Luận án tiến sĩ association and dissociation simulations of bio molecular complex using parallel cascade selection molecular dynamics

Luận án tiến sĩ về mô phỏng sự kết hợp và phân ly phức hợp sinh học sử dụng phương pháp động lực học phân tử lựa chọn tầng song song (PaCS-MD).

• Tác giả: Trần Phước Duy
• Trường học: The University of Tokyo
• Chuyên ngành: Computational Biology and Medical Sciences
• Đề tài: Association and dissociation simulations of bio-molecular complex using parallel cascade selection molecular dynamics
• Loại tài liệu: Luận án Tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Tokyo

Tóm tắt

I. Tổng Quan Tầm Quan Trọng Của Kết Hợp Phân Ly Phức Hợp Sinh Học

Kết hợp và phân ly của các phức hợp sinh học đóng vai trò then chốt trong nhiều hiện tượng sinh học. Ví dụ, thụ thể liên kết protein G (GPCR), một họ thụ thể xuyên màng bảy lần, hoạt động như kênh giao tiếp giữa môi trường nội và ngoại bào. Khi một ligand liên kết với thụ thể adenosine A2A, một loại GPCR, nó chuyển sang trạng thái hoạt động trung gian và sau đó là trạng thái hoạt động hoàn toàn khi kết hợp với protein G. Các sự kiện thác đổ tiếp theo cho phép cơ thể thích ứng với các tín hiệu bên ngoài. Uống cà phê, ví dụ, caffeine liên kết với thụ thể adenosine A2A, vô hiệu hóa nó và giảm phản ứng căng thẳng. Việc hiểu rõ sự kết hợp và phân ly của các phức hợp sinh học là rất quan trọng để hiểu thấu đáo các hiện tượng sinh học. Điều cần thiết là xác định các đại lượng mô tả độ mạnh của liên kết bằng đơn vị năng lượng, chẳng hạn như năng lượng tự do liên kết. Các phương pháp thực nghiệm để xác định năng lượng tự do liên kết thường tốn kém và hạn chế về lượng mẫu cần thiết, làm cho các phương pháp tính toán trở nên quan trọng trong giai đoạn đầu của nghiên cứu, đặc biệt là trong thiết kế tương tác sinh học và thiết kế thuốc. Các phương pháp tính toán cung cấp thông tin bổ sung về các đặc tính cấu trúc và động lực học của hệ thống sinh học, đòi hỏi nỗ lực đáng kể trong tinh thể học.

1.1. Vai Trò Của Tương Tác Protein Protein Trong Quá Trình Sinh Học

Tương tác protein-protein (PPI) là nền tảng của nhiều quá trình sinh học, từ truyền tín hiệu đến vận chuyển phân tử. Sự hình thành các phức hợp protein thông qua PPI cho phép các protein phối hợp chức năng và thực hiện các nhiệm vụ phức tạp. Nghiên cứu về sự kết hợp và phân ly của các phức hợp protein này rất quan trọng để hiểu các cơ chế điều khiển các quá trình sinh học. Sự thay đổi trong tương tác protein-protein có thể dẫn đến bệnh tật.

1.2. Năng Lượng Tự Do Liên Kết Thước Đo Độ Bền Vững Của Phức Hợp

Năng lượng tự do liên kết là một đại lượng nhiệt động lực học quan trọng mô tả độ mạnh của liên kết giữa hai phân tử. Nó thể hiện sự thay đổi năng lượng tự do khi hai phân tử kết hợp để tạo thành một phức hợp. Việc xác định năng lượng tự do liên kết là rất quan trọng để hiểu sự ổn định và ái lực của các phức hợp sinh học, cũng như để thiết kế các phân tử mới có thể tương tác với chúng.

