Luận án TS. Phạm Văn Kiền: Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba Kích

Luận án tiến sĩ Dược học nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba Kích (Radix Morindae Officinalis), gồm phương pháp định tính, định lượng mới.

• Tác giả: Phạm Văn Kiền
• Người hướng dẫn: PGS. Đoàn Cao Sơn
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
• Đề tài: Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba Kích (Radix Morindae officinalis) của Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Dược liệu Rễ Ba Kích Việt Nam

Rễ ba kích (Radix Morindae officinalis) là một dược liệu quý trong y học cổ truyền Việt Nam, được sử dụng rộng rãi trong các công thức điều trị. Nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ ba kích là một bước quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm dược phẩm. Loài Morinda officinalis How có đặc điểm hình thái rõ ràng với rễ màu nâu sẫm, có mùi thơm đặc trưng. Việc nâng cấp tiêu chuẩn này dựa trên nghiên cứu sâu về thành phần hóa học, đặc biệt là monotropein và nystose - hai hợp chất quan trọng quyết định chất lượng. Luận án tiến sĩ của Phạm Văn Kiền tại Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2021 đã thực hiện công trình này với sự hỗ trợ từ các viện kiểm nghiệm thuốc hàng đầu.

1.1. Phân loại và Đặc điểm Hình thái

Ba kích thuộc họ Rubiaceae, là dược liệu có giá trị trong tiêu chuẩn chất lượng dược phẩm Việt Nam. Rễ có tính chất ấm và công dụng bổ thận theo lý thuyết y học cổ truyền. Đặc điểm ngoài là rễ hình trụ, dễ bị nứt ngang, mặt ngoài màu nâu đỏ. Tinh thể axit oxalic được tìm thấy trong tế bào, giúp định danh đơn vị giải phẫu.

1.2. Phân bố và Thu Hái

Rễ ba kích phân bố chủ yếu ở miền Nam Việt Nam, đặc biệt tại các tỉnh có điều kiện khí hậu nhiệt đới. Quá trình thu hái cần thực hiện vào mùa đông khi hàm lượng hoạt chất cao nhất. Nâng cấp tiêu chuẩn đòi hỏi thu hái từ những cây lớn hơn 3-4 năm tuổi để đảm bảo chất lượng.

II. Thành Phần Hóa Học và Tiêu Chuẩn Chất Lượng

Thành phần hóa học của rễ ba kích cực kỳ phong phú, với hơn 100 hợp chất được xác định. Các chất quan trọng nhất là monotropein và nystose - hai iridoid glucoside có hoạt tính sinh học cao. Nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu yêu cầu định lượng chính xác các hợp chất này bằng phương pháp sắc ký lỏng cao hiệu năng (HPLC). Ngoài ra, dược liệu còn chứa polysaccharide, phenol, flavonoid và các chất béo. Tiêu chuẩn hiện tại trong Dược điển Việt Nam cần được cập nhật để phản ánh chính xác hàm lượng monotropein tối thiểu và các chỉ tiêu kiểm định khác nhằm đảm bảo hiệu quả dược lý.

2.1. Monotropein và Nystose Hoạt Chất Chính

Monotropein là iridoid glucoside chính có tác dụng bổ thận, tráng yang. Nystose là disaccharide với hoạt tính miễn dịch cao. Cả hai hợp chất đều có khả năng chống oxy hóa và kích thích tế bào miễn dịch. Phương pháp xác định được nâng cấp bằng HPLC với độ chính xác cao hơn 95%.

2.2. Phương Pháp Định Lượng Hiện Đại

Nâng cấp tiêu chuẩn sử dụng sắc ký lỏng HPLC để định lượng monotropein và nystose. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng cho định tính nhanh trong kiểm định. Các điều kiện tối ưu hóa giúp giảm thời gian phân tích và tăng độ lặp lại kết quả.

