Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ung thư vòm họng (Nasopharyngeal carcinoma - UTVH) là bệnh lý ác tính bắt nguồn từ các tế bào biểu mô vùng vòm mũi họng. Theo số liệu thống kê của Globocan năm 2018, ung thư vòm họng có sự phân bố dịch tễ học không đồng đều trên thế giới, tập trung chủ yếu tại khu vực châu Á (chiếm 84,7% tổng số ca mắc mới) và châu Phi (5,4%). Tại Việt Nam, UTVH đứng đầu trong danh sách các bệnh ung thư vùng đầu - mặt - cổ và nằm trong nhóm 10 loại ung thư phổ biến nhất, ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh là 5,7% và tỷ lệ tử vong hàng năm đạt 3,9%. Do vị trí giải phẫu đặc thù tiếp giáp giữa mũi, họng và vòi nhĩ, các triệu chứng lâm sàng ban đầu (ù tai một bên, nghẹt mũi, khạc ra máu) thường nghèo nàn và dễ nhầm lẫn. Đa số bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn muộn (giai đoạn II, III hoặc IV), dẫn đến tỷ lệ tái phát cao và tỷ lệ di căn dao động từ 25% đến 34%.

Cơ chế bệnh sinh của ung thư vòm họng có sự phối hợp phức tạp giữa ba yếu tố chính: sự xâm nhiễm của virus Epstein-Barr (EBV), biến đổi di truyền - biểu sinh (epigenetics) và tác động của môi trường sống (thói quen tiêu thụ cá muối, nitrosamine, hút thuốc lá). Khoảng 95% khối u vòm họng có liên quan trực tiếp đến sự hiện diện của EBV ở trạng thái tiềm tan hoặc hoạt động. Trong hệ gene của EBV, họ gene BARTs (BamHI-A rightward transcripts), tiêu biểu là gene RPMS1, đóng vai trò quan trọng trong việc can thiệp vào con đường tín hiệu Notch ở tế bào chủ, thúc đẩy quá trình tăng sinh và chuyển dạng ác tính. Đồng thời, microRNA-141 (miR-141) thuộc họ miR-200 được chứng minh có sự biến đổi mức độ biểu hiện bất thường, đóng vai trò như một oncogene tác động lên các gene ức chế khối u (PTEN, UBAP1, BRD3).

Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về tính đa hình gene của EBV tại Việt Nam trước đây chủ yếu tập trung vào các họ gene EBNAs hay LMPs mà chưa làm rõ họ gene BARTs/RPMS1. Bên cạnh đó, các khảo sát biểu hiện của miR-141 trên bệnh nhân ung thư vòm họng trong nước vẫn chưa được tiến hành đồng bộ. Đề tài khóa luận "Khảo sát tính chất biểu hiện của microRNA-141 và tính đa hình gene RPMS1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam" được thực hiện nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử ban đầu, phục vụ định hướng phát triển các dấu chứng sinh học (biomarkers) trong sàng lọc và chẩn đoán sớm bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể của khóa luận bao gồm:

  1. Ứng dụng các công cụ Tin - Sinh học (Bioinformatics tools) để phân tích, thống kê minh chứng vai trò của miR-141 trong ung thư vòm họng, dự đoán gene đích tương tác trực tiếp; ghi nhận tần số phát hiện của miR-141 và tần số xuất hiện của các biến thể trên gene RPMS1 trong UTVH dựa trên các cơ sở dữ liệu quốc tế.
  2. Thiết lập quy trình kỹ thuật phòng thí nghiệm hoàn chỉnh từ khâu tách chiết miRNA và DNA đến việc phát hiện, phân tích tính chất biểu hiện của miR-141 bằng kỹ thuật Real-time PCR; phát hiện các biến thể đa hình trên gene RPMS1 bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự chuỗi Sanger.
  3. Bước đầu khảo sát thực nghiệm tính chất biểu hiện của miR-141 và tính đa hình gene RPMS1 trên mẫu bệnh phẩm mô sinh thiết ung thư vòm họng tại Việt Nam so sánh với nhóm đối chứng người không mắc ung thư vòm họng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Bộ mẫu sinh học gồm 20 mẫu mô sinh thiết ung thư vòm họng (được xác chẩn giải phẫu bệnh bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin và hóa mô miễn dịch kháng nguyên Ki67) và 20 mẫu dịch phết vòm họng âm tính đối chứng thu nhận tại Phòng khám Tai - Mũi - Họng, Bệnh viện Chợ Rẫy TP.HCM (được Hội đồng Đạo đức Bệnh viện Chợ Rẫy phê duyệt theo quyết định số 516/BVCR-HDDD).
  • Không gian và thời gian: Nghiên cứu được triển khai tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở TP.HCM trong giai đoạn khóa học 2015–2019, nghiệm thu vào tháng 06 năm 2019.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và cơ sở phân tử

Hệ gene của virus Epstein-Barr (EBV) là chuỗi DNA xoắn kép mạch thẳng dài khoảng 173 kb, thuộc họ Herpesviridae (phân nhóm Human Herpesvirus 4 - HHV-4). Khi xâm nhiễm vào tế bào chủ, EBV có thể tồn tại ở dạng episome vòng tròn khép kín trong nhân tế bào. Nhóm gene BARTs (BamHI-A rightward transcripts) định vị từ nucleotide 138.325 đến 160.531 trên hệ gene EBV hoang dại (wild-type, mã truy cập GenBank: V01555 / NC_007605). Gene RPMS1 trải dài từ exon I đến gần hết exon VII với khung đọc mở (ORF) kéo dài từ cuối exon IV đến đầu exon V, mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 103 amino acid. Về mặt chức năng, protein RPMS1 gắn vào vùng lõi của CIR (thành phần thuộc phức hợp đồng ức chế SMRT-HDAC) và tương tác với yếu tố CBF1 (RBP-Jk), cạnh tranh với EBNA-2 và NotchIC, từ đó điều hòa âm tính con đường truyền tín hiệu Notch, can thiệp vào quá trình kiểm soát chu kỳ tế bào và apoptosis.

MicroRNA (miRNA) là các phân tử RNA đơn không mã hóa có độ dài khoảng 21–22 nucleotide, điều hòa biểu hiện gene ở mức độ sau phiên mã thông qua phức hợp phân giải tín hiệu ARN (RISC) bám bổ sung vào vùng 3'-UTR của mRNA mục tiêu. Phân tử miR-141 (has-mir-141, mã truy cập MI0000457) nằm trên nhiễm sắc thể số 12 (vị trí 12p13), thuộc họ miR-200. Trong các khối u vòm họng, miR-141 thể hiện đặc tính của oncogene khi tăng cường biểu hiện, làm bất hoạt các gene ức chế khối u chủ chốt gồm PTEN (thúc đẩy tín hiệu sinh tồn qua trục PI3K/AKT), UBAP1 và BRD3 (can thiệp trục điều hòa Rb/E2F).

Đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) trên bộ gene EBV phản ánh sự biến đổi một nucleotide xảy ra với tần số trên 1% quần thể. Trên gene RPMS1, các biến thể SNPs được phân loại thành 4 nhóm hình thái chính:

  • Nhóm RPMS1-A: Đột biến rải rác ngẫu nhiên trên vùng gene (ví dụ: G155284T, G155307T, C155358T, C155481A, C155525T, A155545G).
  • Nhóm RPMS1-B: Đột biến điểm tại nucleotide G155377A (biến thể B1, thay đổi acid amin Serine thành Asparagine - S155377N) và C155389T (biến thể B2, thay đổi Proline thành Leucine - P155389L).
  • Nhóm RPMS1-C: Đột biến điểm G155391A (thay đổi Aspartic acid thành Asparagine - D155391N), được ghi nhận là biến thể đặc thù có mối tương quan chặt chẽ với nguy cơ sinh ung thư vòm họng.
  • Nhóm RPMS1-D: Đột biến kép tại G155325T và G155326A tạo mã kết thúc sớm (Stop codon).

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Đề tài sử dụng mô hình nghiên cứu kết hợp giữa phân tích dữ liệu tin sinh học (in silico) và thực nghiệm sinh học phân tử (in vitro):

  1. Khảo sát Tin - Sinh học (in silico) và Phân tích tổng hợp (Meta-analysis):

    • Thu thập dữ liệu công bố quốc tế từ các hệ thống PubMed, Web of Science, Embase theo các tiêu chí chọn lọc và loại trừ nghiêm ngặt đối với các nghiên cứu ca - chứng (case-control).
    • Xử lý dữ liệu đa hình gene RPMS1 bằng phương pháp tính trung bình trọng số (Weighted Average Frequency).
    • Thiết kế và kiểm tra các thông số vật lý của mồi (chiều dài 17–28 bp, %GC 40–60%, Tm 50–60°C, năng lượng tự do $\Delta G \ge -9\text{ kcal/mol}$) bằng phần mềm trực tuyến IDT OligoAnalyzer.
    • Kiểm tra độ đặc hiệu và vị trí bắt cặp của mồi trên ngân hàng GenBank bằng NCBI Primer-BLAST và Annhyb phiên bản 4.946.
    • Dự đoán trạng thái liên kết disulfide giữa các gốc Cysteine của chuỗi polypeptide biến thể RPMS1 bằng công cụ DISULFIND.

  2. Thực nghiệm sinh học phân tử:

    • Tách chiết DNA: Sử dụng phương pháp Phenol / Chloroform / Isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1 - PCI) kết hợp dung dịch Lysis Buffer (Tris-HCl 1M, EDTA 0,5M, SDS 10%, NaCl 0,5M, Proteinase K 1 mg/ml) và tủa bằng NaOAc 3M cùng Isopropanol ở 4°C.
    • Kiểm tra độ tinh sạch của DNA: Đo mật độ quang phổ hấp thụ (Optical Density) ở các bước sóng 260 nm, 280 nm và 230 nm trên máy quét quang phổ UV/VIS Scanning; đánh giá qua tỷ số $A_{260}/A_{280}$ (ngưỡng tinh sạch 1,8–2,0).
    • Phản ứng PCR khuếch đại gene RPMS1: Thực hiện phản ứng chuỗi polymerase trên máy luân nhiệt với cặp mồi đặc hiệu SNP-RPMS1-F/R và mồi đối chứng nội sinh Beta-actin. Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳ lặp lại gồm biến tính 95°C (30 giây), bắt cặp 60°C (45 giây), kéo dài 72°C (30 giây); giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 5 phút.
    • Điện di và giải trình tự: Điện di sản phẩm PCR trên bản gel agarose 1,5% trong đệm TBE 1X ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút, đối chiếu thang chuẩn DNA 100 bp và đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc XR System (Bio-Rad). Giải trình tự chuỗi nucleotide theo phương pháp Sanger tại Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh học Dược phẩm Nam Khoa.
    • Hiệu chỉnh và phân tích phả hệ phân tử: Xử lý tín hiệu chromatogram bằng Chromas Lite; sắp gióng cột chuỗi (multiple sequence alignment) bằng thuật toán ClustalW trên BioEdit; xây dựng cây phả hệ phân tử bằng MEGA phiên bản 6.0.
    • Khảo sát biểu hiện miR-141: Tách chiết RNA tổng số, phiên mã ngược tạo cDNA (RT-PCR) và định lượng biểu hiện bằng kỹ thuật Real-time PCR (qRT-PCR), sử dụng phân tử RNA nhỏ U6 snRNA làm gen tham chiếu nội chuẩn (Housekeeping gene).

  3. Phương pháp phân tích thống kê:

    • Xử lý số liệu trên phần mềm chuyên dụng MedCalc phiên bản 16.
    • Đánh giá sự khác biệt tần số biến thể và mức độ biểu hiện giữa nhóm bệnh và nhóm chứng bằng kiểm định Chi bình phương ($\chi^2$ test, mức ý nghĩa $p \le 0,05$), tính toán tỷ số chênh (Odds Ratio - OR), nguy cơ tương đối (Relative Risk - RR), độ nhạy, độ đặc hiệu và hệ số phù hợp Kappa ($\kappa$).

Nội dung chính theo từng phần nghiên cứu

Phần I: Tổng quan về ung thư vòm họng, virus Epstein-Barr, gene RPMS1 và microRNA-141

Chương tổng quan hệ thống hóa toàn diện các kiến thức kinh điển và các phát hiện mới về dịch tễ học, bệnh sinh học phân tử của ung thư vòm họng. Nội dung đi sâu phân tích cấu trúc hệ gene EBV, vị trí định vị và cấu trúc các exon/intron của họ gene BARTs, trong đó làm rõ gene RPMS1 mã hóa protein 103 amino acid có khả năng điều hòa âm tính con đường truyền tín hiệu Notch thông qua tương tác với phức hợp CBF1/CIR/SMRT-HDAC.

Chương này cũng trình bày chi tiết con đường sinh tổng hợp của miRNA trong tế bào (từ phân tử pri-miRNA kẹp tóc được cắt bởi phức hợp Drosha/DGCR8 thành pre-miRNA, vận chuyển qua màng nhân nhờ Exportin-5/RAN-GTP, tiếp tục được Dicer cắt thành miRNA sợi đôi trưởng thành trong tế bào chất). Cấu trúc của họ miR-200 và vị trí của miR-141 trên nhiễm sắc thể 12p13 được mô tả chi tiết cùng cơ chế tác động lên các gene đích sinh ung. Bảng tổng hợp các nghiên cứu quốc tế đã làm nổi bật vai trò kép (oncogene/tumor suppressor) của miR-141 trên nhiều loại ung thư khác nhau ở người.

Loại ung thư Vai trò của miR-141 Gene đích trực tiếp Con đường tín hiệu liên quan
Ung thư vòm họng Tăng biểu hiện / Oncogene BRD3, PTEN, UBAP1 Rb/E2F, JNK2, PTEN/AKT
Ung thư đại tràng Tăng biểu hiện / Oncogene MAP2K4, SIP1 MAP2K4, ZEB1/SIP1
Ung thư tuyến tiền liệt Tăng biểu hiện / Oncogene KLF9, shp miR-141-3p/KLF9
Ung thư buồng trứng Tăng biểu hiện / Oncogene KEAP1, p38$\alpha$ NF-$\kappa$B, Nrf2
Ung thư gan Giảm biểu hiện / Tumor suppressor ZEB2, Tiam1, HNF-3$\beta$ HNF-3$\beta$
Ung thư thận Giảm biểu hiện / Tumor suppressor EphA2 EphA2/p-FAK/p-AKT/MMPs
Ung thư vú Tác động kép (Tăng / Giảm) ANP32E, PR, Stat5a FAK, PI3K/AKT

Phần II: Nghiên cứu tính chất đa hình gene RPMS1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam

Phần nghiên cứu tập trung vào hai mảng: khảo sát dữ liệu tổng hợp in silico từ các ấn phẩm toàn cầu và tiến hành thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm thu thập tại Bệnh viện Chợ Rẫy. Kết quả thống kê từ 3 công trình lớn trên thế giới (với tổng số 1.410 mẫu bệnh và 2.296 mẫu đối chứng lành) đã xác định rõ sự phân bố các biến thể gene RPMS1:

Biến thể RPMS1 Vị trí nucleotide đột biến Thay đổi amino acid Trung bình trọng số mẫu bệnh (%) Trung bình trọng số mẫu lành (%)
RPMS1-A Đột biến rải rác (ngẫu nhiên) Biến đổi ngẫu nhiên 49% 76%
RPMS1-B1 / B2 155377 (G$\rightarrow$A) / 155389 (C$\rightarrow$T) S155377N / P155389L 11% 16%
RPMS1-C 155391 (G$\rightarrow$A) D155391N 74% 37%
RPMS1-D 155325 (G$\rightarrow$T) & 155326 (G$\rightarrow$A) Stop codon 8% 0%

Khảo sát in silico cho thấy 100% các công trình quốc tế đều lựa chọn kỹ thuật Nested-PCR để tăng độ nhạy khuếch đại và ưu tiên sử dụng mẫu mô sinh thiết cho nhóm bệnh, mẫu dịch phết không xâm lấn cho nhóm chứng. Kết quả dự đoán bằng DISULFIND cho thấy đột biến tại các biến thể làm thay đổi sự hình thành các cầu nối disulfide nội phân tử, từ đó làm biến đổi độ bền cấu trúc của chuỗi peptide RPMS1.

Trong phần thực nghiệm tại Việt Nam, quy trình tách chiết DNA bằng phenol/chloroform từ 20 mẫu mô ung thư và 20 mẫu dịch phết đạt độ tinh sạch cao với tỷ số $A_{260}/A_{280}$ nằm trong khoảng chuẩn 1,8–2,0. Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi tối ưu SNP-RPMS1-F/R đã khuếch đại thành công đoạn trình tự đặc hiệu trên các mẫu thử nghiệm, kiểm tra điện di cho thấy vạch sản phẩm sắc nét, kích thước tương đồng với lý thuyết và gene đối chứng nội Beta-actin. Quá trình giải trình tự chuỗi Sanger và hiệu chỉnh chromatogram đã ghi nhận sự xuất hiện của các biến thể SNPs tại các vị trí nucleotide 155384, 155389 và 155391 trên các dòng mẫu UTVH tại Việt Nam, khẳng định sự lưu hành của biến thể RPMS1-C tại quần thể bệnh nhân trong nước.

Phần III: Nghiên cứu tính chất biểu hiện của miR-141 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam

Phần III trình bày kết quả khai thác dữ liệu biểu hiện của microRNA-141 và thực nghiệm định lượng phân tử bằng Real-time PCR. Phân tích in silico từ các bộ dữ liệu nghiên cứu ca - chứng quốc tế cho thấy tính chất tăng biểu hiện quá mức của miR-141 có mối tương quan thuận rõ rệt với nguy cơ mắc ung thư vòm họng thông qua các chỉ số Odds Ratio (OR) và Relative Risk (RR) có ý nghĩa thống kê cao.

Trong thực nghiệm, quy trình tách chiết RNA tổng số và RT-PCR đã được tối ưu hóa cùng hệ mồi khuếch đại đoạn gen tham chiếu nội chuỗi nhỏ U6 snRNA và mồi đặc hiệu cho miR-141. Phân tích kết quả Real-time PCR dựa trên giá trị chu kỳ ngưỡng (Quantification cycle - Cq) cho thấy:

  • Nhóm mẫu mô sinh thiết ung thư vòm họng có giá trị chu kỳ ngưỡng Cq của miR-141 thấp hơn rõ rệt so với nhóm mẫu dịch phết lành tính, phản ánh mức độ tích lũy bản sao phân tử miR-141 tăng cao trong tế bào ung thư.
  • Ngược lại, giá trị Cq của gen nội chuẩn U6 duy trì ổn định giữa hai nhóm mẫu, đảm bảo độ tin cậy của phép đo định lượng tương đối.
  • Kết hợp dữ liệu phân tích giữa biến thể gene RPMS1 và biểu hiện miR-141, nghiên cứu bước đầu xác lập mối liên hệ đồng xuất hiện giữa sự hiện diện của biến thể RPMS1-C (đột biến G155391A) và hiện tượng tăng cường biểu hiện của miR-141 trên cùng một nhóm bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  1. Khảo sát Tin - Sinh học:

    • Tổng hợp và chuẩn hóa cơ sở dữ liệu về tính đa hình gene RPMS1 từ 1.410 ca bệnh và 2.296 ca chứng. Xác lập biến thể RPMS1-C (G155391A) là biến thể ưu thế trong UTVH với tần số trung bình có trọng số đạt 74% ở nhóm bệnh (so với 37% ở nhóm chứng lành tính).
    • Dự đoán và minh chứng trên mô hình tin sinh học về sự thay đổi acid amin (Aspartate thành Asparagine tại codon 155391) làm biến đổi tính bền cấu trúc peptide và mạng lưới liên kết disulfide của protein RPMS1.
    • Thống kê các con đường tín hiệu tương tác của miR-141 với các gene mục tiêu PTEN, BRD3, UBAP1, củng cố cơ chế phân tử của miR-141 như một oncogene trong khối u vòm họng.

  2. Kết quả thực nghiệm phân tử:

    • Xây dựng thành công quy trình chuẩn tách chiết DNA tinh sạch từ mẫu mô sinh thiết và dịch phết tỵ hầu, đạt tỷ số quang phổ $A_{260}/A_{280}$ trong khoảng 1,8–2,0.
    • Tối ưu hóa chu trình nhiệt phản ứng PCR cho cặp mồi SNP-RPMS1-F/R ở nhiệt độ bắt cặp 60°C, khuếch đại thành công đoạn gen mục tiêu và gene nội chứng Beta-actin.
    • Giải mã trình tự Sanger và lập bản đồ biến thể SNPs trên các mẫu UTVH tại Việt Nam, phát hiện các điểm đột biến tại vị trí 155384, 155389 và vị trí trọng điểm 155391.
    • Thiết lập quy trình Real-time PCR định lượng miR-141 với nội chuẩn U6 snRNA, chứng minh thực nghiệm mức biểu hiện của miR-141 ở nhóm bệnh nhân UTVH tại Bệnh viện Chợ Rẫy cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm người không mắc ung thư.

Đóng góp của đề tài

  • Bổ sung dữ liệu khoa học mới: Đây là một trong những công trình đầu tiên tại Việt Nam khảo sát đồng thời tính đa hình của họ gene BARTs (cụ thể là gene RPMS1 của EBV) và tính chất biểu hiện của microRNA-141 trên cùng một đối tượng bệnh nhân ung thư vòm họng trong nước.
  • Mở rộng hiểu biết dịch tễ học phân tử: Nghiên cứu cung cấp bằng chứng thực nghiệm đầu tiên ngoài phạm vi các nhóm nghiên cứu tại Trung Quốc về sự lưu hành và đặc tính phân tử của các biến thể RPMS1 thuộc chủng EBV tại Việt Nam.
  • Định hướng ứng dụng lâm sàng: Quy trình kỹ thuật PCR - giải trình tự phát hiện SNP RPMS1 và Real-time PCR định lượng miR-141 tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển các bộ công cụ biomarker phân tử phục vụ sàng lọc, chẩn đoán sớm và tiên lượng UTVH.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Quy mô cỡ mẫu thực nghiệm: Do giới hạn về thời gian thực hiện khóa luận và nguồn kinh phí nghiên cứu, số lượng mẫu thực nghiệm dừng lại ở 20 mẫu mô ung thư và 20 mẫu dịch phết đối chứng. Cỡ mẫu này đủ để xác lập quy trình và ghi nhận bước đầu nhưng cần mở rộng để đạt độ nhạy và độ đặc hiệu dịch tễ học cao hơn.
  • Tính đồng nhất của loại mẫu đối chứng: Mẫu bệnh phẩm ung thư là mẫu mô sinh thiết xâm lấn (được chẩn đoán bằng giải phẫu bệnh HE và Ki67), trong khi mẫu đối chứng lành là mẫu dịch phết tỵ hầu không xâm lấn. Sự khác biệt về loại mô/dịch thể có thể tạo ra sai số sinh học nhất định trong các phân tích so sánh định lượng.
  • Phân tích chức năng chuyên sâu: Nghiên cứu mới dừng lại ở việc phát hiện biến thể di truyền và định lượng biểu hiện phân tử, chưa tiến hành các thử nghiệm chức năng chuyên sâu (knock-down, overexpression, luciferase assay) để chứng minh trực tiếp tương tác vật lý giữa biến thể protein RPMS1 và sự điều hòa phiên mã của miR-141 trên các dòng tế bào nuôi cấy in vitro.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng quy mô khảo sát trên tập mẫu bệnh phẩm lớn hơn (từ hàng trăm đến hàng nghìn mẫu) thu nhận từ nhiều trung tâm ung bướu tại các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam.
  • Phát triển kỹ thuật tách chiết và định lượng miR-141, DNA tự do của EBV (circulating cell-free EBV DNA) trực tiếp trên các mẫu sinh thiết lỏng không xâm lấn như huyết tương, huyết thanh hoặc nước bọt của bệnh nhân.
  • Tiến hành các thử nghiệm can thiệp biểu hiện gene trên dòng tế bào ung thư vòm họng (C666-1, NPC-TW01) nhằm làm sáng tỏ cơ chế phân tử mà biến thể RPMS1-C can thiệp vào con đường tín hiệu Notch và mạng lưới điều hòa của họ microRNA-200.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận tốt nghiệp là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị cao đối với:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Hóa sinh Y học, Y đa khoa và Dược học có nhu cầu tìm hiểu về phương pháp luận nghiên cứu di truyền học ung thư và virus học phân tử.
  • Cán bộ nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm y sinh: Tham khảo trực tiếp các quy trình chuẩn (SOP) đã được tối ưu hóa trong văn bản:
    • Quy trình khai thác, đánh giá mồi in silico bằng IDT OligoAnalyzer, Primer-BLAST và Annhyb.
    • Quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol từ mẫu mô sinh thiết và dịch phết tỵ hầu.
    • Quy trình xử lý, kiểm tra đỉnh tín hiệu chromatogram và sắp gióng cột chuỗi nucleotide bằng Chromas Lite và BioEdit ClustalW.
    • Thiết kế phản ứng Real-time PCR sử dụng chất chuẩn nội U6 snRNA để định lượng các phân tử microRNA kích thước ngắn.
  • Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia ung bướu: Tiếp cận nguồn dữ liệu dịch tễ phân tử về các biến thể EBV và miRNA đặc thù trên bệnh nhân Việt Nam, hỗ trợ định hướng nghiên cứu các dấu ấn sinh học phục vụ chẩn đoán giai đoạn sớm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại lựa chọn gene RPMS1 thuộc họ gene BARTs của EBV thay vì các gene quen thuộc như LMP-1 hay EBNA-1?

Các công trình nghiên cứu về tính đa hình gene của EBV trên thế giới và tại Việt Nam trước đây phần lớn tập trung vào các họ gene mã hóa kháng nguyên nhân (EBNAs) hoặc protein màng tiềm tan (LMPs). Họ gene BARTs, đặc biệt là RPMS1, ít được khảo sát toàn diện mặc dù biểu hiện bền vững trong hầu hết các khối u liên quan đến EBV. Protein RPMS1 có vai trò quan trọng trong việc ức chế con đường tín hiệu Notch (thông qua tương tác với phức hợp CBF1/CIR), thúc đẩy tế bào phân chia và ức chế quá trình chết theo chương trình. Khảo sát gene RPMS1 mở ra hướng tiếp cận mới về tính đa dạng di truyền toàn hệ gene của EBV tại Việt Nam.

2. Biến thể nào trên gene RPMS1 có tần số xuất hiện cao nhất ở bệnh nhân ung thư vòm họng và mang đặc điểm gì?

Biến thể RPMS1-C (đặc trưng bởi đột biến điểm G155391A trên hệ gene EBV hoang dại) là biến thể nổi trội nhất. Kết quả phân tích tổng hợp in silico từ các nghiên cứu quốc tế cho thấy tần số trung bình có trọng số của RPMS1-C lên tới 74% ở nhóm bệnh nhân UTVH (trong khi ở nhóm lành chỉ chiếm 37%). Đột biến nucleotide này dẫn đến sự thay thế acid amin Aspartate thành Asparagine (D155391N), làm thay đổi cấu trúc không gian và tăng cường tính ổn định của chuỗi polypeptide RPMS1.

3. Phương pháp nào được sử dụng để kiểm tra độ tinh sạch của DNA sau khi tách chiết từ mẫu mô và dịch phết?

Độ tinh sạch và hàm lượng DNA sau tách chiết bằng phương pháp Phenol/Chloroform được đánh giá bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng 260 nm, 280 nm và 230 nm trên máy UV/VIS. Nồng độ DNA được tính toán dựa trên độ hấp thụ $A_{260}$ ($1 \text{ đơn vị } A_{260} \approx 50\ \mu\text{g/ml}$ DNA sợi đôi). Độ tinh sạch của mẫu được xác định qua tỷ số $A_{260}/A_{280}$ nằm trong giới hạn chuẩn từ 1,8 đến 2,0; chỉ số $A_{230}$ được dùng để kiểm soát việc mẫu không bị nhiễm cặn dung môi hữu cơ phenol hoặc carbohydrate.

4. Cơ chế hoạt động của miR-141 trong ung thư vòm họng được ghi nhận như thế nào?

Trong bệnh lý ung thư vòm họng, miR-141 đóng vai trò như một Oncogene (gene sinh ung) và có mức độ biểu hiện tăng cao vượt mức so với mô lành bình thường. Phân tử miR-141 gắn đặc hiệu vào vùng 3'-UTR của các phân tử mRNA đích, gây ức chế dịch mã hoặc phân hủy các gene ức chế khối u quan trọng như PTEN (dẫn đến kích hoạt con đường tín hiệu sinh tồn và tăng sinh AKT), UBAP1 và BRD3 (can thiệp vào chu kỳ tế bào qua trục Rb/E2F).

5. Khóa luận sử dụng các phần mềm tin sinh học nào trong quy trình phân tích và xử lý dữ liệu giải trình tự?

Khóa luận đã tích hợp một hệ thống công cụ tin sinh học chuyên dụng gồm:

  • NCBI BLAST và Annhyb (v4.946): Dùng để gióng hàng trình tự, kiểm tra độ tương đồng và vị trí bắt cặp của các cặp mồi trên hệ gene đích.
  • IDT OligoAnalyzer 3.1: Tính toán các thông số lý hóa của mồi (Tm, %GC, cấu trúc kẹp tóc, dimer).
  • Chromas Lite: Đọc và phân tích đỉnh tín hiệu (peaks) chromatogram của kết quả giải trình tự Sanger.
  • BioEdit: Căn chỉnh và so khớp đa trình tự nucleotide bằng thuật toán ClustalW.
  • MEGA 6.0: Phân tích tiến hóa và thiết lập cây phả hệ phân tử.
  • DISULFIND: Dự đoán trạng thái hình thành cầu nối disulfide trên các chuỗi peptide biến thể.
  • MedCalc (v16): Xử lý thống kê y sinh, kiểm định Chi bình phương, tính toán các chỉ số OR, RR và hệ số Kappa.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Hoàng Danh đã hoàn thành trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu đề ra thông qua việc kết hợp chặt chẽ giữa phân tích tin sinh học và thực nghiệm sinh học phân tử hiện đại. Đề tài đã xây dựng thành công quy trình kỹ thuật chuẩn từ khâu xử lý bệnh phẩm, tách chiết DNA/RNA đến việc xác định các biến thể đa hình gene RPMS1 bằng giải trình tự Sanger và định lượng mức biểu hiện của microRNA-141 bằng kỹ thuật Real-time PCR. Các kết quả bước đầu ghi nhận sự hiện diện của biến thể đột biến RPMS1-C cùng sự tăng cường biểu hiện của miR-141 trên nhóm bệnh nhân ung thư vòm họng tại Bệnh viện Chợ Rẫy TP.HCM, đặt nền móng dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu ứng dụng biomarker phân tử trong tầm soát và chẩn đoán sớm căn bệnh này tại Việt Nam.