Khảo sát methyl hóa gen Cyclin D2 làm biomarker trong chẩn đoán ung thư vú

Luận văn khảo sát mức độ methyl hóa gen Cyclin D2, ứng dụng làm biomarker tiềm năng trong việc chẩn đoán sớm và chính xác bệnh ung thư vú.

• Tác giả: Huỳnh Thị Kim Nhung
• Người hướng dẫn: Ts. Lê Huyền Ái Thúy
• Trường học: Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Vi sinh – Sinh học phân tử
• Đề tài: Khảo sát mức độ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter gen Cyclin D2 ứng dụng làm Biomarker trong chẩn đoán bệnh ung thư vú
• Loại tài liệu: Luận văn tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về Methyl hóa gen Cyclin D2

Methyl hóa gen Cyclin D2 là một hiện tượng epigenetics quan trọng liên quan đến sự điều hòa hoạt động của gen trong tế bào ung thư vú. Sự methyl hóa DNA xảy ra tại các đảo CpG thuộc vùng promoter gen Cyclin D2, dẫn đến sự im lặng của gen này. Cyclin D2 là một protein điều hòa chu kỳ tế bào, và khi bị methyl hóa, hoạt động bình thường của nó bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Quá trình này không liên quan đến thay đổi trình tự DNA mà là thay đổi hóa học trên bề mặt DNA. Hiểu rõ cơ chế methyl hóa Cyclin D2 giúp các nhà khoa học phát triển những biomarker chẩn đoán ung thư vú mới và hiệu quả hơn, mở ra cơ hội điều trị bệnh sớm và cải thiện tỷ lệ sống sót của bệnh nhân.

1.1. Cơ chế methyl hóa DNA

Methyl hóa DNA là quá trình gắn nhóm methyl (-CH3) vào cytosine tạo thành 5-methylcytosine (5mC). Enzyme DNA methyltransferase (DNMTs) xúc tác phản ứng này tại các vị trí CpG. Quá trình methyl hóa điều khiển hoạt động gen mà không thay đổi trình tự DNA. Sự methyl hóa ở vùng promoter gen thường dẫn đến ức chế biểu hiện gen, vì methyl cytosine cản trở các yếu tố phiên mã gắn vào DNA.

1.2. Gen Cyclin D2 và vai trò trong tế bào

Gen Cyclin D2 mã hóa protein điều hòa chu kỳ tế bào, giúp kiểm soát sự phân chia tế bào bình thường. Cyclin D2 kết hợp với Cyclin-dependent kinase (CDK), phosphoryl hóa protein Rb, giải phóng E2F để cho phép tế bào tiến vào giai đoạn S. Trong ung thư vú, sự methyl hóa Cyclin D2 gây im lặng gen này, ảnh hưởng đến quá trình điều hòa chu kỳ tế bào bình thường.

II. Methyl hóa Cyclin D2 làm Biomarker chẩn đoán

Biomarker chẩn đoán ung thư vú dựa trên methyl hóa gen Cyclin D2 là một phát hiện đột phá trong sinh học phân tử. Các nghiên cứu khảo sát mức độ methyl hóa tại các đảo CpG vùng promoter Cyclin D2 cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa mô ung thư và mô bình thường. Sử dụng phương pháp MSP (Methylation-specific PCR), các nhà khoa học có thể phát hiện trạng thái methyl hóa của Cyclin D2 từ mẫu mô hoặc máu bệnh nhân. Biomarker này có tiềm năng cao trong chẩn đoán sớm ung thư vú, giúp bác sĩ xác định bệnh ở giai đoạn sớm khi điều trị còn hiệu quả. Độ nhạy và độ đặc hiệu của methyl hóa Cyclin D2 như một biomarker được chứng minh qua nhiều dòng tế bào ung thư vú khác nhau.

2.1. Tính chất của Biomarker epigenetics

Biomarker epigenetics như methyl hóa Cyclin D2 có ưu điểm không thay đổi trình tự DNA gốc. Methyl hóa có thể được phát hiện bằng các phương pháp nhạy và cụ thể. Khác với đột biến gen, trạng thái methyl hóa có thể thay đổi, mở ra khả năng điều trị bằng cách khôi phục hoạt động gen. Biomarker này dễ dàng phát hiện từ mẫu mô bệnh, huyết tương hoặc nước tiểu, thích hợp cho chẩn đoán lâm sàng.

2.2. Ứng dụng lâm sàng trong chẩn đoán

Phát hiện methyl hóa Cyclin D2 giúp các bác sĩ phân biệt mô ung thư vú từ mô bình thường với độ chính xác cao. Biomarker này hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thư vú, cho phép can thiệp y tế sớm. Kết hợp với các biomarker khác, methyl hóa Cyclin D2 tạo thành bộ công cụ chẩn đoán toàn diện. Ứng dụng lâm sàng có thể mở rộng sang dự báo tiên lượng và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân.

III. Phương pháp khảo sát methyl hóa Cyclin D2

Để khảo sát mức độ methyl hóa gen Cyclin D2, các nhà khoa học sử dụng phương pháp MSP (Methylation-specific PCR) kết hợp với biến đổi Bisulfite. Quá trình bắt đầu bằng tách chiết DNA từ mẫu mô ung thư vú, sau đó thực hiện xác định nồng độ và độ tinh sạch DNA. Tiếp theo là bước biến đổi Bisulfite, trong đó cytosine không được methyl hóa chuyển thành uracil, còn 5-methylcytosine giữ nguyên. Sau đó, sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các đoạn DNA methyl và unmethyl riêng biệt. Kết quả được phân tích bằng điện di để quan sát sự hiện diện của các băng DNA. Phương pháp này cô lập và xác định chính xác mức độ methyl hóa tại các đảo CpG vùng promoter Cyclin D2.

3.1. Phương pháp MSP và ứng dụng

Phương pháp MSP (Methylation-specific PCR) sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại DNA methyl riêng và DNA unmethyl riêng. Mồi được thiết kế để nhận biết trạng thái methyl hóa cụ thể tại các vị trí CpG. Phản ứng PCR khuếch đại DNA theo chu kỳ nhiệt được lập trình sẵn, tạo ra sản phẩm có kích thước xác định. Kỹ thuật MSP cho phép phát hiện nhanh methyl hóa Cyclin D2 mà không cần trình tự hóa gen toàn bộ, tiết kiệm chi phí và thời gian.

3.2. Biến đổi Bisulfite và chuẩn bị mẫu

Biến đổi Bisulfite là bước chuẩn bị quan trọng để phân biệt DNA methyl và unmethyl. Sodium bisulfite chuyển đổi cytosine thành uracil, nhưng 5-methylcytosine không bị ảnh hưởng. Quá trình này tạo ra khác biệt trình tự DNA dựa trên trạng thái methyl hóa. Sau biến đổi, DNA được tinh sạch và chuẩn bị cho phản ứng MSP. Kit EpiTect Bisulfite được sử dụng để biến đổi DNA bộ gen hiệu quả, đảm bảo chất lượng mẫu cho các bước phân tích tiếp theo.

IV. Ý nghĩa lâm sàn và triển vọng nghiên cứu

Khám phá methyl hóa gen Cyclin D2 như một biomarker chẩn đoán ung thư vú có ý nghĩa lâm sàn sâu sắc. Phát hiện sớm methyl hóa Cyclin D2 có thể cứu sống hàng triệu bệnh nhân trên toàn thế giới bằng cách cho phép chẩn đoán sớm ung thư vú. Việc áp dụng biomarker epigenetics này vào thực hành lâm sàn giúp giảm thiểu can thiệp xâm lấn và cải thiện chất lượng cuộc sống bệnh nhân. Triển vọng nghiên cứu tiếp theo bao gồm kết hợp methyl hóa Cyclin D2 với các biomarker khác để tạo bộ công cụ chẩn đoán toàn diện. Phát triển liệu pháp khôi phục hoạt động Cyclin D2 thông qua ức chế DNA methyltransferase (DNMT) hoặc thuốc epigenetics mới sẽ mở ra chiến lược điều trị ung thư vú hiệu quả hơn.

4.1. Ý nghĩa lâm sàn trong chẩn đoán sớm

Methyl hóa Cyclin D2 giúp chẩn đoán ung thư vú sớm khi bệnh còn ở giai đoạn có thể điều trị hiệu quả. Biomarker này phát hiện các tế bào ung thư sớm hơn các phương pháp hình ảnh truyền thống. Sử dụng methyl hóa Cyclin D2 để sàng lọc bệnh giảm tỷ lệ tử vong ung thư vú. Ứng dụng lâm sàn của biomarker epigenetics cải thiện dự hậu bệnh nhân đáng kể qua can thiệp sớm và điều trị phù hợp.

4.2. Hướng phát triển liệu pháp epigenetics

Hiểu biết về methyl hóa Cyclin D2 tạo cơ sở phát triển liệu pháp epigenetics mới để khôi phục hoạt động gen. Thuốc ức chế DNMT và thuốc epigenetics khác có thể thay đổi trạng thái methyl hóa của Cyclin D2 trong tế bào ung thư. Kết hợp liệu pháp epigenetics với hóa trị hoặc liệu pháp miễn dịch có thể tăng hiệu quả điều trị ung thư vú. Nghiên cứu cơ chế methyl hóa mở ra cơ hội phát triển thuốc độc quyền nhằm điều trị ung thư vú hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo số liệu thống kê của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC - International Agency for Research on Cancer) thuộc Tổ chức Y tế thế giới thì ung thư vú là ung thư có tầng số cao nhất ở nữ giới vào năm 2008, chiếm 23% trong tổng số ung thư ở nữ. Ung thư vú trở thành ung thư phổ biến nhất ở cả khu vực các nước phát triển và các nước đang phát triển. Riêng tại Việt Nam vào năm 2008 ung thư vú đứng thứ ba sau ung thư phổi và ung thư gan. Chụp nhũ ảnh là phương pháp hiện ung thư vú phổ biến hiện nay.

Tuy nhiên phương pháp chụp nhũ ảnh có độ nhạy dao động từ khoảng 68% đến 93%. Chụp nhũ ảnh ít nhạy đối với những phụ nữ trẻ tuổi, phụ nữ châu Á hay những phụ nữ có mật độ vú dày đặc. Vì cậy cần có một phương pháp phát hiện ung thư vú có độ nhạy cao hơn, có thể khắc khục được những nhược điểm của phương pháp chụp nhũ ảnh [1]. Biến đổi Epigenetics bất thường là biến đổi được đề cập trên nhiều bệnh ung thư.

Đây là những biến đổi về mặt di truyền trong biểu hiện gen không liên quan đến những biến đổi về trình tự DNA [1]. Sự im lặng của gen ức chế khối u do sự methyl hóa quá mức promoter là biến đổi Epigenetics bất thường có tần số cao, phát hiện sớm trong các khối u, trong đó có các khối u ở ung thư vú [1]. Gen Cyclin D2 là gen tham gia vào chu trình tế bào, phiên mã tạo ra protein Cyclin D2. Đây là một protein thuộc Cyclin nhóm D (D type cyclin bao gồm cyclin D1, D2, D3) [2].

Cyclin nhóm D liên kết với enzyme kinase phụ thuộc protein Cyclin (CDKs) tạo thành phức hợp Cyclin D/CDKs, phức hợp này đóng một vai trò quan trọng trong điều hòa chu trình tế bào [3]. Đã có nhiều nghiên cứu phát hiện có sự methy hóa quá mức vùng promoter của gen Cyclin D2 trong những mẫu mô ung thư vú. Trong đó theo nghiên cứu của Evron và cộng sự thì sự methyl hóa vượt mức vùng promoter của gen Cyclin D2 dẫn đến im lặng của gen này trên đa số dòng tế bào ung thư vú, trong khi đó ở những tế bào mô biểu bì vú bình thường có sự biểu hiện bình thương của gen này [2]. LÊ HUYỀN ÁI THÚY 1 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Huỳnh Thị Kim Nhung Theo một nghiên cứu khác của Fackler và cộng sự phát hiện sự methyl hóa quá mức vùng promoter của gen Cyclin D2 trên những mẫu mô ung thư vú khác nhau như: trong ung thư vú biểu mô tại chỗ tần số methyl hóa là 23%, ung thư biểu mô xâm lấn là 32 %, ung thư ống dẫn sữa tại chỗ là 32 %, ung thư ống dẫn sữa xâm lấn là 52%.

Cũng theo Fackler thì tần số methyl hóa của gen Cyclin D2 không cao nhưng sự methyl hóa quá mức vùng promoter của gen Cyclin D2 đặc trưng trên ung thư vú. Vì vậy việc khảo sát mức độ methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter của gen Cyclin D2 hứa hẹn trở thành một biomarker trong chẩn đoán ung thư vú. LÊ HUYỀN ÁI THÚY 2 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Huỳnh Thị Kim Nhung PHẦN I TỔNG QUAN GVHD: TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY 3 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Huỳnh Thị Kim Nhung 1.

TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ 1. TÌNH HÌNH UNG THƯ VÚ TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM: Theo số liệu thống kê của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC - International Agency for Research on Cancer) thuộc Tổ chức Y tế thế giới thì ung thư vú là ung thư có tầng số cao nhất ở nữ giới, ước tính có 1,38 triệu trường hợp ung thư mới được chẩn đoán năm 2008, chiếm 23% trong tổng số ung thư ở nữ giới. Ung thư vú trở thành ung thư phổ biến nhất ở cả khu vực các nước phát triển và các nước đang phát triển, với ước tính khoảng 690000 trường hợp ung thư vú mới ở mỗi vùng. Tỷ lệ mắc bệnh thay đổi từ 19,3 trên 100000 phụ nữ ở Đông Phi cho đến 89,7 trên 100000 phụ nữ ở Tây Âu, và lớn hơn 80 trên 100000 phụ nữ trong khu vực các nước đang phát triển.

Theo tỷ lệ tử vong thì ung thư vú vẫn là nguyên nhân tử vong thường gặp nhất của bệnh ung thư ở phụ nữ: khu vực các nước đang phát triển ước tính có 269000 ca tử vong chiếm 12,7% của tổng số ung thư ở nữ, trong khi con số ở các nước phát triển là 189000 ca. Tại Việt Nam, ung thư vú là loại ung thư có tầng số cao nhất ở Hà Nội và đứng thứ hai sau ung thư cổ tử cung ở thành phố Hồ Chí Minh. Cũng theo cơ quan Nghiên cứu Ung thư quốc tế (IARC), vào năm 2008 tại Việt Nam ung thư vú đứng thứ ba sau ung thư gan và phổi. Ước tính có 6830 trường hợp mắc bệnh chiếm 15.6% trong các loại bệnh ung thư và 2423 ca tử vong mỗi năm (chiếm 5.7% các trường hợp mắc bệnh).

UNG THƯ VÚ VÀ PHÂN LOẠI Vú có cấu tạo cơ bản là mỡ, bầu vú không có cơ, nhưng nó bám chắc vào cơ ngực trên xương sườn. Ngoài ra, vú được nâng đỡ bởi các cơ xung quanh cùng với các dây chằng liên kết nó với xương ở cổ như xương cánh tay và xương sườn. Núm vú là nơi tập trung nhiều đầu mút thần kinh nhạy cảm với kích thích. Bên trong vú là hệ thống sinh sữa còn được gọi tuyến sữa.

Tuyến sữa bao gồm tiểu thùy và ống GVHD: TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY 4 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Huỳnh Thị Kim Nhung dẫn sữa từ tiểu thùy tới núm vú. Mô mỡ và mô liên kết bao quanh tuyến sữa mạch máu và các mạch bạch huyết [4].1- Cấu tạo vú Có nhiều dạng ung thư, nhưng mọi trường hợp ung thư đều bắt đầu khi một nhóm tế bào trong cơ thể tăng trưởng bất bình thường vượt ngoài tầm kiểm soát. Tế bào ung thư cứ tiếp tục tăng lên thêm và lấn át tế bào bình thường [4].

Đa số trường hợp ung thư vú bắt đầu ở các tế bào trong ống dẫn, tiểu thùy. Còn lại một số ít trường hợp bắt đầu từ những mô khác ở vú [4]. Tùy từng giai đoạn và vị trí bệnh, ung thư vú được chia thành nhiều dạng khác nhau, dưới đây là những dạng ung thư vú thường gặp. Ung thư ống dẫn tại chỗ (DCIS - Ductal carcinoma in situ): đây là dạng phổ biến nhất của ung thư vú không xâm lấn.

Đối với ung thư ống dẫn tại chỗ tế bào ung thư chỉ có trong ống dẫn, không xâm lấn vào các mô khác của vú. Người có DCIS thì có nguy cơ ung thư vú xâm lấn cao hơn [4]. Ung thư tiểu thùy tại chỗ (LCIS - Lobular carcinoma in situ): tế bào ung thư bắt đầu trong tiểu thùy của tuyến sữa, ung thư tiểu thùy tại chỗ không di căn đến các GVHD: TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY 5 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Huỳnh Thị Kim Nhung bộ phận các của cơ thể.

Ung thư tiểu thùy tại chỗ được cho không không phải là ung thư vú thật. Tuy nhiên đối với người có ung thư tiểu thùy tại chỗ có nguy cơ gia tăng ung vú xâm lấn cao hơn, vì vậy họ cần phải được thăm khám thường xuyên [4]. Ung thư ống dẫn xâm lấn (IDC - Invasive ductal carcinoma): là ung thư vú bắt đầu tại ống dẫn sữa, tăng trưởng lan ra khỏi ống thành ống dẫn bệnh xâm nhập vào các mô mỡ của vú. Ung thư cũng có thể di căn tới những bộ phận khác của cơ thể [4].

Ung thư tiểu thùy xâm lấn (ILC - Invasive Lobular Carcinoma) : là ung thư vú bắt đầu ở tiểu thùy của tuyến sữa. Bệnh có thể di căn tới những bộ phận khác của cơ thể [4]. Ung thư vú dạng viêm (IBC - Inflammatory breast cancer): đây là dạng ung thư vú không phổ biến, ung thư dạng viêm chỉ chiếm 1% đến 3% trong tất cả các dạng ung thư vú. Ung thư vú dạng viêm không hình thành khối u mà thay vào đó da vùng vú đỏ và ấm, da trong dày hơn và sần sùi như vỏ cam.

Trong giai đoạn đầu thì ung thư vú dạng viêm thường bị nhầm lẫn với nhiễm trùng [4]. NHỮNG YẾU TỐ LÀM GIA TĂNG NGUY CƠ MẮC BỆNH UNG THƯ VÚ: Có nhiều yếu tố làm gia tăng nguy cơ mắc ung thư vú như [4]: - Giới tính là nữ thì có nguy cơ mắc bệnh ung thư vú cao. Tuy nhiên ở nam giới cũng có thể phát triển ung thư vú. - Khả năng bị bệnh ung thư vú tăng lên ở những phụ nữ lớn tuổi.

Khoảng 2 trong 3 phụ nữ mắc bệnh ung thư vú xâm lấn có độ tuổi khoảng 55 tuổi hoặc lớn tuổi hơn khi được phát hiện. - Những phụ nữ có người thân như mẹ, chị hay em gái mắc bệnh thì có nguy cơ mắc bệnh cao hơn. - Tiền sử bệnh ung thư vú của bản thân: một phụ nữ mắc bệnh ung thư vú ở một bên thì nguy cơ mắc bệnh ở vú còn lại hoặc những phần khác ở cùng vú đó sẽ có khả năng mắc bệnh cao hơn. LÊ HUYỀN ÁI THÚY 6 Luận văn tốt nghiệp SVTH: Huỳnh Thị Kim Nhung - Chủng tộc: phụ nữ da trắng dễ bị ung thư vú hơn phụ nữ Mỹ gốc phi, tuy nhiên lại có nhiều khả năng chết vì ung thư vú hơn.

Phụ nữ châu Á, Tây Ban Nha, và phụ nữ người Mỹ bản địa có nguy cơ mắc bệnh và chết vì ung thư vú thấp hơn. - Những phụ nữ có mô vú dày đặc có nguy cơ mắc bệnh cao. Mô vú dày đặc có nghĩa là mô tuyến nhiều hơn mô mỡ. - Dinh dưỡng và rượu: ăn nhiều mỡ cũng như uống nhiều rượu làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú.

- Phụ nữ sử dụng kích thích tố sau khi tắt kinh trên năm năm có nguy cơ mắc bệnh ung thư vú cao hơn. TỔNG QUAN EPIGENETICS: 2. ĐỊNH NGHĨA EPIGENETICS Thuật ngữ epigenetics được sử dụng lần đầu tiên bởi nhà phôi sinh học Conrad Waddington của trường đại học Cambridge vào năm 1939. Ông đã sử dụng thuật ngữ epigenetic để diễn tả nguồn gốc sự phát triển của sinh vật.

Theo ông đặc tính hình thái, chức năng của một sinh vật xuất hiện liên tục dưới một chương trình được thiết lập bởi bộ gen và chịu ảnh hưởng từ môi trường sống của sinh vật [5]. Theo sinh học phân tử hiện đại thì thuật ngữ epigenetics được mở rộng hơn, Feinberg cho rằng epigenetics là những biến đổi về mặt di truyền trong biểu hiện gen không liên quan đến những biến đổi về trình tự DNA [5].