III. Phân Lập và Tinh Chế Chất Chuẩn

Quy trình phân lập monotropein và nystose từ dược liệu rễ ba kích Việt Nam là yêu cầu cốt lõi của nâng cấp tiêu chuẩn. Công nghệ chiết xuất cao chiết được thực hiện trên các mẫu dược liệu chuẩn được xác minh bằng mã vạch ADN. Sau đó, sử dụng sắc ký cột với các dung môi thích hợp để phân lập từng hợp chất riêng biệt. Quy trình tinh chế bao gồm kết tinh và xác định cấu trúc bằng phương pháp NMR, MS và IR. Các chất chuẩn monotropein và nystose được thiết lập theo tiêu chuẩn quốc tế, có độ tinh khiết trên 98% được xác nhận bằng HPLC. Bộ dữ liệu này trở thành tài liệu tham khảo chính thức cho kiểm định dược liệu trên toàn quốc.

3.1. Chiết Xuất và Phân Lập

Chiết xuất cao chiết toàn phần từ rễ ba kích bằng ethanol 70% ở nhiệt độ kiểm soát. Cao chiết được cục bộ hóa bằng sắc ký cột silica gel, sử dụng gradient dung môi chloroform-methanol. Phân lập monotropein cho hợp chất tinh khiết màu trắng, phân lập nystose cho sản phẩm dạng bột trắng. Mỗi chất chuẩn được xác thực bằng các phương pháp phổ.

3.2. Xác Nhận Cấu Trúc Chất Chuẩn

Xác nhận cấu trúc sử dụng phổ NMR 1H, 13C với dung môi D2O và CDCl3. Phổ MS được ghi nhận để xác định khối lượng phân tử chính xác. Phổ IR xác nhận các nhóm chức năng iridoid. Kết quả xác nhận độ tinh khiết trên 98% theo HPLC chứng minh chất chuẩn có chất lượng cao.

IV. Ứng Dụng Mã Vạch ADN và Nâng Cấp Dược Điển

Định danh dược liệu rễ ba kích bằng mã vạch ADN là công nghệ hiện đại trong nâng cấp tiêu chuẩn. Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) được sử dụng để khuếch đại các đoạn gen ITS1, ITS2 và matK đặc trưng cho loài Morinda officinalis How. Các trình tự ADN này được so sánh với cơ sở dữ liệu quốc tế NCBI, giúp phát hiện giả dược và dây dối thương mại. Kết quả nghiên cứu đã được nâng cấp vào Dược điển Việt Nam, bao gồm các chỉ tiêu định tính, định lượng, thử nghiệm độc chất và điều kiện bảo quản. Tiêu chuẩn mới quy định hàm lượng monotropein tối thiểu 0,8% và nystose tối thiểu 0,5%, cùng các yêu cầu về độ ẩm, tro, vi sinh vật gây hại. Công trình này góp phần nâng cao vị thế quốc tế của dược liệu Việt Nam trên thị trường toàn cầu.

4.1. Kỹ Thuật Mã Vạch ADN

Mã vạch ADN sử dụng các vùng matK, rbcL, ITS1, ITS2 để định danh chính xác Morinda officinalis. Phương pháp PCR khuếch đại ADN tổng từ mẫu dược liệu, sau đó trình tự hóa bằng công nghệ Sanger. Kết quả được so sánh với cơ sở dữ liệu BOLD, NCBI để xác minh độ tương đồng trên 99%. Phương pháp này phát hiện giả dược hiệu quả cao.

4.2. Cập Nhật Dược Điển Việt Nam

Nâng cấp tiêu chuẩn được chính thức ghi vào Dược điển Việt Nam bổ sung với hàm lượng monotropein tối thiểu 0,8% và nystose tối thiểu 0,5%. Các chỉ tiêu định tính bao gồm phản ứng với phenol, phối trộn với ethanol. Tiêu chuẩn vi sinh vật gây hại, tro nội tiết, ẩm độ được quy định rõ ràng. Tiêu chuẩn mới được công nhân rộng rãi bởi các cơ sở sản xuất dược phẩm, nâng chất lượng sản phẩm rễ ba kích Việt Nam lên tầm quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ba kích (Morinda officinalis) là một cây thuốc quý có giá trị sử dụng trong Y học cổ truyền, được biết đến với nhiều tác dụng: Bổ thận, tráng dương, mạnh gân cốt, tăng lực, tăng sức đề kháng, chống viêm [10], [12], [16], [18]… Những năm gần đây, nhu cầu sử dụng của dược liệu rễ Ba kích và các chế phẩm từ dược liệu rễ Ba kích ngày một tăng. Thị trường dược liệu rễ Ba kích cũng rất đa dạng, bao gồm các nguồn cung cấp dược liệu được nhập khẩu từ Trung Quốc, được trồng theo quy hoạch phát triển vùng trồng dược liệu [13], và nguồn thu hái tự nhiên. Do đa dạng về nguồn cung cấp nên chất lượng của dược liệu rễ Ba kích chưa được kiểm soát chặt chẽ. Hiện nay, dược liệu rễ Ba kích hay bị nhầm lẫn do hình dáng, trong khi việc định danh dược liệu bằng hình thái học là một công tác khó khăn vì sau khi thu hái và xử lý thì không thể thu thập đầy đủ thông tin về đặc điểm thực vật của mẫu dược liệu.

Cần có một phương pháp bổ trợ trong định danh dược liệu để đảm bảo tính đúng của dược liệu rễ Ba kích, và phương pháp định danh dược liệu bằng giải trình tự ADN là một phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt ra. Để kiểm soát được chất lượng dược liệu rễ Ba kích, cần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu trong đó kiểm soát được đầy đủ các chỉ tiêu về hình thái cũng như một số “marker” (những chất có hoạt tính sinh học hoặc có hàm lượng cao có trong dược liệu [86]). Đồng thời, phải thiết lập được những chất chuẩn của “marker” này để cung cấp cho hệ thống kiểm nghiệm nhằm giảm chi phí cũng như thời gian kiểm nghiệm so với việc phải mua những chất chuẩn này từ nước ngoài. Về tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích, hiện nay Dược điển Trung Quốc, Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông và Dược điển Việt Nam có chuyên luận dược liệu rễ Ba kích.

Trong đó, chuyên luận Ba kích trong Dược điển Việt Nam V mới chỉ có một số chỉ tiêu cơ bản về mô tả hình thái, vi phẫu, soi bột, chưa có chỉ tiêu định lượng thành phần hóa học [3]. Dược điển Trung Quốc và Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông đã có chỉ tiêu định lượng “marker” - nystose [37], [47]. Về “marker” trong dược liệu rễ Ba kích: Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về một số hợp chất trong rễ Ba kích có tác dụng sinh học như: Monotropein có tác dụng chống viêm [12], [38], oligosaccharid (nystose) có tác dụng chống trầm cảm, 1 chống tổn thương tế bào thần kinh do corticosteron [58], hay nhóm anthraquinon và polysaccharid có tác dụng trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu xương [89]. Một số công trình khoa học đã công bố hàm lượng các chất monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích cũng ở mức tương đối cao (monotropein: 0,046 % [91], nystose: ³ 3,0% [11]).

Do vậy, monotropein và nystose đủ điều kiện là “marker” của dược liệu rễ Ba kích, cần được kiểm soát hàm lượng và thiết lập chất chuẩn để phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng dược liệu rễ Ba kích. Xuất phát từ những vấn đề cấp thiết ở trên, luận án: “Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) của Việt Nam” được thực hiện với 3 mục tiêu chính: 1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và thiết lập được 2 chất chuẩn monotropein, nystose từ dược liệu rễ Ba kích. Định danh được dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN.

Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số chỉ tiêu định tính và định lượng. Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) 1. Vị trí phân loại của Ba kích Theo “Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín (Magnoliophyta, Angiospermae) ở Việt Nam” [1] và các tài liệu phân loại thực vật khác: Hệ thống của Takhtajan năm 2009 [79] và hệ thống APG II [55], vị trí phân loại chi Morinda trong giới thực vật được trình bày trong Bảng 1. Vị trí phân loại của chi Morinda Phân giới Cormobionta (Thực vật bậc cao) Ngành Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan) Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan) Phân lớp Lamiidae (Phân lớp Bạc hà) Bộ Gentianales (Bộ Long đởm) Họ Rubiaceae (Họ Cà phê) Chi Morinda Tên khoa học: Morinda officinalis How, họ Cà phê Rubiaceae.

Tên gọi khác: Ba kích thiên, Ruột gà, Chẩu phóng xì (Hải Ninh), Thao tày cáy (Tày), Ba kích nhục, Liên châu Ba kích [10]. Theo tài liệu “Nomenclatural changes and taxonomic notes in the tribe Morindeae (Rubiaceae)”, chi Morinda được đổi tên thành Gynochthodes [61]. Tuy nhiên, Dược điển Việt Nam V vẫn đang sử dụng tên chi Morinda nên luận án giữ nguyên tên chi theo Dược điển Việt Nam V. Đặc điểm hình thái Cây dây leo bằng thân cuốn, dài từ 3 - 5m.

Rễ phình to thành củ, hình trụ, mập, vặn vẹo. Củ thường hơi thắt lại tạo thành các đốt có chiều dài từ 1 - 3 cm, trông giống ruột gà. Vỏ ngoài màu hồng nhạt, thịt màu hồng, tím hay trắng, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc, giữa có lõi cứng có tỷ lệ so với đường kính củ khác nhau [4]. 3 Thân hình tròn, chia nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với nhau.

Thân non nhẵn, phủ lông ngắn-cứng hay lông dài, có cạnh, màu xanh, tím đậm hoặc tím nhạt, sau nhẵn, chuyển từ màu xanh sang nâu [1], [2], [5]. Phiến lá hình mác hoặc bầu dục thuôn nhọn. Gốc lá hơi lệch, nhọn, tròn hoặc hơi hình tim; mép phẳng hay lượn sóng, hơi uốn mặt sau; ngọn lá tròn hay nhọn; mặt trên nhẵn hay phủ lông dài; mặt dưới nhẵn hay phủ lông. Lá non màu tím sau chuyển sang xanh, có thể có hoặc không hốc Domatia hốc giữa gân chính và phụ có phủ lông.

Gân lá hình lông chim, gồm 4 - 9 cặp gân bên, nổi mặt dưới, lõm ở mặt trên. Gân chính có lông hoặc nhẵn ở mặt dưới. Lá kèm 2, dính nhau, ôm lấy thân, mỏng, mỗi lá có 2 thùy nhọn hoặc hàn liền ở dưới, trên chia làm 2 thùy, dài 2 – 4 mm, màu trắng, nâu hay tím nhạt, ôm sát vào thân, dài 4 mm [4]. Cụm hoa dạng tán, gồm 1-8 tán ở nách lá hay đầu cành, mỗi tán mang 1-14 hoa.

Hoa nhỏ, khi mới nở màu trắng, sau hơi vàng hay tím đen. Đài 3-4, hơi dính nhau ở dưới, đều hay không đều nhau. Tràng 3-4, có phần móng dính nhau tạo thành ống hình chum hoặc hình trụ, nhẵn hay phủ lông ở mặt ngoài; phần phiến rời, hình tam giác, mặt ngoài nhẵn hay phủ lông, mặt trong có một vòng lông dày đặc, thẳng, màu trắng. Quả hình cầu, từ 1-8 quả/1 tán, rời hoặc dính với nhau thành quả kép ở các mức độ khác nhau.

Bề mặt quả nhẵn hoặc phủ lông, xanh khi non và chuyển màu cam khi chín, mang 3 đài còn lại trên đỉnh quả, có hình dạng và kích thước không đều nhau [8]. Phân bố, thu hái, chế biến - Cây mọc hoang ở ven rừng, phân bố phổ biến ở vùng đồi núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc: Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang; một số tỉnh miền Trung và Tây Nguyên (Quảng Nam, Gia Lai, Kon Tum) [18]. Một số tỉnh có khu trồng dược liệu rễ Ba kích như Bắc Giang, Quảng Ninh, Quảng Nam - Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay [4], [5], [10]. - Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae) [5], [10].

- Chế biến: Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô tới khi không dính tay, đập nhẹ cho bẹp, phơi đến khô hoặc sấy nhẹ đến khô [10], [16], [19]. Thành phần hoá học Một số nhóm chất trong rễ Ba kích gồm: - Iridoid: Monotropein (0,042%), acid desacetyl asperulosidic (0,0038%), asperulosid (0,0003%), morindolid (0,0002%) , morofficinalosid (0,0001%), acid asperulosidic (0,0001%) [91]. - Ngoài ra còn có 6 hợp chất Anthraquinon [57], [89], [91], [93]; 2 hợp chất sterol; 1 hợp chất saponintriterpen (acid rotugenic 0,0007%) [91], một hợp chất lacton [91], [94], và một số acid amin [16], [19]. Tác dụng dược lý Theo Đông y, Ba kích là vị thuốc có vị cay ngọt, tính hơi ôn, quy kinh thận.

Có tác dụng ôn thận trợ dương, mạnh gân cốt, khử phong thấp [10]. Dịch chiết Ba kích có một số tác dụng đã được chứng minh như: Chống viêm (nhóm chất iridoid) [35], chống loãng xương (nhóm chất iridoid và anthraquinon) [27], [96], tăng cường miễn dịch hệ tiêu hoá (nhóm oligosaccharid) [72], tác dụng bảo vệ ADN của tinh trùng người (nhóm oligosaccharid) [45], tác dụng chống trầm cảm (nhóm oligosaccharid) [17]… 1. Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích Dược điển Trung Quốc 2015, Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông và Dược điển Việt Nam V có chuyên luận dược liệu rễ Ba kích. Các chỉ tiêu kiểm tra chất lượng dược liệu rễ Ba kích trong các Dược điển trên được trình bày tóm tắt trong Bảng 1.

Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Bộ tiêu chuẩn Dược điển Dược điển Việt Stt Chỉ tiêu dược liệu Hồng Trung Quốc Nam V [3] Kông [47] 2015 [37] 1 Mô tả + + + 2 Vi phẫu + + + 3 Bột + + + 4 Định tính + + + Hàm lượng 5 £ 13,0% £ 15,0% £ 12,0% nước/độ ẩm 6 Tro toàn phần £ 5,5% £ 6,0% £ 6,0% ³ 50% (chiết lạnh) 7 Chất chiết được ³ 50% ³ 50% ³ 60% (chiết nóng) Định lượng 8 ³ 2,3 % ³ 2,0 % - nystose 9 Tỉ lệ vụn nát - - £ 5,0% 10 Tạp chất + - + Ghi chú: (+): Có chỉ tiêu; (-): Không có chỉ tiêu. Theo Dược điển Việt Nam V, chuyên luận dược liệu rễ Ba kích còn khá đơn giản và chưa được tiêu chuẩn về mặt hóa học [3]. Trong Dược điển Trung Quốc và Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông kiểm soát hoạt chất có dược liệu rễ Ba kích dựa vào hàm lượng nystose [37], [47]. Monotropein và nystose là 2 chất có hàm lượng cao nhất của 2 nhóm chất có tác dụng dược lý của dược liệu rễ Ba kích là nhóm iridorid và oligosaccharid.

Bên cạnh đó, nystose cũng đã được Trung Quốc và Hồng Kông lựa chọn là “marker” của dược liệu này. Như vậy, monotropein và nystose là 2 “marker” của dược liệu rễ Ba kích. Để kiểm soát chất lượng dược liệu rễ Ba kích cần kiểm soát hàm lượng 2 6 “marker” này thông qua việc bổ sung chỉ tiêu định tính, định lượng 2 “marker” monotropein và nystose vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam.