bằng việc khắc phục triệt để các khoảng trống trên: phát triển đồng thời hai phương pháp HPLC-DAD (định lượng monotropein) và HPLC-ELSD (định lượng nystose trên cột RP-C18 phù hợp với điều kiện trang thiết bị phổ biến tại Việt Nam), đồng thời xây dựng bộ cơ sở dữ liệu đa locus ADN (ITS, matK, rbcL, trnH-psbA) phục vụ giám định mẫu dược liệu với độ chính xác tuyệt đối.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng lý thuyết kiểm soát chất lượng toàn diện dược liệu (Comprehensive Herbal Quality Assurance Theory) và nguyên lý chuẩn hóa chất đối chiếu phân tích (Analytical Reference Standard Metrology). Thông qua việc chứng minh mối tương quan chặt chẽ giữa hàm lượng hóa thực vật (phytochemical profile) và nguồn gốc địa lý sinh thái của loài Morinda officinalis, nghiên cứu khẳng định tính tất yếu của việc tích hợp song song cả marker phân tử hóa học (chemical markers) và chỉ thị di truyền (genetic markers) trong chuyên luận dược điển. Điều này giải quyết bài toán giới hạn nhận thức luận khi chỉ dựa vào hình thái học phân loại truyền thống hoặc chỉ dựa vào một chỉ tiêu hóa học đơn lẻ vốn dễ bị biến động bởi điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng và quy trình sơ chế, bảo quản.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án được xây dựng dựa trên sự liên kết đa tầng giữa ba trụ cột khoa học:

1. Trụ cột Hóa học Phân tích và Phổ học Cấu trúc: Ứng dụng tích hợp các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều ($^{1}\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR tại tần số 500 MHz), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) và phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) để xác minh cấu trúc không gian tuyệt đối của hoạt chất phân lập.
2. Trụ cột Đo lường học Hóa phân tích (Chemical Metrology): Tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chí thẩm định phương pháp theo hướng dẫn quốc tế ICH Q2(R1), ISO/IEC 17025 và hướng dẫn thiết lập chất chuẩn của WHO/ASEAN.
3. Trụ cột Di truyền học Quần thể và Phát sinh loài: Phân tích đối chiếu trình tự nucleotide trên ngân hàng gen NCBI GenBank nhằm thiết lập ranh giới phân định phân tử (molecular boundaries) giữa Morinda officinalis và các loài cùng chi.

       ┌────────────────────────────────────────────────────────┐
       │   TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH TOÀN DIỆN        │
       └───────────────────────────┬────────────────────────────┘
                                   │
         ┌─────────────────────────┼─────────────────────────┐
         ▼                         ▼                         ▼
┌─────────────────┐       ┌─────────────────┐       ┌─────────────────┐
│ ĐỊNH DANH DI    │       │ PHÂN LẬP & THIẾT│       │ NÂNG CẤP CHUYÊN │
│ TRUYỀN PHÂN TỬ  │       │ LẬP CHẤT CHUẨN  │       │ LUẬN DƯỢC ĐIỂN  │
├─────────────────┤       ├─────────────────┤       ├─────────────────┤
│ • Chiết DNA tổng│       │ • Chiết xuất cồn│       │ • Thẩm định SKLM│
│ • PCR 4 locus:  │       │ • Sắc ký cột /  │         định tính       │
│   ITS, matK,    │         HPLC điều chế   │       │ • Thẩm định     │
│   rbcL, trnH    │       │ • Phổ NMR, MS   │         HPLC-DAD định   │
│ • Giải trình tự │       │ • Đánh giá liên │         lượng monotropein│
│ • BLAST NCBI    │         phòng, độ ổn định│      │ • Thẩm định     │
│ • Nhận diện loài│       │ • Chuẩn Quốc gia│         HPLC-ELSD định  │
│   chính xác     │         monotropein &   │         lượng nystose   │
│                 │         nystose         │       │ • Dự thảo DĐVN VI│
└─────────────────┘       └─────────────────┘       └─────────────────┘

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tuân theo triết lý thực chứng nghiệm chứng (positivist paradigm) với quy trình phân tích định lượng thực nghiệm nghiêm ngặt. Mẫu dược liệu rễ Ba kích thu thập gồm 6 lô đại diện (trên 3 năm tuổi):

• BK1: Lục Ngạn, Bắc Giang (Số hiệu tiêu bản: 2018.BK1)
• BK2: Vị Xuyên, Hà Giang (Số hiệu tiêu bản: 2018.BK2)
• BK3: Vân Đồn, Quảng Ninh (Số hiệu tiêu bản: 2018.BK3)
• BK4: Hoành Bồ, Quảng Ninh (Số hiệu tiêu bản: 2018.BK4)
• BK5: Tây Giang, Quảng Nam (Số hiệu tiêu bản: 2018.BK5)
• BK6: Quản Bạ, Hà Giang (Số hiệu tiêu bản: 2018.BK6)

Tất cả tiêu bản được lưu trữ chuẩn mực tại Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình chiết xuất và phân lập hoạt chất

• Monotropein: Rễ Ba kích (mẫu BK4) được chiết hồi lưu với methanol, cô giảm áp thu cao tổng phần. Tiến hành phân đoạn qua cột sắc ký silica gel pha thuận với hệ dung môi giải phóng phân cực tăng dần (DCM - MeOH - Nước), kết hợp sắc ký cột pha đảo C18 và sắc ký lỏng điều chế Shimadzu LC-10AT VP với đầu dò PDA để thu nhận tinh thể monotropein có độ sạch cao.
• Nystose: Dược liệu rễ Ba kích được chiết siêu âm bằng nước khử ion, lọc, cô đặc và tủa phân đoạn bằng cồn cao độ (EtOH 95%). Cắn tủa được tái hòa tan, hấp phụ lên silica gel và phân tách qua cột sắc ký với hệ dung môi rửa giải n-butanol - ethanol - nước, kết hợp tinh chế làm khô đông khô để thu nystose tinh khiết.

Quy trình thẩm định phương pháp phân tích theo ICH Q2(R1)

Hệ thống phương pháp phân tích HPLC-DAD và HPLC-ELSD được thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu:

• Độ thích hợp hệ thống: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu qua 6 lần tiêm lặp lại $\le 2,0%$; số đĩa lý thuyết $N \ge 4.000$ (đối với monotropein trên cột Phenomenex Gemini RP18, 250 $\times$ 4,6 mm, 5 $\mu$m) và $N \ge 2.000$ (đối với nystose).
• Độ tuyến tính: Hệ số tương quan hồi quy $r \ge 0,995$ trên toàn dải nồng độ khảo sát.
• Độ đúng (phương pháp thêm chuẩn và mẫu tự tạo): Tỷ lệ phục hồi (recovery rate) đạt trong khoảng $98,0% - 102,0%$ với $\text{RSD} \le 2,0%$ ($n = 9$).
• Độ chính xác: Độ lặp lại (repeatability) và độ chính xác trung gian (intermediate precision) thực hiện khác ngày, khác kiểm nghiệm viên cho $\text{RSD} \le 2,0%$.

Quy trình phân tích sinh học phân tử

ADN tổng số được tách chiết bằng kit DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hoa Kỳ). Phản ứng PCR khuếch đại gen thực hiện trên máy Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems) với 4 cặp mồi đặc hiệu:

• Vùng gen nhân: Cặp mồi ITS1/ITS4 và ITS-P5/ITS-U4.
• Vùng gen lạp thể: Cặp mồi matK 1326R/390F, rbcLaF/rbcLaR, và trnH-psbA. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm Runsafe Stain và giải trình tự nucleotide trên máy tự động ABI 3130XL. Trình tự đọc được xử lý và so sánh độ đồng nhất với ngân hàng dữ liệu NCBI bằng thuật toán BLAST search.

Data và phân tích

Số liệu phân tích được xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng và tuân thủ các quy tắc bảo đảm chất lượng theo ISO/IEC 17025. Các thông số phổ NMR (đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR với dung môi $\text{D}2\text{O}$ và $\text{CD}3\text{OD}$) và HR-ESI-MS (máy Waters QTOF) đã đối chiếu hoàn hảo với các hằng số vật lý và phổ học chuẩn quốc tế của monotropein ($\text{C}{16}\text{H}{22}\text{O}{11}$, MW: 390,34) và nystose ($\text{C}{24}\text{H}{42}\text{O}{21}$, MW: 666,58).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Thiết lập thành công 02 lô chất chuẩn Quốc gia (SKS: 0119) đạt chuẩn quốc tế:
   • Lô chất chuẩn monotropein: Đạt độ tinh khiết phân tích $\ge 98,0%$ (xác định qua HPLC-DAD và phân tích nhiệt trọng trường TGA). Đánh giá đồng nhất lô và thử nghiệm liên phòng đạt yêu cầu tuyệt đối, độ ổn định thực nghiệm sau 12 tháng bảo quản duy trì hàm lượng và tạp chất trong giới hạn cho phép.
   • Lô chất chuẩn nystose: Đạt độ tinh khiết phân tích $\ge 98,0%$ (xác định qua HPLC-ELSD và sắc ký lớp mỏng). Hàm lượng ổn định xuyên suốt chu kỳ theo dõi 6 tháng và 12 tháng.
2. Xác định đặc trưng hàm lượng marker trong các quần thể Ba kích Việt Nam:
   • Hàm lượng monotropein trong 16 mẫu khảo sát dao động từ $0,042%$ đến $0,185%$ tính theo dược liệu khô kiệt.
   • Hàm lượng nystose đạt tỷ lệ vượt trội, dao động từ $2,15%$ đến $6,42%$, khẳng định chất lượng rễ Ba kích trồng tại các vùng sinh thái của Việt Nam hoàn toàn tương đương và thậm chí vượt chỉ tiêu quy định trong Dược điển Trung Quốc 2015 ($\ge 2,0%$) và Hồng Kông ($\ge 2,3%$).
3. Định danh phân tử chính xác tuyệt đối thông qua DNA Barcoding:
   • Đoạn gen ITS và matK cho độ dài khuếch đại lý tưởng, kết quả BLAST search trên NCBI cho độ tương đồng (identity) đạt từ $99%$ đến $100%$ và độ bao phủ (query cover) đạt $100%$ với trình tự chuẩn của loài Morinda officinalis (mã số truy cập NCBI: KR869730 và MF989844).
   • Xác lập thành công cơ sở dữ liệu vạch chuẩn ADN đặc hiệu giúp phân biệt tuyệt đối Morinda officinalis với các loài dị nguyên dễ nhầm lẫn như Morinda cochinchinensis và Morinda villosa.

Chỉ tiêu phân tích	Monotropein (SKS: 0119)	Nystose (SKS: 0119)
Công thức phân tử	$\text{C}{16}\text{H}{22}\text{O}_{11}$ (MW: 390,34)	$\text{C}{24}\text{H}{42}\text{O}_{21}$ (MW: 666,58)
Độ tinh khiết thiết lập	$\ge 98,0%$ (HPLC-DAD)	$\ge 98,0%$ (HPLC-ELSD)
Độ ổn định vật lý/hóa học	Ổn định $\ge 12$ tháng	Ổn định $\ge 12$ tháng
Ngưỡng đề xuất trong DĐVN VI	Định tính dương tính (TLC/HPLC)	Định lượng $\ge 2,0%$ (khô kiệt)

Implications đa chiều

• Về mặt học thuật và phương pháp luận: Luận án thiết lập mô hình tích hợp chuẩn mực giữa hóa phân tích và sinh học phân tử trong tiêu chuẩn hóa dược liệu, mở ra tiền lệ khoa học cho việc nghiên cứu các dược liệu phức tạp khác trong Dược điển Việt Nam.
• Về mặt thực tiễn và ứng dụng công nghiệp: Việc nội địa hóa sản xuất chất chuẩn monotropein và nystose giúp các viện kiểm nghiệm và nhà máy sản xuất dược phẩm tiết kiệm $70 - 80%$ chi phí mua chất chuẩn ngoại, rút ngắn thời gian phân tích từ hàng tháng xuống còn vài ngày.
• Về mặt chính sách y tế: Cung cấp trực tiếp bản Dự thảo chuyên luận rễ Ba kích hoàn chỉnh cho Hội đồng Dược điển Việt Nam để đưa vào Dược điển Việt Nam VI, bao gồm: bổ sung mục định tính nystose bằng SKLM, định tính monotropein bằng HPLC-DAD, và định lượng nystose bằng HPLC-ELSD (yêu cầu hàm lượng không ít hơn $2,0%$ tính theo dược liệu khô kiệt).

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án cũng ghi nhận một số giới hạn nghiên cứu khách quan:

• Quy mô mẫu địa lý: Dữ liệu sinh học phân tử và hóa học thực nghiệm được xây dựng chủ yếu trên 6 vùng trồng và thu hái trọng điểm (Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Giang, Quảng Nam); cần mở rộng thu thập các mẫu Ba kích mọc hoang dã tại vùng sâu Tây Nguyên và Nam Trung Bộ để đánh giá toàn diện sự biến thiên dưới loài.
• Phạm vi hoạt chất chuẩn hóa: Đề tài tập trung chuyên sâu vào 2 marker chính là monotropein và nystose. Các thành phần thứ cấp thuộc nhóm anthraquinon (như rubiadin, damnacanthal) chưa được thiết lập chất chuẩn đồng thời trong cùng một quy trình phân tích.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối khuyến nghị các hướng phát triển:

1. Xây dựng kỹ thuật Real-time PCR hoặc khuếch đại đẳng nhiệt (LAMP-PCR) dựa trên chỉ thị gen ITS và matK đã giải mã, cho phép giám định nhanh loài dược liệu ngay tại hiện trường thu hái.
2. Thiết lập quy trình phân tích sắc ký dấu vân tay (HPLC Fingerprint) kết hợp phân tích hóa học đa biến (chemometrics) để phân biệt chính xác Ba kích trồng theo các độ tuổi (3 năm, 5 năm, 7 năm).
3. Nghiên cứu sâu hơn về sự chuyển hóa của monotropein và nystose trong quá trình chế biến truyền thống (Ba kích chích rượu, Ba kích chích muối) nhằm làm sáng tỏ cơ chế tăng cường tác dụng bổ thận tráng dương theo lý luận y học cổ truyền.

Tác động và ảnh hưởng

Công trình mang lại tác động sâu rộng trên nhiều bình diện:

• Ảnh hưởng học thuật: Cung cấp chuỗi dữ liệu nucleotide chuẩn mực cho ngân hàng gen quốc tế NCBI, đóng góp nguồn tài liệu tham khảo giá trị cho các nghiên cứu hóa thực vật và phân loại học chi Morinda.
• Tác động kinh tế và ngành Dược: Việc chủ động sản xuất 02 chất chuẩn monotropein và nystose giúp hệ thống kiểm nghiệm toàn quốc (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM và 63 Trung tâm Kiểm nghiệm tỉnh, thành) tự chủ hoàn toàn nguồn chuẩn đối chiếu. Điều này trực tiếp hạ giá thành kiểm nghiệm, hỗ trợ các doanh nghiệp sản xuất thuốc đông dược nâng cao tiêu chuẩn cơ sở.
• Tác động quản lý nhà nước: Giúp các cơ quan quản lý dược (Cục Quản lý Dược, Cục Quản lý Y Dược Cổ truyền) có công cụ kỹ thuật chuẩn mực để thanh kiểm tra thị trường dược liệu, ngăn chặn tình trạng gian lận thương mại và dược liệu rác, bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và sức khỏe cộng đồng.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật Dược học: Thừa hưởng phương pháp luận tích hợp giữa DNA barcoding và HPLC trong tiêu chuẩn hóa dược liệu, mở rộng cho các đề tài nghiên cứu về cây thuốc cổ truyền Việt Nam.
• Hệ thống Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc và Cơ quan Giám định: Tiếp cận quy trình phân tích đã được thẩm định đầy đủ theo ICH Q2(R1) và nguồn chất chuẩn chất lượng cao, giá thành hợp lý.
• Các Viện nghiên cứu và Doanh nghiệp sản xuất Đông dược: Sở hữu cơ sở khoa học tin cậy để chuẩn hóa quy trình chiết xuất, kiểm soát nguyên liệu đầu vào, và phát triển các chế phẩm bảo vệ sức khỏe chuẩn hóa từ rễ Ba kích.
• Hội đồng Dược điển Việt Nam: Nhận chuyển giao trực tiếp dữ liệu khoa học hoàn chỉnh để phê duyệt và ban hành chuyên luận rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam phiên bản VI.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?

Luận án mở rộng Lý thuyết Kiểm soát Chất lượng Toàn diện Dược liệu (Metrological Theory of Botanical Quality Control) bằng cách chứng minh tính tất yếu của việc hợp nhất chỉ thị phân tử ADN (ITS, matK) với định lượng marker hóa học kép (monotropein đại diện cho iridoid và nystose đại diện cho FOS). Nghiên cứu khẳng định rằng việc chỉ dựa vào đặc điểm hình thái vi học truyền thống là không đủ để bảo đảm tính chuẩn xác của loài, xác lập chuẩn mực mới cho công tác xây dựng dược điển quốc gia.

2. Đổi mới phương pháp luận của luận án so với các nghiên cứu quốc tế trước đây?

So với phương pháp sử dụng cột sắc ký HILIC phức tạp trong Tiêu chuẩn Dược liệu Hồng Kông (HKCMMS) hoặc các nghiên cứu dùng chỉ thị RAPD/ISSR có độ tái lập kém, luận án đã:

• Tối ưu hóa thành công phép định lượng nystose bằng HPLC-ELSD trên nền cột sắc ký pha đảo thông dụng RP-C18, giải quyết bài toán tương thích trang thiết bị tại các phòng thí nghiệm Việt Nam.
• Thiết lập quy trình phân lập tinh chế đồng thời monotropein và nystose từ cùng một nguồn nguyên liệu bằng công nghệ sắc ký cột kết hợp sắc ký điều chế đạt độ tinh khiết cao ($\ge 98,0%$), vượt trội hơn quy trình của Liu Dongfeng et al. (2012) vốn chỉ đạt độ tinh khiết $92,54%$.

3. Phát hiện thực nghiệm nào gây bất ngờ và có giá trị khoa học cao nhất?

Phát hiện bất ngờ nhất là hàm lượng nystose trong rễ Ba kích Việt Nam đạt ngưỡng rất cao, dao động từ $2,15%$ đến $6,42%$, trong đó nhiều mẫu vượt xa mức trung bình quy định của Dược điển Trung Quốc 2015 ($\ge 2,0%$). Điều này chứng minh nguồn dược liệu Ba kích nuôi trồng tại Việt Nam có hàm lượng hoạt chất vượt trội, hoàn toàn đáp ứng các tiêu chuẩn xuất khẩu quốc tế khắt khe.

4. Luận án có cung cấp đầy đủ quy trình lặp lại thực nghiệm (Replication Protocol) không?

Luận án cung cấp bộ quy trình thực nghiệm chi tiết và minh bạch tuyệt đối: từ điều kiện sắc ký (thành phần pha động, chương trình gradient dung môi, nhiệt độ buồng bay hơi ELSD $90^\circ\text{C}$, tốc độ dòng khí mang), thông số giải trình tự gen (nồng độ primer, chu kỳ nhiệt PCR cho từng locus ITS, matK, rbcL, trnH-psbA), đến phương pháp pha chế mẫu thử và mẫu chuẩn, bảo đảm khả năng tái lập độc lập 100% tại bất kỳ phòng kiểm nghiệm đạt chuẩn GLP/ISO 17025 nào.

5. Định hướng chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được vạch ra như thế nào?

Chiến lược nghiên cứu dài hạn tập trung vào:

• Phát triển kit chẩn đoán phân tử tại chỗ (POC DNA Kit) ứng dụng công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt phục vụ kiểm tra nhanh nguồn gốc giống Ba kích tại các vùng trồng dược liệu đạt chuẩn GACP-WHO.
• Thiết lập ngân hàng chất chuẩn quốc gia cho toàn bộ các marker hoạt tính thứ cấp của chi Morinda.
• Đánh giá sinh khả dụng, dược động học và cơ chế phân tử của phức hợp monotropein - nystose trong điều trị bệnh lý thoái hóa thần kinh và loãng xương trên người.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Phạm Văn Kiền là công trình khoa học toàn diện, giải quyết trọn vẹn cả 3 mục tiêu cấp thiết về lý thuyết, phương pháp luận và ứng dụng thực tiễn:

1. Phân lập và thiết lập 02 chất chuẩn Quốc gia: Điều chế thành công chất chuẩn monotropein và nystose đạt độ tinh khiết $\ge 98,0%$, hoàn chỉnh hồ sơ dữ liệu phân tích phổ học ($^{1}\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, HR-ESI-MS, FT-IR) và kiểm tra độ ổn định 12 tháng theo đúng hướng dẫn của WHO.
2. Làm chủ kỹ thuật định danh DNA Barcoding: Xác định đoạn gen ITS và matK là hai chỉ thị phân tử chuẩn xác để định danh loài Morinda officinalis, phân biệt tuyệt đối với các dược liệu giả mạo.
3. Thẩm định phương pháp phân tích tiên tiến: Xây dựng thành công phương pháp định tính SKLM, định tính và định lượng monotropein bằng HPLC-DAD, và nystose bằng HPLC-ELSD đạt đầy đủ các chỉ tiêu thẩm định của ICH Q2(R1).
4. Nâng cấp trực tiếp Dược điển Việt Nam: Soạn thảo hoàn chỉnh dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích cho Dược điển Việt Nam VI với các chỉ tiêu kiểm soát hóa học định lượng chặt chẽ (nystose $\ge 2,0%$).
5. Mở ra 03 hướng nghiên cứu ứng dụng mới: Tiêu chuẩn hóa dược liệu bằng sinh học phân tử, phát triển công nghiệp sản xuất chất chuẩn chiết xuất từ tự nhiên, và tối ưu hóa quy trình chế biến thuốc cổ truyền dựa trên bằng chứng hóa học thực nghiệm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ba kích (Morinda officinalis) là một cây thuốc quý có giá trị sử dụng trong Y học cổ truyền, được biết đến với nhiều tác dụng: Bổ thận, tráng dương, mạnh gân cốt, tăng lực, tăng sức đề kháng, chống viêm [10], [12], [16], [18]… Những năm gần đây, nhu cầu sử dụng của dược liệu rễ Ba kích và các chế phẩm từ dược liệu rễ Ba kích ngày một tăng. Thị trường dược liệu rễ Ba kích cũng rất đa dạng, bao gồm các nguồn cung cấp dược liệu được nhập khẩu từ Trung Quốc, được trồng theo quy hoạch phát triển vùng trồng dược liệu [13], và nguồn thu hái tự nhiên. Do đa dạng về nguồn cung cấp nên chất lượng của dược liệu rễ Ba kích chưa được kiểm soát chặt chẽ. Hiện nay, dược liệu rễ Ba kích hay bị nhầm lẫn do hình dáng, trong khi việc định danh dược liệu bằng hình thái học là một công tác khó khăn vì sau khi thu hái và xử lý thì không thể thu thập đầy đủ thông tin về đặc điểm thực vật của mẫu dược liệu.

Cần có một phương pháp bổ trợ trong định danh dược liệu để đảm bảo tính đúng của dược liệu rễ Ba kích, và phương pháp định danh dược liệu bằng giải trình tự ADN là một phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt ra. Để kiểm soát được chất lượng dược liệu rễ Ba kích, cần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu trong đó kiểm soát được đầy đủ các chỉ tiêu về hình thái cũng như một số “marker” (những chất có hoạt tính sinh học hoặc có hàm lượng cao có trong dược liệu [86]). Đồng thời, phải thiết lập được những chất chuẩn của “marker” này để cung cấp cho hệ thống kiểm nghiệm nhằm giảm chi phí cũng như thời gian kiểm nghiệm so với việc phải mua những chất chuẩn này từ nước ngoài. Về tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích, hiện nay Dược điển Trung Quốc, Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông và Dược điển Việt Nam có chuyên luận dược liệu rễ Ba kích.

Trong đó, chuyên luận Ba kích trong Dược điển Việt Nam V mới chỉ có một số chỉ tiêu cơ bản về mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, chưa có chỉ tiêu định lượng thành phần hóa học [3]. Dược điển Trung Quốc và Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông đã có chỉ tiêu định lượng “marker” - nystose [37], [47]. Về “marker” trong dược liệu rễ Ba kích: Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về một số hợp chất trong rễ Ba kích có tác dụng sinh học như: Monotropein có tác dụng chống viêm [12], [38], oligosaccharid (nystose) có tác dụng chống trầm cảm, 1 chống tổn thương tế bào thần kinh do corticosteron [58], hay nhóm anthraquinon và polysaccharid có tác dụng trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu xương [89]. Một số công trình khoa học đã công bố hàm lượng các chất monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích cũng ở mức tương đối cao (monotropein: 0,046 % [91], nystose: ³ 3,0% [11]).

Do vậy, monotropein và nystose đủ điều kiện là “marker” của dược liệu rễ Ba kích, cần được kiểm soát hàm lượng và thiết lập chất chuẩn để phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng dược liệu rễ Ba kích. Xuất phát từ những vấn đề cấp thiết ở trên, luận án: “Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) của Việt Nam” được thực hiện với 3 mục tiêu chính: 1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và thiết lập được 2 chất chuẩn monotropein, nystose từ dược liệu rễ Ba kích. Định danh được dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN.

Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính và định lượng. Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) 1. Vị trí phân loại của Ba kích Theo “Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín (Magnoliophyta, Angiospermae) ở Việt Nam” [1] và các tài liệu phân loại thực vật khác: Hệ thống của Takhtajan năm 2009 [79] và hệ thống APG II [55], vị trí phân loại chi Morinda trong giới thực vật được trình bày trong Bảng 1. Vị trí phân loại của chi Morinda Phân giới Cormobionta (Thực vật bậc cao) Ngành Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan) Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan) Phân lớp Lamiidae (Phân lớp Bạc hà) Bộ Gentianales (Bộ Long đởm) Họ Rubiaceae (Họ Cà phê) Chi Morinda Tên khoa học: Morinda officinalis How, họ Cà phê Rubiaceae.

Tên gọi khác: Ba kích thiên, Ruột gà, Chẩu phóng xì (Hải Ninh), Thao tày cáy (Tày), Ba kích nhục, Liên châu Ba kích [10]. Theo tài liệu “Nomenclatural changes and taxonomic notes in the tribe Morindeae (Rubiaceae)”, chi Morinda được đổi tên thành Gynochthodes [61]. Tuy nhiên, Dược điển Việt Nam V vẫn đang sử dụng tên chi Morinda nên luận án giữ nguyên tên chi theo Dược điển Việt Nam V. Đặc điểm hình thái Cây dây leo bằng thân cuốn, dài từ 3 - 5m.

Rễ phình to thành củ, hình trụ, mập, vặn vẹo. Củ thường hơi thắt lại tạo thành các đốt có chiều dài từ 1 - 3 cm, trông giống ruột gà. Vỏ ngoài màu hồng nhạt, thịt màu hồng, tím hay trắng, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc, giữa có lõi cứng có tỷ lệ so với đường kính củ khác nhau [4]. 3 Thân hình tròn, chia nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với nhau.

Thân non nhẵn, phủ lông ngắn-cứng hay lông dài, có cạnh, màu xanh, tím đậm hoặc tím nhạt, sau nhẵn, chuyển từ màu xanh sang nâu [1], [2], [5]. Phiến lá hình mác hoặc bầu dục thuôn nhọn. Gốc lá hơi lệch, nhọn, tròn hoặc hơi hình tim; mép phẳng hay lượn sóng, hơi uốn mặt sau; ngọn lá tròn hay nhọn; mặt trên nhẵn hay phủ lông dài; mặt dưới nhẵn hay phủ lông. Lá non màu tím sau chuyển sang xanh, có thể có hoặc không hốc Domatia hốc giữa gân chính và phụ có phủ lông.

Gân lá hình lông chim, gồm 4 - 9 cặp gân bên, nổi mặt dưới, lõm ở mặt trên. Gân chính có lông hoặc nhẵn ở mặt dưới. Lá kèm 2, dính nhau, ôm lấy thân, mỏng, mỗi lá có 2 thùy nhọn hoặc hàn liền ở dưới, trên chia làm 2 thùy, dài 2 – 4 mm, màu trắng, nâu hay tím nhạt, ôm sát vào thân, dài 4 mm [4]. Cụm hoa dạng tán, gồm 1-8 tán ở nách lá hay đầu cành, mỗi tán mang 1-14 hoa.

Hoa nhỏ, khi mới nở màu trắng, sau hơi vàng hay tím đen. Đài 3-4, hơi dính nhau ở dưới, đều hay không đều nhau. Tràng 3-4, có phần móng dính nhau tạo thành ống hình chum hoặc hình trụ, nhẵn hay phủ lông ở mặt ngoài; phần phiến rời, hình tam giác, mặt ngoài nhẵn hay phủ lông, mặt trong có một vòng lông dày đặc, thẳng, màu trắng. Quả hình cầu, từ 1-8 quả/1 tán, rời hoặc dính với nhau thành quả kép ở các mức độ khác nhau.

Bề mặt quả nhẵn hoặc phủ lông, xanh khi non và chuyển màu cam khi chín, mang 3 đài còn lại trên đỉnh quả, có hình dạng và kích thước không đều nhau [8]. Phân bố, thu hái, chế biến - Cây mọc hoang ở ven rừng, phân bố phổ biến ở vùng đồi núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc: Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang; một số tỉnh miền Trung và Tây Nguyên (Quảng Nam, Gia Lai, Kon Tum) [18]. Một số tỉnh có khu trồng dược liệu rễ Ba kích như Bắc Giang, Quảng Ninh, Quảng Nam - Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay [4], [5], [10]. - Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae) [5], [10].

- Chế biến: Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô tới khi không dính tay, đập nhẹ cho bẹp, phơi đến khô hoặc sấy nhẹ đến khô [10], [16], [19]. Thành phần hoá học Một số nhóm chất trong rễ Ba kích gồm: - Iridoid: Monotropein (0,042%), acid desacetyl asperulosidic (0,0038%), asperulosid (0,0003%), morindolid (0,0002%) , morofficinalosid (0,0001%), acid asperulosidic (0,0001%) [91]. - Ngoài ra còn có 6 hợp chất Anthraquinon [57], [89], [91], [93]; 2 hợp chất sterol; 1 hợp chất saponintriterpen (acid rotugenic 0,0007%) [91], một hợp chất lacton [91], [94], và một số acid amin [16], [19]. Tác dụng dược lý Theo Đông y, Ba kích là vị thuốc có vị cay ngọt, tính hơi ôn, quy kinh thận.

Có tác dụng ôn thận trợ dương, mạnh gân cốt, khử phong thấp [10]. Dịch chiết Ba kích có một số tác dụng đã được chứng minh như: Chống viêm (nhóm chất iridoid) [35], chống loãng xương (nhóm chất iridoid và anthraquinon) [27], [96], tăng cường miễn dịch hệ tiêu hoá (nhóm oligosaccharid) [72], tác dụng bảo vệ ADN của tinh trùng người (nhóm oligosaccharid) [45], tác dụng chống trầm cảm (nhóm oligosaccharid) [17]… 1. Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích Dược điển Trung Quốc 2015, Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông và Dược điển Việt Nam V có chuyên luận dược liệu rễ Ba kích. Các chỉ tiêu kiểm tra chất lượng dược liệu rễ Ba kích trong các Dược điển trên được trình bày tóm tắt trong Bảng 1.

Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Bộ tiêu chuẩn Dược điển Dược điển Việt Stt Chỉ tiêu dược liệu Hồng Trung Quốc Nam V [3] Kông [47] 2015 [37] 1 Mô tả + + + 2 Vi phẫu + + + 3 Bột + + + 4 Định tính + + + Hàm lượng 5 £ 13,0% £ 15,0% £ 12,0% nước/độ ẩm 6 Tro toàn phần £ 5,5% £ 6,0% £ 6,0% ³ 50% (chiết lạnh) 7 Chất chiết được ³ 50% ³ 50% ³ 60% (chiết nóng) Định lượng 8 ³ 2,3 % ³ 2,0 % - nystose 9 Tỉ lệ vụn nát - - £ 5,0% 10 Tạp chất + - + Ghi chú: (+): Có chỉ tiêu; (-): Không có chỉ tiêu. Theo Dược điển Việt Nam V, chuyên luận dược liệu rễ Ba kích còn khá đơn giản và chưa được tiêu chuẩn về mặt hóa học [3]. Trong Dược điển Trung Quốc và Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông kiểm soát hoạt chất có dược liệu rễ Ba kích dựa vào hàm lượng nystose [37], [47]. Monotropein và nystose là 2 chất có hàm lượng cao nhất của 2 nhóm chất có tác dụng dược lý của dược liệu rễ Ba kích là nhóm iridorid và oligosaccharid.

Bên cạnh đó, nystose cũng đã được Trung Quốc và Hồng Kông lựa chọn là “marker” của dược liệu này. Như vậy, monotropein và nystose là 2 “marker” của dược liệu rễ Ba kích. Để kiểm soát chất lượng dược liệu rễ Ba kích cần kiểm soát hàm lượng 2 6 “marker” này thông qua việc bổ sung chỉ tiêu định tính, định lượng 2 “marker” monotropein và nystose vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam.