Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phương pháp phát hiện virut hadv gây bệnh đau mắt đỏ ở việt nam bằng kỹ thuật pcr kết hợp với giải trình tự

Luận văn: Nghiên cứu PCR & giải trình tự phát hiện Adenovirus (HAdV) gây đau mắt đỏ tại Việt Nam. Phương pháp mới, chính xác, hiệu quả.

• Tác giả: Nguyễn Quang Hưng
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Sáng
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phƣơng Pháp Phát Hiện Virut HAdV Gây Bệnh Đau Mắt Đỏ Ở Việt Nam Bằng Kỹ Thuật PCR Kết Hợp Giải Trình Tự
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Bệnh đau mắt đỏ
• 1.1.1. Tình hình bệnh đau mắt đỏ trên thế giới
• 1.1.2. Tình hình bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam
• 1.1.3. Triệu chứng đau mắt đỏ do HAdV
• 1.1.4. Con đường lây lan của bệnh đau mắt đỏ do HAdVs
• 1.2. Tổng quan về HAdV và HAdV gây bệnh đau mắt đỏ
• 1.2.1. HAdV gây bệnh đau mắt đỏ
• 1.3. Phương pháp phát hiện nhanh các chủng HAdV
• 1.3.1. Phương pháp phân lập virut
• 1.3.2. Phương pháp khuếch đại gen chỉ thị
• 1.3.3. Kỹ thuật PCR. Vùng gen đích và ý nghĩa
• 1.3.4. Kĩ thuật giải trình tự
• 1.4. Xây dựng cây chủng loại phát sinh
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu, hóa chất và thiết bị
• 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Tách chiết ADN hệ gen của human adenovirus
• 2.2.2. Thiết kế mồi
• 2.2.3. PCR khuếch đại các đoạn gen hexon, penton và fiber
• 2.2.4. Tinh sạch, giải trình tự các đoạn gen hexon, penton và fiber
• 2.2.5. Phân tích trình tự và xây dựng cây mô hình quan hệ di truyền
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm
• 3.2. Kết quả khuếch đại các đoạn gen chỉ thị
• 3.2.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen hexon (600 bp)
• 3.2.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen penton (1118 bp)
• 3.2.3. Kết quả khuếch đại đoạn gen fiber (1264 bp)
• 3.3. Kết quả giải và so sánh trình tự
• 3.3.1. Kết quả phân tích trình tự gen hexon
• 3.3.2. Kết quả phân tích trình tự gen penton
• 3.3.3. Kết quả phân tích trình tự gen fiber
• 3.4. Kết quả phân tích cây quan hệ di truyền
• 3.4.1. Phân loại các chủng HAdV dựa trên trình tự gen hexon
• 3.4.2. Phân loại các chủng HAdV dựa trên trình tự gen penton
• 3.4.3. Phân loại các chủng HAdV dựa trên trình tự gen fiber
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan virut HAdV gây bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam

Bệnh đau mắt đỏ, hay viêm kết mạc cấp, là một bệnh lý nhãn khoa phổ biến trên toàn cầu, đặc biệt tại Việt Nam. Tác nhân chính gây ra các đợt dịch lớn là Human Adenovirus (HAdV), một loại virus có khả năng lây lan nhanh chóng trong cộng đồng. Nghiên cứu của Nguyễn Quang Hưng (2017) chỉ ra rằng, tại Việt Nam, dịch đau mắt đỏ do HAdV bùng phát định kỳ, thường vào khoảng tháng 7 đến tháng 10 hàng năm, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe và sinh hoạt của người dân. HAdV là virus không có vỏ bọc, chứa bộ gen là ADN sợi kép, với hơn 50 chủng đã được xác định. Cấu trúc vỏ capsid của virus bao gồm các protein chính là hexon, penton và fiber, đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập vào tế bào chủ và cũng là mục tiêu cho các kỹ thuật chẩn đoán phân tử. Việc hiểu rõ về đặc điểm sinh học phân tử của HAdV là nền tảng để phát triển các phương pháp phát hiện chính xác, góp phần vào công tác giám sát dịch tễ học đau mắt đỏ và đưa ra các biện pháp phòng chống hiệu quả. Sự đa dạng về chủng loại của virus này cũng đặt ra thách thức lớn trong việc phát triển vắc-xin phòng bệnh, khiến cho việc chẩn đoán sớm và chính xác trở thành ưu tiên hàng đầu trong y tế cộng đồng.

1.1. Hiểu rõ về Human Adenovirus HAdV và cấu trúc

Human Adenovirus (HAdV) thuộc họ Adenoviridae, là một nhóm virus có ADN sợi kép, không có vỏ bọc ngoài. Cấu trúc của HAdV rất đặc trưng với vỏ capsid hình khối 20 mặt, được tạo thành từ các protein chính: hexon, penton và fiber. Hexon là protein chiếm số lượng lớn nhất, tạo nên các mặt của khối đa diện. Penton nằm ở các đỉnh và các sợi fiber nhỏ nhô ra từ penton. Chính các protein này, đặc biệt là fiber và penton, đóng vai trò then chốt trong quá trình virus bám và xâm nhập vào tế bào vật chủ. Do đó, các gen mã hóa cho những protein này, như gen hexon, penton và fiber, thường được chọn làm mục tiêu trong các nghiên cứu y sinh về phân loại và xác định kiểu gen HAdV.

1.2. Tình hình dịch tễ học đau mắt đỏ do HAdV gây ra

Tại Việt Nam, các đợt dịch đau mắt đỏ bùng phát mạnh mẽ, đặc biệt tại các thành phố lớn và khu dân cư đông đúc. Luận văn trích dẫn, "Tại bệnh viện Mắt trung ương có khoảng 1200 - 1500 lượt người bệnh đến khám điều trị được bác sĩ chẩn đoán là đau mắt đỏ trong mùa dịch". Con đường lây lan của HAdV rất đa dạng, chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp với dịch tiết mắt của người bệnh, qua các vật dụng cá nhân bị nhiễm bẩn, hoặc qua giọt bắn đường hô hấp. Tốc độ lây lan nhanh chóng của tác nhân gây viêm kết mạc cấp này khiến việc kiểm soát dịch trở nên khó khăn. Việc giám sát dịch tễ học đau mắt đỏ và xác định các chủng HAdV lưu hành là cực kỳ quan trọng để dự báo và ứng phó kịp thời với các đợt dịch trong tương lai.

II. Thách thức trong chẩn đoán viêm kết mạc do HAdV

Việc chẩn đoán viêm kết mạc do Human Adenovirus gây ra đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là trong việc phân biệt với các nguyên nhân khác như vi khuẩn hoặc dị ứng. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống thường bộc lộ nhiều hạn chế. Trước đây, phân lập virus Adeno trên môi trường nuôi cấy tế bào được xem là "tiêu chuẩn vàng", tuy nhiên quy trình này đòi hỏi thời gian dài (có thể lên đến vài tuần), kỹ thuật phức tạp và chi phí cao. Hơn nữa, độ nhạy của phương pháp này không cao, dễ cho kết quả âm tính giả nếu lượng virus trong mẫu bệnh phẩm thấp. Một phương pháp khác là xác định huyết thanh học, nhưng cũng không thể cho kết quả nhanh chóng trong giai đoạn cấp tính của bệnh. Những hạn chế này dẫn đến việc điều trị thường chỉ dựa trên triệu chứng lâm sàng, có thể gây ra sự nhầm lẫn và chậm trễ, làm tăng nguy cơ lây lan trong cộng đồng và dẫn đến các biến chứng nguy hiểm cho bệnh nhân. Do đó, việc phát triển một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và đặc hiệu là yêu cầu cấp thiết để cải thiện hiệu quả điều trị và kiểm soát dịch bệnh.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán truyền thống

Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy phân lập virus Adeno hay xét nghiệm miễn dịch có nhiều nhược điểm. Luận văn của Nguyễn Quang Hưng (2017) nêu rõ: "Những phương pháp này có nhược điểm là phức tạp, tốn thời gian và có độ chính xác còn hạn chế". Phương pháp nuôi cấy tế bào đòi hỏi phòng thí nghiệm đạt chuẩn an toàn sinh học cấp II, đội ngũ kỹ thuật viên tay nghề cao và thời gian chờ kết quả kéo dài. Trong khi đó, các xét nghiệm miễn dịch phát hiện kháng nguyên thường có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp hơn so với các kỹ thuật sinh học phân tử, dễ bỏ sót các trường hợp nhiễm bệnh với tải lượng virus thấp.

2.2. Nhu cầu cấp thiết về kỹ thuật chẩn đoán chính xác hơn

Sự chậm trễ và thiếu chính xác trong chẩn đoán có thể dẫn đến việc lạm dụng kháng sinh (trong trường hợp nhầm với nhiễm khuẩn) hoặc sử dụng corticoid không đúng cách, làm kéo dài thời gian tồn tại của virus và tăng nguy cơ biến chứng. Nhu cầu về một công cụ chẩn đoán nhanh chóng, chính xác để xác định sự hiện diện của HAdV là rất lớn. Một phương pháp lý tưởng cần đáp ứng các tiêu chí: thời gian cho kết quả nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR cao, có khả năng xác định được các chủng virus khác nhau, và chi phí hợp lý để có thể triển khai rộng rãi tại các cơ sở y tế. Đây chính là động lực thúc đẩy các nghiên cứu y sinh hướng tới ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử.

III. Phương pháp xét nghiệm PCR HAdV Độ nhạy và đặc hiệu

Để khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống, kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã được nghiên cứu và ứng dụng. Đây là một phương pháp sinh học phân tử cho phép khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần chỉ trong vài giờ. Nghiên cứu của Nguyễn Quang Hưng đã tập trung vào việc xây dựng một quy trình xét nghiệm PCR HAdV tối ưu để phát hiện HAdV trực tiếp từ mẫu dịch tiết kết mạc. Quy trình này bắt đầu bằng việc tách chiết DNA virus từ mẫu bệnh phẩm, sau đó sử dụng các cặp mồi và probe cho PCR được thiết kế đặc hiệu để bám vào các vùng gen bảo thủ trên bộ gen của HAdV, cụ thể là các gen mã hóa protein hexon, penton và fiber. Kỹ thuật PCR cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội, có khả năng phát hiện được lượng virus rất nhỏ mà các phương pháp khác có thể bỏ sót. Dẫn chứng từ luận văn cho thấy, trong tổng số 122 mẫu bệnh phẩm, phương pháp PCR đã phát hiện được 66 mẫu dương tính với HAdV, chứng tỏ hiệu quả cao trong việc sàng lọc và xác định tác nhân gây bệnh ngay từ giai đoạn sớm.

3.1. Nguyên lý cơ bản của phản ứng chuỗi polymerase PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) hoạt động dựa trên nguyên tắc sao chép DNA trong ống nghiệm. Quá trình này gồm ba bước chính lặp đi lặp lại trong nhiều chu kỳ: biến tính (tách hai mạch DNA ở nhiệt độ cao), bắt cặp (các đoạn mồi đặc hiệu gắn vào mạch khuôn ở nhiệt độ thấp hơn) và kéo dài (enzyme DNA polymerase tổng hợp mạch mới). Bằng cách lặp lại chu trình này 30-40 lần, một đoạn gen mục tiêu có thể được nhân lên theo cấp số nhân. Sự thành công của xét nghiệm PCR HAdV phụ thuộc rất lớn vào việc thiết kế mồi chính xác và tối ưu hóa điều kiện phản ứng.

3.2. Quy trình tách chiết DNA virus và thiết kế mồi chuyên biệt

Bước đầu tiên và quan trọng là quy trình tách chiết DNA virus khỏi mẫu bệnh phẩm. Nghiên cứu đã sử dụng bộ kit thương mại để đảm bảo thu được DNA virus với độ tinh sạch cao, loại bỏ các chất ức chế có thể ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Tiếp theo, các cặp mồi và probe cho PCR được thiết kế dựa trên các vùng trình tự bảo thủ của gen hexon, penton và fiber. Việc lựa chọn các gen này làm mục tiêu rất quan trọng vì chúng vừa có vùng bảo thủ để mồi bám vào, lại vừa có các vùng siêu biến (HVR) cho phép phân loại chủng ở bước tiếp theo. Luận văn đã thiết kế thành công các cặp mồi đặc hiệu cho phép khuếch đại thành công các đoạn gen này từ các chủng HAdV khác nhau.

IV. Kỹ thuật giải trình tự gen virus xác định kiểu gen HAdV

Mặc dù PCR có thể xác nhận sự hiện diện của HAdV, kỹ thuật này không thể phân biệt được các chủng virus khác nhau. Để giải quyết vấn đề này, nghiên cứu đã kết hợp PCR với giải trình tự gen virus. Sau khi các đoạn gen hexon, penton và fiber được khuếch đại thành công bằng PCR, sản phẩm sẽ được tinh sạch và tiến hành giải trình tự Sanger. Kỹ thuật này cho phép đọc chính xác trình tự các nucleotide (A, T, G, C) của đoạn gen đó. Dữ liệu trình tự thu được sau đó được so sánh với cơ sở dữ liệu gen quốc tế (GenBank) bằng công cụ BLAST để xác định kiểu gen HAdV một cách chính xác. Việc xác định được chủng virus gây bệnh có ý nghĩa lớn trong việc nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử, truy vết nguồn lây và hiểu rõ hơn về độc lực của từng chủng. Kết hợp hai kỹ thuật này tạo thành một quy trình mạnh mẽ, vừa có độ nhạy cao của PCR, vừa có độ chính xác trong định danh của giải trình tự, mở ra hướng đi mới trong chẩn đoán và nghiên cứu các bệnh truyền nhiễm do virus.

4.1. Vai trò của giải trình tự trong nghiên cứu sinh học phân tử

Giải trình tự gen virus là công cụ không thể thiếu trong các nghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử. Nó cung cấp thông tin chi tiết nhất về bộ gen của virus, giúp các nhà khoa học xác định các đột biến, sự tái tổ hợp gen giữa các chủng và theo dõi sự tiến hóa của virus theo thời gian. Trong nghiên cứu này, việc giải trình tự các gen hexon, penton, và fiber giúp khẳng định chính xác các chủng HAdV đang lưu hành tại Việt Nam, bao gồm HAdV-3, HAdV-4, HAdV-7, HAdV-37 và đặc biệt là HAdV-8.

4.2. Phân tích cây phả hệ để truy vết mối quan hệ di truyền

Dữ liệu trình tự gen sau khi thu được sẽ được sử dụng để xây dựng phân tích cây phả hệ. Đây là một sơ đồ biểu diễn mối quan hệ di truyền và tiến hóa giữa các chủng virus. Bằng cách so sánh trình tự gen của các mẫu thu thập được với các chủng đã biết trên thế giới, cây phả hệ có thể chỉ ra nguồn gốc, con đường lây lan và sự đa dạng di truyền của các chủng HAdV tại Việt Nam. Trong luận văn, việc xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên gen hexon đã cho thấy 52 mẫu thuộc về chủng HAdV-8, khẳng định đây là chủng gây bệnh đau mắt đỏ phổ biến trong giai đoạn nghiên cứu.

V. Kết quả phát hiện HAdV từ mẫu bệnh phẩm tại Việt Nam

Ứng dụng quy trình PCR kết hợp giải trình tự, nghiên cứu đã phân tích 122 mẫu bệnh phẩm thu thập từ Bệnh viện Mắt Trung ương trong giai đoạn 2015-2017. Kết quả đã xác định kiểu gen HAdV trong 66 mẫu (chiếm 54.1%). Đáng chú ý, phân tích sâu hơn về các chủng virus cho thấy sự đa dạng nhưng có một chủng chiếm ưu thế tuyệt đối. Cụ thể, nghiên cứu đã phát hiện 5 chủng HAdV khác nhau, bao gồm HAdV-3 (3 mẫu), HAdV-4 (1 mẫu), HAdV-7 (2 mẫu), HAdV-37 (1 mẫu) và HAdV-8 (59 mẫu). Kết quả này cho thấy chủng HAdV-8 là tác nhân gây viêm kết mạc cấp chủ yếu trong các đợt dịch tại Việt Nam trong thời gian nghiên cứu, chiếm tới 89.4% trong tổng số các mẫu dương tính. Phát hiện này cung cấp bằng chứng khoa học quan trọng cho các cơ quan y tế công cộng, giúp định hướng các chiến lược phòng chống dịch tập trung vào chủng virus phổ biến nhất. Đồng thời, sự hiện diện của các chủng khác cũng là một lời cảnh báo về nguy cơ bùng phát dịch do nhiều chủng HAdV khác nhau gây ra.

5.1. Các chủng HAdV phổ biến gây viêm kết mạc cấp được định danh

Kết quả giải trình tự gen virus đã định danh chính xác 5 chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ. Trong đó, HAdV-8 và HAdV-37 thuộc loài D, HAdV-3 và HAdV-7 thuộc loài B, và HAdV-4 thuộc loài E. Sự đa dạng về loài và chủng cho thấy quần thể virus HAdV tại Việt Nam rất phong phú. Việc xác định chính xác các chủng này là cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu sâu hơn về vắc-xin và thuốc kháng virus trong tương lai, cũng như giúp so sánh dịch tễ học của Việt Nam với các quốc gia khác trong khu vực và trên thế giới.

5.2. Tỷ lệ và đặc điểm của chủng HAdV 8 trong các đợt dịch

Chủng HAdV-8 được xác định là nguyên nhân chính gây ra các vụ dịch đau mắt đỏ tại Việt Nam. Với 59 trên 66 mẫu dương tính, HAdV-8 cho thấy khả năng lây truyền và gây bệnh vượt trội so với các chủng khác trong giai đoạn khảo sát. Phân tích trình tự gen của các mẫu HAdV-8 cho thấy mức độ tương đồng rất cao (99-100%), cho thấy có thể một dòng virus HAdV-8 duy nhất đang lưu hành và gây ra dịch trên diện rộng. Kết quả này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc giám sát liên tục để phát hiện sớm sự xuất hiện của các biến thể mới hoặc sự trỗi dậy của các chủng HAdV khác.

VI. Hướng đi mới trong nghiên cứu y sinh và phòng chống dịch

Nghiên cứu thành công phương pháp phát hiện virus HAdV bằng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự đã mở ra một hướng đi mới và hiệu quả cho lĩnh vực nghiên cứu y sinh và công tác y tế dự phòng tại Việt Nam. Phương pháp này không chỉ giải quyết được những hạn chế của các kỹ thuật chẩn đoán cũ mà còn cung cấp thông tin chi tiết ở cấp độ phân tử về tác nhân gây bệnh. Ý nghĩa thực tiễn của nghiên cứu là rất lớn, giúp các bác sĩ lâm sàng có cơ sở chẩn đoán chính xác, từ đó đưa ra phác đồ điều trị phù hợp, tránh lạm dụng thuốc và giảm thiểu biến chứng cho bệnh nhân. Về mặt dịch tễ học, phương pháp này là công cụ đắc lực cho việc giám sát, phát hiện sớm các đợt dịch và theo dõi sự biến đổi của các chủng virus. Trong tương lai, dựa trên nền tảng của nghiên cứu này, việc phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh dựa trên PCR (ví dụ như Real-time PCR) có thể được triển khai rộng rãi tại các bệnh viện và trung tâm y tế, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán từ vài ngày xuống còn vài giờ. Điều này sẽ góp phần quan trọng vào việc khoanh vùng và dập dịch một cách nhanh chóng, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

6.1. Ý nghĩa thực tiễn của phương pháp PCR và giải trình tự

Sự kết hợp giữa PCR và giải trình tự mang lại giá trị kép: chẩn đoán nhanh và định danh chính xác. Điều này cho phép các cơ sở y tế không chỉ xác nhận ca bệnh mà còn hiểu rõ về chủng virus gây bệnh. Thông tin này vô cùng quý giá cho việc theo dõi các chuỗi lây nhiễm, đánh giá mức độ nguy hiểm của dịch và xây dựng các mô hình dự báo. Hơn nữa, quy trình được tối ưu hóa trong luận văn có thể được áp dụng để nghiên cứu các tác nhân virus khác, đóng góp vào việc nâng cao năng lực chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm tại Việt Nam.

6.2. Triển vọng phát triển bộ kit chẩn đoán HAdV nhanh

Từ các cặp mồi và quy trình PCR đã được chuẩn hóa trong nghiên cứu, việc phát triển một bộ kit chẩn đoán thương mại là hoàn toàn khả thi. Một bộ kit như vậy sẽ đơn giản hóa quy trình xét nghiệm, giúp các phòng thí nghiệm không chuyên sâu cũng có thể thực hiện được. Triển vọng này hứa hẹn sẽ cải thiện đáng kể khả năng tiếp cận của người dân với các dịch vụ chẩn đoán viêm kết mạc hiện đại, góp phần vào mục tiêu chung là kiểm soát và tiến tới loại bỏ các dịch bệnh do Human Adenovirus gây ra tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Đau mắt đỏ là từ dùng để chỉ bệnh viêm kết mạc cấp. Bệnh đau mắt đỏ là một bệnh lý nhãn khoa rất phổ biến nhất trên thế giới. Đau mắt đỏ tiềm ẩn những nguy cơ to lớn đối với sức khỏe người bệnh, trong nhiều trường hợp, nếu không được điều trị đúng cách, đau mắt đỏ có thể gây ra các biến chứng nguy hiểm, để lại di chứng về sau, gây giảm thị lực hoặc thậm chí mù lòa. Đau mắt đỏ do nhiều nguyên nhân gây như nhiễm trùng, dị ứng, do hoá chất hoặc các tác nhân vật lý.

Một trong những tác nhân chính gây ra bệnh đau mắt đỏ ở người là Human Adenovirus (HAdV). Bệnh đau mắt đỏ gây ra bởi HAdV có tốc độ lây lan rất nhanh và phát triển thành dịch, đe dọa trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Ở Việt Nam, bệnh đau mắt đỏ do HAdV đã và đang hoành hành liên tục suốt hơn 10 năm qua với số lượng người bị nhiễm rất cao, có năm lên tới 80. Hàng năm, cứ vào khoảng tháng 7 đến tháng 10, khi thời tiết thuận lợi, dịch đau mắt đỏ do HAdV lại bùng phát.

Khi bệnh xuất hiện, số lượng bệnh nhân tăng rất nhanh, đặc biệt là ở những nơi có mật độ dân cư cao như trường học, bệnh viện, nhà máy và các thành phố lớn. Adenovirus (AdV) là nhóm virut thuộc họ Adenoviriae, gồm bốn giống khác nhau; trong đó có giống Mastedenovirus chuyên gây bệnh ở người, được gọi là Human Adenovirus, viết tắt là HAdV. Hiện nay có trên 50 chủng adenovirus khác nhau, do đó khả năng phát triển loại vaccine điều trị là rất thấp. Do chưa có vaccine phòng bệnh, việc phát hiện sớm tác nhân gây đau mắt đỏ để có phác đồ điều trị phù hợp là rất quan trọng.

Trước kia, phương pháp định danh các chủng HAdV thường được thực hiện bằng cách phân lập virut, sau đó xác định nhóm huyết thanh của virut bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên hoặc tách chiết ADN hệ gen và cắt bằng enzyme giới hạn để định loại. Những phương pháp này có nhược điểm là phức tạp, tốn thời gian và có độ chính xác còn hạn chế. Do vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu phƣơng pháp phát hiện virut HAdV gây bệnh đau mắt đỏ ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự” với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu phục vụ cho việc nhân gen hexon, penton, fiber của các chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ.CH - 60420121 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng 2.

Tối ưu được quy trình PCR nhân đặc hiệu các gen hexon, penton, fiber của các chủng HAdV gây bệnh` đau mắt đỏ. Sử dụng quy trình PCR nhân đặc hiệu các gen hexon, penton, fiber trên các mẫu bệnh phẩm thu được tại Bệnh viện Mắt Trung ương. Giải trình tự gen ba gen hexon, penton và fiber và xây dựng được cây chủng loại phát sinh nhằm xác định chính xác các chủng HAdV tại Việt Nam và chỉ ra được chủng HAdV gây bệnh đau mắt đỏ phổ biến ở Việt Nam. Nghiên cứu này được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Hà Nội trong đề tài mã số QG.CH - 60420121 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. BệNH ĐAU MắT Đỏ 1. Tình hình bệnh đau mắt đỏ trên thế giới Bệnh đau mắt đỏ gây ra bởi adenovirut ở người (human adenovirus - HAdV) là căn bệnh về mắt phổ biến nhất trên thế giới. Bệnh có tốc độ lây lan rất nhanh và phát triển thành dịch, đe dọa trực tiếp tới sức khỏe cộng đồng[1;24].

HAdV phân bố ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới và thường xuyên gây ra các trận dịch ở nhiều quốc gia như Mỹ, Đức, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan v. Chỉ tính riêng ở Nhật Bản, trong vòng 10 năm trở lại đây đã ghi nhận ít nhất 3 trận dịch đau mắt đỏ do HAdV. Ở Đài Loan cũng ghi nhận 2 trận dịch. Tình hình bệnh đau mắt đỏ tại Việt Nam Tại Việt Nam đau mắt đỏ là bệnh dịch định kỳ phát sinh khi giao mùa và lây lan nhanh trên diện rộng ở nhiều tỉnh thành.

Dịch đau mắt đỏ xuất hiện và diễn biến phức tạp, đặc biệt là những đợt bùng phát dịch trên diện rộng trong phạm vi cả nước vào năm 2013. Bệnh đau mắt đỏ đang có tốc độ lây lan khá nhanh trên cả miền Bắc và miền Nam khiến người dân hoang mang và xáo trộn, ngoài ra bệnh dịch gia tăng khiến dư luận dấy lên nghi ngờ về khả năng cung ứng thuốc phòng và trị bệnh đau mắt đỏ của Việt Nam, điều nay kéo theo nhiều cửa hàng thuốc tây có biểu hiện thông báo cháy hàng nhằm tăng giá chuộc lợi. Theo ghi nhận tại miền Bắc, các tỉnh lân cận và ngoại thành Hà Nội sự bùng phát dịch khiến cho học sinh phải nghỉ học, nhiều người phải nghỉ làm để tránh lây lan cộng đồng. Tại bệnh viện Mắt trung ương có khoảng 1200 - 1500 lượt người bệnh đến khám điều trị được bác sĩ chẩn đoán là đau mắt đỏ trong mùa dịch.Triệu chứng đau mắt đỏ do HAdV Bệnh đau mắt đỏ do HAdV có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, thường khởi phát ở các trẻ nhỏ.

Bệnh có thể xảy ra ở một mắt nhưng đa số bị bệnh ở cả hai mắt, thông thường một mắt phát bệnh trước vài ngày sau mới phát bệnh ở mắt thứ hai. Người bị bệnh thường cảm thầy khó chịu ở mắt, phải thường xuyên dụi mắt, cảm thấy ngứa, cộm, chói, đau nhức mắt, sợ ánh sáng, chảy nước mắt và đôi khi QH.CH - 60420121 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng sáng ngủ dậy tiết tố kết mạc (dử mắt) làm cho hai mi dính chặt lại nên rất khó mở mắt. Đỏ mắt, kết mạc phù nề do cương tụ mạch máu lớp nông của kết mạc, xuất huyết dưới kết mạc, mi mắt có thể sưng nề khiến mắt khó quan sát. Một số trường hợp tiến triển nặng, các sợi Fibrine trong dịch tiết của kết mạc sẽ kết hợp với tế bào viêm và vi khuẩn tạo thành một màng giả bám chặt ở mặt trong kết mạc, gây sưng húp mi mắt, loét trợt biểu mô giác mạc rất nguy hiểm.

Có thể kèm theo xuất huyết kết mạc và chảy nước mắt lẫn máu hồng gây tổn thương giác mạc, làm cho giác mạc bị mờ đục do thẩm lậu viêm và apxe, khi đó thị lực của bệnh nhân giảm rất nhiều. Toàn thân người bênh có thể có sốt nhẹ, có sưng hạch góc hàm hoặc hạch sau tai, họng đỏ, amidan sưng to. Một số trường hợp trẻ đau mắt đỏ do virut HAdV có thể kèm theo các triệu chứng viêm đường hô hấp như ho, sốt nhẹ, sổ mũi, khò khè sẽ bị nổi hạch trước tai sưng và đau. Con đƣờng lây lan của bệnh đau mắt đỏ do HAdVs Bệnh có thể lây từ người này sang người khác do bệnh có nguồn lây là virut gây bệnh, virut có rất nhiều trong nước mắt và dử mắt người bệnh và có thể lây cho người khác qua các đường khác nhau bao gồm: Lây qua các vật dụng sinh hoạt: do dùng chung khăn mặt và chậu rửa mặt dụi mắt và cầm nắm vào các đồ vật dùng chung như khăn mặt, chậu rửa, ly chén, tay nắm cửa, đồ chơi, chăn gối hay gặp ở những người trong cùng gia đình, các nhà trẻ, mẫu giáo, Bệnh không lây qua việc nhìn vào mắt người bệnh, vì vậy việc đeo kính chỉ giúp người bệnh bớt chói mắt, bụi bặm và khó chịu chứ không ngăn chặn QH.CH - 60420121 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng được sự lây lan như dân gian thường quan niệm trước đây.

Đặc biệt có một hình thức lây lan rất mạnh đó là qua nước hồ bơi. Khi người bệnh bị đau mắt đỏ đi tắm hồ, virut gây bệnh sẽ tồn lưu trong nước một thời gian và lây truyền cho những trẻ khác. Lây qua đường nước bọt: nước mắt được tiết ra sau khi làm nhiệm vụ dinh dưỡng và làm sạch cho mắt sẽ thoát qua đường dẫn nước mắt (lệ đạo) để xuống mũi, họng. Ở người bị đau mắt đỏ do HAdV trong nước mắt này có chứa rất nhiều virut và khi bệnh nhân nói chuyện quá gần, ho hắt hơi, thơm, hôn thì virut HAdV sẽ theo nước bọt bắn ra ngoài và lây bệnh cho người khác Vì vậy bệnh có thể lây lan nhanh thành dịch ở những nơi tập trung đông dân cư như trường học, doanh trại, ký túc xá, bến tàu xe, bệnh viện.Ở một số nơi do vệ sinh kém (như ở một số vùng nông thôn) có thể lây qua vật trung gian là ruồi, muỗi.

TỔNG QUAN Về HAdV VÀ HAdV GÂY BệNH ĐAU MắT Đỏ 1. Human Adenovirus (HAdV) Adenovirut (AdV) là nhóm virut thuộc họ Adenoviriae, gồm bốn giống khác nhau, trong đó có giống Mastedenovirut chuyên gây bệnh ở người. Các adenovirut gây bệnh ở người này có tên gọi là human adenovirut và được viết tắt là HAdV. Các HAdV lây nhiễm hàng tỷ người trên thế giới và gây ra rất nhiều bệnh khác nhau như bệnh đường hô hấp, tiêu hóa, tiết niệu và bệnh về mắt[4;16].CH - 60420121 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng Hình 1.Hình ảnh các hạt Adenovirus trên kính hiển vi điện tử [36] HAdV là virut có kích thước khoảng 80-100 nm, có vỏ capsid 20 mặt được cấu thành bởi protein cấu trúc.

HAdV không có lớp màng lipid kép bao bọc bên ngoài. Hệ gen của HAdV là phân tử ADN sợi kép mạch thẳng, có kích thước khoảng 35 kbp[33;36]. Vỏ capsid của HAdV có các loại protein chính là hexon, penton và fiber. Hexon là protein cấu tạo nên bề mặt bên, các penton nằm ở đỉnh và các fiber là các sợi nhỏ gắn vào các đỉnh penton.

Cấu trúc phân tử của các protein tham gia cấu thành nên HAdV được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Tuy nhiên, cho đến nay cấu trúc chi tiết ở mức độ phân tử của nhiều protein cấu thành nên HAdV vẫn chưa được làm sáng tỏ.CH - 60420121 6 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Quang Hưng Fiber Hexon Penton base Hình 1. Mô hình cấu trúc vỏ capsid của HAdV[38] Hệ gen của HAdV là một phân tử ADN sợi kép có cấu trúc dạng thẳng, chứa các gen không phân mảnh. Số lượng các gen và thành phần các gen trong hệ gen của HAdV thay đổi tùy theo chủng HAdV.