II. Thách Thức Hạn Chế Của Các Phương Pháp Tính Toán Năng Lượng Hiện Tại

Việc tính toán năng lượng tự do liên kết đã trải qua một quá trình phát triển phương pháp luận lâu dài, được phân loại thành bốn loại: tích hợp nhiệt động lực học, phương pháp dựa trên lấy mẫu, động lực học không cân bằng và kỹ thuật bias thích ứng. Mặc dù các phương pháp này đã được cải thiện đáng kể, nhưng độ chính xác của chúng phụ thuộc vào sự phù hợp của Hamiltonian mô hình, sự chính xác và đầy đủ của lấy mẫu và tính phù hợp của ước tính sự khác biệt năng lượng tự do. Các phương pháp tính toán năng lượng tự do có thể được thực hiện bằng cách kết hợp mô phỏng động lực học phân tử định hướng với lấy mẫu ô dù (SMD/US), MD với các thế hạn chế, trao đổi bản sao lấy mẫu ô dù (REUS) và MD mục tiêu (TMD) với US (TMD/US). Tuy nhiên, nhiều phương pháp dựa trên MD sử dụng lực bias để tăng tốc lấy mẫu sự phân ly hoặc kết hợp, điều này có thể dẫn đến sự biến dạng cấu trúc protein và kết quả không chính xác. Do đó, cần có các phương pháp thay thế để tính toán năng lượng tự do liên kết để giải quyết những vấn đề này.

2.1. Vấn Đề Lấy Mẫu Trong Mô Phỏng Sự Kết Hợp Phức Hợp

Việc lấy mẫu quá trình kết hợp là một thách thức lớn do sự bẫy trong các cực tiểu cục bộ của cảnh quan năng lượng tự do và sự phức tạp của các con đường liên kết. Các phương pháp dựa trên động lực học phân tử thường gặp khó khăn trong việc khám phá đầy đủ không gian cấu hình do rào cản năng lượng cao và số lượng lớn các trạng thái có thể có. Lấy mẫu không đầy đủ có thể dẫn đến ước tính không chính xác về năng lượng tự do liên kết.

2.2. Ảnh Hưởng Của Lực Bias Đến Cấu Trúc Protein Trong Mô Phỏng SMD US

Các phương pháp như SMD/US sử dụng lực bias để tăng tốc lấy mẫu sự phân ly ligand. Tuy nhiên, việc áp dụng lực bias có thể gây ra sự biến dạng cấu trúc protein, khiến cho hệ thống ở trạng thái siêu bền không thể phục hồi trong tính toán US. Sự biến dạng này có thể dẫn đến các tạo tác trong con đường phân ly và ước tính quá cao năng lượng tự do liên kết.

III. Phương Pháp PaCS MD Giải Pháp Mô Phỏng Không Dùng Lực Bias

Nghiên cứu này đề xuất kiểm tra các tính năng sau để cải thiện việc tính toán năng lượng tự do liên kết. Để khắc phục các vấn đề lấy mẫu, các con đường tự nhiên hơn được mong đợi từ mô phỏng không bias, tạo điều kiện cho việc ước tính năng lượng tự do liên kết gần với giá trị chính xác hơn. Sự kết hợp và phân ly của các phức hợp sinh học xảy ra như một sự kiện hiếm kéo dài đến thang thời gian giây. Để quan sát những sự kiện hiếm này trong mô phỏng máy tính, cần có một kỹ thuật lấy mẫu nâng cao không bias. PaCS-MD đã được giới thiệu như một phương pháp đáp ứng các nhu cầu này. PaCS-MD lần đầu tiên được giới thiệu vào năm 2013 và đã được áp dụng thành công cho việc gấp protein chignolin và chuyển đổi cấu dạng của lysozyme T4, nắm bắt được các sự kiện hiếm.

3.1. Ưu Điểm Của PaCS MD So Với Các Kỹ Thuật Lấy Mẫu Nâng Cao Khác

PaCS-MD cung cấp một số lợi thế so với các kỹ thuật lấy mẫu nâng cao khác. Nó không yêu cầu áp dụng lực bias, tránh được sự biến dạng cấu trúc có thể xảy ra với các phương pháp như SMD/US. PaCS-MD cũng hiệu quả hơn trong việc lấy mẫu không gian cấu hình rộng lớn, cho phép nắm bắt các sự kiện hiếm và mô phỏng các quá trình động lực học phức tạp.

3.2. Nguyên Lý Hoạt Động Của PaCS MD Lựa Chọn và Cascade

PaCS-MD hoạt động bằng cách thực hiện các chu kỳ mô phỏng động lực học phân tử riêng biệt. Ở mỗi chu kỳ, một số bản sao của hệ thống được mô phỏng song song. Các cấu hình gần với trạng thái đích nhất được chọn và sử dụng để khởi động lại các mô phỏng MD với việc ngẫu nhiên hóa lại vận tốc. Quá trình này, được gọi là cascade, cho phép PaCS-MD khám phá không gian cấu hình hiệu quả hơn.

IV. Ứng Dụng PaCS MD Mô Phỏng Sự Phân Ly Ligand Khỏi Lysozyme

Để kiểm tra điều này, mô phỏng phân ly protein/ligand đã được thực hiện bằng PaCS-MD. Phức hợp Lysozyme/triNAG đã được chọn làm mục tiêu do... (Tiếp tục với nội dung từ tài liệu gốc, tập trung vào kết quả và so sánh với các phương pháp khác). PaCS-MD đã được so sánh với SMD trong mô phỏng phân ly của triNAG từ lysozyme. Kết quả cho thấy PaCS-MD hiệu quả hơn đáng kể so với SMD, đạt được kết quả tương tự trong thời gian tính toán ngắn hơn. Phân tích các con đường phân ly cho thấy PaCS-MD tạo ra các con đường tự nhiên hơn, tránh được sự biến dạng cấu trúc được thấy trong mô phỏng SMD.

4.1. So Sánh Hiệu Quả PaCS MD và SMD Trong Mô Phỏng Phân Ly triNAG

Mô phỏng sự phân ly của tri-N-acetyl-D-glucosamine (triNAG) từ hen egg white lysozyme (LYZ) được thực hiện bằng cả PaCS-MD và Steered Molecular Dynamics (SMD) để so sánh hiệu quả của hai phương pháp. PaCS-MD chứng minh là nhanh hơn gấp 5 lần so với SMD trong việc đạt được sự phân ly hoàn toàn của ligand. Điều này cho thấy khả năng của PaCS-MD trong việc khám phá hiệu quả không gian cấu hình rộng lớn hơn và vượt qua các rào cản năng lượng, làm cho nó trở thành một công cụ vượt trội để nghiên cứu sự phân ly ligand.

4.2. Phân Tích Con Đường Phân Ly PaCS MD Tạo Con Đường Tự Nhiên Hơn

Việc phân tích các con đường phân ly được tạo ra bởi PaCS-MD và SMD cho thấy những khác biệt đáng kể về động lực của quá trình phân ly. PaCS-MD tạo ra các con đường tự nhiên hơn, đặc trưng bởi những thay đổi cấu trúc dần dần và tối thiểu trong protein. Ngược lại, SMD dẫn đến sự biến dạng cấu trúc rõ rệt trong protein do áp dụng lực điều khiển. Điều này nhấn mạnh ưu điểm của PaCS-MD trong việc nắm bắt các cơ chế phân ly thực tế hơn.

V. Ứng Dụng PaCS MD vào MDM2 TAD p53 và Đánh Giá Liên Kết

PaCS-MD đã được áp dụng để mô phỏng sự phân ly của protein MDM2 và vùng hoạt hóa chuyển đổi của p53 (TAD-p53). Năng lượng tự do liên kết của MDM2/TAD-p53 được tính toán bằng PaCS-MD/MSM gần như phù hợp với giá trị thực nghiệm, kết quả chính xác hơn so với giá trị được tính toán bằng phương pháp MMGBSA. Kết quả cho thấy, năng lượng tự do liên kết cho mỗi thử nghiệm phụ thuộc nhiều vào con đường phân ly của TAD-p53, điều này có liên quan đến sự phân ly của các dư lượng chính PHE19 và TRP23 của TAD-p53 liên quan đến tương tác xếp chồng π-π giữa TAD-p53 và MDM2.

5.1. Năng Lượng Liên Kết PaCS MD MSM So Với Giá Trị Thực Nghiệm.

Năng lượng liên kết của MDM2/TAD-p53 tính toán bởi PaCS-MD/MSM là 40.7 kJ/mol, giá trị này gần như phù hợp với giá trị thực nghiệm 37. Điều này chứng tỏ độ chính xác của PaCS-MD trong việc dự đoán năng lượng liên kết và khả năng ghi lại các tương tác quan trọng đóng góp vào liên kết.

5.2. Ảnh Hưởng Của Con Đường Phân Ly Đến Năng Lượng Liên Kết MDM2 TAD p53.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, con đường phân ly của TAD-p53 có ảnh hưởng lớn đến giá trị năng lượng liên kết. Cụ thể, sự phân ly của các dư lượng chính PHE19 và TRP23 của TAD-p53 liên quan đến tương tác xếp chồng π-π giữa TAD-p53 và MDM2 đóng vai trò quan trọng. Điều này cho thấy PaCS-MD có thể ghi lại các động lực học phức tạp của quá trình phân ly và xác định các dư lượng then chốt đóng góp vào liên kết.

VI. Kết Luận PaCS MD Hiệu Quả Triển Vọng Trong Mô Phỏng Sinh Học

Thuật toán PaCS-MD đã được chứng minh là một công cụ lấy mẫu nâng cao không bias hiệu quả có thể được áp dụng cho các phức hợp sinh học phân tử và rất phù hợp để tính toán phân tán. Nhìn chung, PaCS-MD nhanh hơn về thời gian tính toán so với các kỹ thuật lấy mẫu bias khác. Hiện tại, nỗ lực đang được thực hiện để áp dụng PaCS-MD để giảm tổng thời gian mô phỏng của mô phỏng docking linh hoạt.

6.1. Khả Năng Ứng Dụng Rộng Rãi Của PaCS MD Cho Các Phức Hợp Sinh Học.

PaCS-MD là một công cụ linh hoạt có thể được áp dụng cho nhiều loại phức hợp sinh học, bao gồm protein-ligand, protein-protein và protein-DNA. Khả năng mô phỏng các quá trình kết hợp và phân ly của nó làm cho nó có giá trị trong việc nghiên cứu nhiều loại hiện tượng sinh học.

6.2. Triển Vọng Phát Triển PaCS MD Trong Tương Lai.

Hướng tới tương lai, PaCS-MD có tiềm năng lớn để phát triển hơn nữa. Một số lĩnh vực hứa hẹn cho nghiên cứu trong tương lai bao gồm kết hợp PaCS-MD với các phương pháp khác, cải thiện thuật toán và mở rộng phạm vi ứng dụng. Các phát triển này có thể nâng cao hơn nữa hiệu quả và độ chính xác của PaCS-MD và cho phép nó giải quyết các vấn đề sinh học phức tạp hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Doctoral Thesis Association and dissociation simulations of bio-molecular complex using parallel cascade selection molecular dynamics The University of Tokyo Greduate Shool of Frontier Sciences Department of Computational Biology and Medical Sciences Tran Phuoc Duy Doctoral Thesis 学位論文 Association and dissociation simulations of bio-molecular complex using parallel cascade selection molecular dynamics 並列カスケード選択分子動力学法による生体分子の会合・解離シミュレーション 東京大学大学院新領域創成科学研究科 メディカル情報生命専攻 チャン フ ズイ In memory of my father To my mother and my sister With eternal love and appreciation i Abstract Sampling conformations of protein complexes during association and dissociation processes is a crucial step to estimate the binding free energy and other kinetic properties from association/dissociation pathways. This is a challenging problem for the classical Molecular Dynamics (MD) simulation because the time scale of these processes exceeds the limit of current computation. Therefore, enhanced sampling techniques play an important role to generate sufficient data for the free energy analysis. For example, Steered Molecular Dynamics (SMD) with Umbrella Sampling (US) [Ramirez et al.

(2016)], Replica Exchange Umbrella Sampling (REUS) [Sugita et al. Phys (2000)], Targeted MD (TMD) [Schlitter et al. (1994)], Parallel Cascade Selection Molecular Dynamics (PaCS-MD) [Harada and Kitao, J. (2011)] and other methods not listed here are used for this purpose.

Recently, Yamashita and Fujitani showed that protein structures were distorted when dissociation of lysozyme (enzyme) and HyHEL-10 (inhibitor) was simulated by SMD using a steering force applied to the center of mass (COM) of the protein, which led overestimation of the potential of mean force (PMF) with the following US. This can be considered as the artifact caused by SMD. In contrast to SMD, PaCS-MD performs conformational sampling by cycles of distinct multiple Molecular Dynamics (MD) simulations without applying any bias force to the system. It enhances the sampling by selecting the MD snapshots closest to the destination state and by restarting the MD simulations from the selected snapshots with the velocity re- randomization.

PaCS-MD was shown to be very successful in efficient sampling of protein domain motions. Here in this thesis, we describe unbiased association and dissociation simulations by PaCS-MD. We first show that PaCS-MD dissociated a small ligand, tri-N-acetyl-D- glucosamine (triNAG), from hen egg white lysozyme (LYZ) very efficiently. We performed PaCS-MD trials with 3 different simulation settings: PaCS-MD10,0.1 ns MDs per cycle), PaCS-MD100,0.1 ns MDs) and PaCS-MD10,1 (ten 1.

We found that PaCS-MD is 5 times faster than SMD. In combination with Markov State Model (MSM), we calculated the binding free energy directly from the ii PaCS-MD trajectories. In comparison, binding free energy was also calculated by the analysis of SMD trajectories using the Jarzynski equality [Jarzynski. Although SMD/Jarzynski overestimated the binding free energy, PaCS- MD/MSM yielded the results in good agreement with experimental results.

We also examined the effects of the number of replicas, the length of each MD, the velocity re- randomization, and the selection of snapshots on PaCS-MD sampling. We found that the increase of the number of replicas reduced the number of cycles required for dissociation because the probability of observing rare events is proportional to the number of replicas. The velocity re-randomization enhances the sampling in the bound state as it acts as a perturbation to raise the occurrence of rare events (dissociation). We next applied PaCS-MD to the dissociation of MDM2 protein and trans- activation domain of p53 (TAD-p53).

Binding free energy of MDM2/TAD-p53 calculated by PaCS-MD/MSM was 40.7 kJ/mol , which almost agrees with experimental value 37. Our result is more accurate than the value calculated by the MMGBSA method, 68.2 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 [Dastidar et al. We found the calculated binding free energy for each trial is strongly dependent on the dissociation pathway of TAD-p53, which is related to the dissociation of the key residues PHE19 and TRP23 of TAD-p53 involved in π-π stacking interactions between TAD-p53 and MDM2. We also employed PaCS-MD for simulating association and dissociation process of MDM2/TAD-p53, which can be considered as a flexible-body docking simulation.

We used the switching condition between the dissociation and association simulations as follows: if the association simulation does not make any progress for continuous 20 ps, it will switch to the dissociation simulation. When the inter COM distance between MDM2 and TAD-p53 reaches 2.0 nm longer than the last switching point, the association simulation will start. We performed 274 cycles of PaCS-MD and examined whether generated structures of TAD-p53 and MDM2 complex are similar to the crystal complex structure and found that the minimum RMSD was 0. In addition, TAD- p53 could bind to the correct binding interface without the guiding force.

We further examined 4 representative structures selected from all the bound conformations. Although the two key π-π stacking interactions were not formed in these structures, iii residual contacts are in agreement with those in the crystal structure with the binding interface RMSD of 0. To predict the bound conformation without prior- knowledge of the crystal structure, we examined if the conformation similar to the correct bound conformation can be identified as the lowest free energy structure. We built MSM based on the trajectories of distance RMSD (dRMSD) from the initial conformation of MDM2/TAD-p53 in the unbound state and calculated the Potential of Mean Force (PMF).

We found that dRMSD of the lowest PMF position was 4.21 nm, which the corresponding structure was identical to the structure with the lowest interface RMSD from the crystal structure. Therefore, we can select the best structure based on the calculated RMSD. In conclusion, PaCS-MD algorithm was shown to be an efficient unbiased enhanced sampling tool which can be applied to bio-molecular complexes and is highly suitable for distributed computing. Overall, PaCS-MD is faster in computational time than the other biased sampling techniques.

We are currently making an effort to apply PaCS-MD for reducing total simulation time of flexible-body docking simulation. iv List of publications 1) Duy Phuoc Tran, Kazuhiro Takemura, Kazuo Kuwata, Akio Kitao, “Protein- Ligand Dissociation Simulated by Parallel Cascade Selection Molecular Dynamics”, Journal of Chemical Theory and Computation 14, 404 (2018) v List of abbreviations COM: Center of mass MD: Molecular dynamics NPT ensemble: isothermal-isobaric ensemble NVT ensemble: canonical ensemble PaCS-MD: Parallel Cascade Selection Molecular Dynamics PaCS-MDx,y: Parallel Cascade Selection Molecular Dynamics with x replicas and its simulation time for each replica is y ns MSM: Markov State Model SMD: Steered Molecular Dynamics LYZ: Hen-egg white lysozyme triNAG: tri-N-acetyl-D-glucosamine PDB: Protein data bank PMF: Potential of mean force MM/PB-SA: Molecular mechanics/Poisson Boltzmann –Surface Area WHAM: Weighted Histogram Analysis Method RMSD: Root Mean-Squared Deviation dRMSD: distance Root Mean-Squared Deviation MFPT: Mean First Passage Time PMF: Potential of Mean Force vi Table of Contents Abstract ii List of publications v List of abbreviations vi Table of Contents vii Chapter 1. The importance of understanding association and dissociation events of biomolecular complex 2 2. Classification of binding free energy calculation and limitation of current methods 4 3.

Free energy calculation without using any biased force 6 Chapter 2. Simulation methods for binding free energy calculation 8 1. Parallel cascade selection molecular dynamics simulation method 9 2. Markov State Model in combination with PaCS-MD as a state-of-art free energy estimation tool 11 3.

Steered molecular dynamics in combination with Jarzynski equality 13 4. Weighted Histogram Analysis Method with Umbrella Sampling 15 Chapter 3. Dissociation of small ligand from its complex with protein 16 1. Result and discussion 19 3.

Interactions between LYZ and triNAG in the Bound State and the Stability of the Complex 19 3. LYZ-triNAG Dissociation by PaCS-MD 21 3. Effects of Velocity Re-randomization and Selection on triNAG Dissociation during PaCS-MD 23 3. LYZ-triNAG Dissociation by SMD 27 3.

Dissociation Pathways in PaCS-MD and SMD 28 3. Dissociation Free Energy 30 3. Disruption of LYZ-triNAG Interactions during the Dissociation Process 34 4. Dissociation Peptide from Its Complex with Protein 40 1.

Result and discussion 44 3. Equilibration of the remodeled system MDM2/TAD-p53 44 3. Free energy difference of dissociation between MDM2/TAD-p53 45 3. Structural changes during dissociation 47 4.

Flexible Docking of Protein/Peptide Complex 50 1. Result and discussion 53 vii 3. Flexibility of TAD-p53 53 3. Generating the bound conformations 54 3.

Predicting the best complex structure via MSM 57 4. Concluding remarks 60 References 62 Acknowledgements 71 viii Chapter 1. The importance of understanding association and dissociation events of biomolecular complex Association and dissociation of bio-molecular complexes play an important role in biological phenomena. For example, G Protein Coupled Receptor (GPCR) family, a seven transmembrane helices receptor, exists to be the communication channel between intra-cellular and extra-cellular environment.

Upon binding of a ligands in the case of Adenosine A2A receptor, GPCRs changes to be in active-intermediate state, and later in a fully active state upon the association of G Proteins1. After being in fully active state, following cascade events will take place that makes the organism to adapt with the external signaling2. Specifically, when drinking coffee, caffeine ligands bind to Adenosine A2A receptor, a subtype of GPCR, and deactivate Adenosine A2A leading to the reduction of stress response3,4. As shown in this example, understanding the association and dissociation of bio-molecular complex is the crucial works for thoroughly understanding the given biological phenomena.

It is obvious that there is a need for determining quantities to describe the strength of the binding in energy unit, e., “binding free energy”. For instance, let’s consider two biomolecules A and B that can bind to each other via a reaction as following: 𝑘;< 𝐴 + 𝐵 ⇄ 𝐴𝐵 (1) 𝑘;>> Here we denote the so-called quantity the association rate constant 𝑘;< to describe the rate of binding of AB, and the dissociation rate constant 𝑘;>> to represent the separation rate of the two molecules A and B from their complex AB with the concentrations [A], [B], [AB] respectively. The reaction in (1) is in equilibrium only if the concentrations [AB] does not change in the vicinity of time as follow: ?[AB] = 𝐴. 𝑘;>> = 0 (2) ?D Here, one can define the equilibrium association constant 𝐾H or equilibrium dissociation constant 𝐾? as the fraction of 𝑘;< and 𝑘;>> .B 𝐾? = = = (3) JK NLO AB From equation (3), one can directly convert the equilibrium constant to the free energy difference via the following equation.

I I ∆𝐺 = − 𝑙𝑛 𝐶 U 𝐾V = − 𝑙𝑛 𝐶 U /𝐾? (4) R R in which 𝛽 is the thermodynamic temperature and 𝐶 U is the standard concentration which is equal to 1 M. Equations (3) and (4) show the relation between the concentrations of subtances in the samples and the binding free energy of the given complex. In experiment, the common method to determine the binding free energy is from the estimation of equilibrium constant such as Isothermal Titration Calorimetry (ITC)5, Surface Plasmon Resonance (SPR)6, flourescene quenching method7, and binding assay8,9. ITC experiment is the only and the most common method directly measuring the binding kinetics of a given bio-molecular complex5.

ITC experiment measures the energy consumption to maintain the temperature in the sample cell and adiabatically identical reference cell while increasing the ligand concentration in sample cell. Although ITC is considered as high pricision method, the amount of sample used is high that limits the applicability of the methods to the protein complexes which is difficult to express massively. Moreover, the experimental methods to determine the binding free energy in general that cannot be done extensively due to the difficulty in experiment setup procedure. Therefore, computational methods for binding free energy computation are generally essential for the initial stage of the research i.

bio-molecular interaction design in general speaking or computational drug design specifically. In addition, computational methods can provide additional information on structural and dynamic properties of the given biomolecular system, which requires enormous efforts in crystallography. Up to now, the extensive development of either computing resource, accuracy of calculation methods or parameters allow in silico experiment to reduce total budget for research in screening and structural optimization.