Luận văn thạc sĩ về ảnh hưởng của tế bào và hormone lên sự phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

Nghiên cứu ảnh hưởng của tế bào và hormone đến sự phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm, cung cấp kiến thức mới cho ngành chăn nuôi.

• Tác giả: Hứa Nguyệt Mai
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Xuân Nguyên
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung tế bào và hormone lên sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• Mục tiêu của đề tài
• Nội dung nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sự hình thành và phát triển phôi in vivo
• 1.1.1. Sự thụ tinh
• 1.1.2. Quá trình thụ tinh
• 1.1.3. Những yếu tố đảm bảo xảy ra sự thụ tinh
• 1.1.4. Sự phát triển của phôi in vivo
• 1.1.5. Sự làm tổ của phôi
• 1.2. Các yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của phôi in vitro
• 1.2.1. Thụ tinh trong ống nghiệm
• 1.2.2. Loại nang trứng
• 1.2.3. Quá trình nuôi thành thục trứng và các hormone bổ sung
• 1.2.4. Hệ thống nuôi phôi
• 1.3. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3.1. Dụng cụ, thiết bị
• 2.3.2. Hóa chất, môi trường
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp thu, bảo quản và vận chuyển buồng trứng
• 2.4.2. Phương pháp phân loại phẩm chất trứng
• 2.4.3. Phương pháp thu tế bào nguyên bào sợi phôi chuột (Mouse Embryonic Fibroblast- MEF)
• 2.4.4. Phương pháp thu cụm tế bào màng trong ống dẫn trứng
• 2.4.5. Phương pháp nuôi phôi và đánh giá sự phát triển của phôi
• 2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi từ bào thai chuột
• 3.2. Nghiên cứu phân lập, nhân nuôi tế bào màng trong ống dẫn trứng
• 3.2.1. Kết quả thu tế bào màng trong ống dẫn trứng
• 3.2.2. So sánh ảnh hưởng thời gian quay của cụm tế bào lên chất lượng của cụm tế bào thu được và cụm tế bào sau giải đông
• 3.3. Kết quả bổ sung hormone lên tỷ lệ trứng thành thục
• 3.4. Kết quả nuôi phôi từ các hệ thống môi trường
• 3.4.1. So sánh kết quả tạo phôi từ các hệ thống
• 3.4.1.1. So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 1, hệ thống 2 và hệ thống 3
• 3.4.1.2. So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 2 và hệ thống 4
• 3.4.1.3. So sánh tỷ lệ tạo phôi từ hệ thống 1, 2, 3 và hệ thống 4
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu ảnh hưởng tế bào và hormone

Nghiên cứu này tập trung vào việc tìm hiểu ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào và hormone lên sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm. Công nghệ sinh học đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực chăn nuôi, đặc biệt là trong việc cải thiện chất lượng phôi. Việc hiểu rõ các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển phôi sẽ giúp nâng cao hiệu quả của kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm.

1.1. Tầm quan trọng của phôi lợn trong chăn nuôi

Phôi lợn đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất giống và nâng cao năng suất chăn nuôi. Việc nghiên cứu phát triển phôi lợn giúp cải thiện chất lượng giống và bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển phôi

Sự phát triển phôi lợn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như môi trường nuôi cấy, hormone sinh trưởng và tế bào bổ sung. Những yếu tố này cần được nghiên cứu kỹ lưỡng để tối ưu hóa quy trình thụ tinh ống nghiệm.

II. Vấn đề thách thức trong nghiên cứu phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về thụ tinh ống nghiệm, nhưng tỷ lệ thành công vẫn còn thấp. Các vấn đề như chất lượng trứng, sự tương tác giữa tế bào và hormone cần được giải quyết. Việc tìm ra giải pháp cho những thách thức này là rất cần thiết để nâng cao hiệu quả thụ tinh ống nghiệm.

2.1. Tỷ lệ thành công thấp trong thụ tinh ống nghiệm

Tỷ lệ thành công của thụ tinh ống nghiệm ở lợn vẫn còn thấp so với mong đợi. Nghiên cứu cần tập trung vào việc cải thiện chất lượng trứng và phôi để nâng cao tỷ lệ thành công.

2.2. Thiếu hiểu biết về ảnh hưởng của hormone

Mặc dù hormone sinh trưởng có vai trò quan trọng, nhưng vẫn còn nhiều điều chưa được hiểu rõ về cách thức hoạt động của chúng trong sự phát triển phôi. Cần có thêm nghiên cứu để làm sáng tỏ vấn đề này.

III. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng tế bào và hormone

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại để đánh giá ảnh hưởng của tế bào và hormone lên sự phát triển phôi. Các thí nghiệm được thiết kế để kiểm tra hiệu quả của việc bổ sung tế bào màng trong ống dẫn trứng và nguyên bào sợi phôi chuột.

3.1. Thiết kế thí nghiệm và quy trình thực hiện

Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường kiểm soát, với các nhóm thí nghiệm khác nhau để so sánh hiệu quả của các phương pháp bổ sung tế bào và hormone.

3.2. Phân tích kết quả và đánh giá hiệu quả

Kết quả thí nghiệm sẽ được phân tích để đánh giá sự phát triển của phôi và tỷ lệ thành công của thụ tinh ống nghiệm. Các chỉ số quan trọng sẽ được ghi nhận để đưa ra kết luận.

IV. Ứng dụng thực tiễn từ nghiên cứu phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong thực tiễn để cải thiện quy trình thụ tinh ống nghiệm. Việc áp dụng các phương pháp mới sẽ giúp nâng cao năng suất và chất lượng giống lợn trong chăn nuôi.

4.1. Tăng cường năng suất chăn nuôi

Việc áp dụng các kỹ thuật mới trong thụ tinh ống nghiệm sẽ giúp tăng cường năng suất chăn nuôi, đáp ứng nhu cầu thị trường ngày càng cao.

4.2. Bảo tồn nguồn gen quý hiếm

Nghiên cứu cũng góp phần bảo tồn các giống lợn quý hiếm, giúp duy trì đa dạng sinh học trong ngành chăn nuôi.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về ảnh hưởng của tế bào và hormone lên sự phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm mở ra nhiều triển vọng mới. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình và nâng cao hiệu quả thụ tinh ống nghiệm trong tương lai.

5.1. Tương lai của công nghệ thụ tinh ống nghiệm

Công nghệ thụ tinh ống nghiệm sẽ tiếp tục phát triển, với nhiều cải tiến trong quy trình và kỹ thuật, hứa hẹn mang lại nhiều thành công hơn trong tương lai.

5.2. Nghiên cứu và phát triển bền vững

Cần có các nghiên cứu tiếp theo để phát triển bền vững ngành chăn nuôi, đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo vệ môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Công nghệ sinh học sinh sản hiện đại, đặc biệt là kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization - IVF), đang đóng vai trò then chốt trong việc nhân bản và bảo tồn nguồn gen vật nuôi cao sản. Trong chu kỳ sinh sản tự nhiên, một lợn nái chỉ có thể sản sinh trung bình từ 4 đến 5 lợn con cái, trong khi công nghệ IVF kết hợp khai thác nguồn noãn từ buồng trứng có thể tạo ra từ 50 đến 80 cá thể cái trong suốt vòng đời sinh học. Mặc dù buồng trứng lợn chứa tiềm năng di truyền khổng lồ với hơn 200.000 nang trứng sơ cấp, quy trình sản xuất phôi lợn in vitro tại Việt Nam trong giai đoạn trước năm 2012 vẫn gặp nhiều rào cản lớn với tỷ lệ trứng thành thục thấp và tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang chỉ đạt dưới 5% trong môi trường cơ bản.

Nghiên cứu được thực hiện nhằm giải quyết nút thắt về môi trường nuôi cấy nhân tạo thông qua việc đánh giá ảnh hưởng của phác đồ bổ sung hormone tăng trưởng (FSH, LH, Estrogen) và hệ thống đồng nuôi cấy với các tế bào đệm sinh dưỡng. Mục tiêu trọng tâm của đề tài là chuẩn hóa quy trình phân lập, nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi phôi chuột (MEF) và cụm tế bào màng trong ống dẫn trứng lợn, từ đó nâng cao tỷ lệ tạo phôi nang in vitro phục vụ công tác nhân giống và bảo tồn đa dạng sinh học.

Đề tài được triển khai thực nghiệm tại Phòng Công nghệ phôi thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng nguồn buồng trứng và vòi trứng thu nhận từ giống lợn Yorkshire khỏe mạnh tại các cơ sở giết mổ đạt chuẩn ở Hà Nội. Kết quả nghiên cứu tạo nền tảng khoa học vững chắc giúp tối ưu hóa hiệu suất tạo phôi lợn thụ tinh ống nghiệm, nâng tỷ lệ noãn chín đạt 79,30% và tỷ lệ hình thành phôi nang đạt 13,19%, mở ra tiềm năng ứng dụng thực tiễn trong công nghệ chuyển cấy phôi và y sinh học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết phát triển phôi sinh học phát triển ở động vật có vú, tập trung vào cơ chế thành thục noãn bào (IVM), quá trình thụ tinh (IVF) và nuôi cấy phôi sớm (IVC). Quá trình giảm phân của noãn bào lợn phụ thuộc chặt chẽ vào tương tác hiệp đồng giữa hormone kích thích nang trứng (FSH), hormone tạo hoàng thể (LH) và Estrogen nhằm kích hoạt sự mở rộng của phức hợp tế bào gò noãn (cumulus oocyte complexes - COCs) và thúc đẩy noãn chuyển từ pha dừng Metaphase I sang Metaphase II (MII) cùng với sự phóng xuất thể cực thứ nhất.

Bên cạnh đó, mô hình đồng nuôi cấy (co-culture) với các lớp tế bào đệm soma được ứng dụng dựa trên thuyết tương tác cận tiết (paracrine signaling). Các tế bào biểu mô màng trong vòi trứng tiết ra các glycoprotein đặc hiệu như protein tiết ống dẫn trứng lợn (porcine oviductal secretory protein - pOSP), đóng vai trò bảo vệ màng trong suốt (zona pellucida), điều hòa phản ứng cực đầu của tinh trùng và hạn chế hiện tượng đa tinh trùng (polyspermy). Đồng thời, nguyên bào sợi phôi chuột (MEF) đóng vai trò như lớp giá thể sinh dưỡng, liên tục cung cấp các yếu tố tăng trưởng phôi, khử các gốc oxy hóa tự do và ổn định áp suất thẩm thấu nội bào trong suốt 6 đến 7 ngày phát triển đầu đời của hợp tử.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ các buồng trứng lợn Yorkshire vận chuyển trong dung dịch đệm muối phosphat (PBS) có bổ sung kháng sinh ở nhiệt độ ổn định 30-35°C trong vòng 1-2 giờ sau khi giết mổ. Noãn bào được thu hút từ các nang trứng có đường kính 2-5 mm bằng kim tiêm chuyên dụng, sau đó phân loại nghiêm ngặt thành 3 nhóm phẩm chất (loại A có 4-5 lớp tế bào cumulus đặc khít; loại B có 2-3 lớp; loại C trần hoặc thoái hóa). Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 146 noãn bào cho mỗi đợt khảo sát thành thục và hàng trăm hợp tử phân bổ đồng đều qua 5 lần lặp lại độc lập cho từng hệ thống nuôi cấy.

Phương pháp nhân nuôi tế bào MEF được tiến hành trên bào thai chuột nhắt trắng 12-18 ngày tuổi, xử lý phân rã mô bằng trypsin-EDTA và bất hoạt phân bào bằng Mitomycin C (nồng độ 10 µg/ml) trước khi gieo nuôi ở mật độ 7 x 10^6 tế bào/giếng. Tế bào màng vòi trứng lợn được bóc tách vi phẫu và tuyển chọn dựa trên hoạt lực tự quay của các cụm nhung mao (25-30 cụm/giếng). Đánh giá giai đoạn nhân tế bào được thực hiện bằng kỹ thuật nhuộm cố định Orcein 1% trên kính hiển vi đảo ngược quang học Nikon TE300 ở độ phóng đại 200-400 lần. Toàn bộ số liệu thực nghiệm được phân tích thống kê theo phương sai ANOVA và kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa bằng phương pháp LSD (Least Significant Difference) ở mức xác suất tin cậy 95% (p < 0,05).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thực nghiệm cho thấy việc bổ sung hormone đa pha mang lại hiệu quả vượt trội trong nuôi thành thục noãn bào. Ở nhóm đối chứng nuôi trong môi trường MAT I có hormone nhưng chuyển sang MAT II không có hormone, tỷ lệ trứng thành thục đạt 47,72 ± 0,36%. Trong khi đó, phác đồ bổ sung liên tục kết hợp 10 µg/ml FSH, 10 µg/ml LH, 0,1 µg/ml Estrogen ở giai đoạn MAT I (22-24 giờ) và duy trì 1/5 liều lượng hormone trong giai đoạn MAT II (24-44 giờ) đã nâng tỷ lệ trứng đạt giai đoạn MII lên 79,30 ± 0,14%, tạo ra bước tăng trưởng ấn tượng tới 31,58% so với phương pháp đơn pha (p < 0,05).

Quá trình phân lập tế bào soma ghi nhận nguồn nguyên bào sợi từ thai chuột 12-14 ngày tuổi cho năng suất cao nhất, đạt trung bình 17,67 ± 1,2 triệu tế bào sau 3,5 ± 0,12 ngày nuôi cấy. Tốc độ cấy chuyển của tế bào tươi và tế bào bảo quản lạnh sau giải đông hoàn toàn tương đương nhau (3,4 ngày so với 3,6 ngày). Đối với tế bào vòi trứng lợn, nhóm mẫu lấy từ vòi trứng to, màu sáng và ít mạch máu cho tỷ lệ cụm tế bào hoạt động tốt đạt 65,3 ± 5,1% và tỷ lệ thoái hóa thấp nhất chỉ 8,87 ± 0,95%, duy trì khả năng quay trung bình 6,6 ± 0,54 ngày.

Khảo sát 4 hệ thống nuôi phôi sau thụ tinh (IVC) chứng minh sự can thiệp của tế bào đệm đã cải thiện triệt để chất lượng hợp tử. Tại hệ thống 1 (môi trường cơ bản NCSU-37), tỷ lệ phôi phân chia 2-4 tế bào đạt 51,2 ± 0,82%, phôi dâu đạt 24,42 ± 0,65% nhưng tỷ lệ phôi nang chỉ đạt mức rất khiêm tốn là 4,54 ± 0,44%. Khi bổ sung nguyên bào sợi phôi chuột ở hệ thống 2, tỷ lệ phân chia tăng lên 70,82 ± 0,43%, tỷ lệ phôi dâu đạt 43,32 ± 0,40% và tỷ lệ phôi nang đạt 13,19 ± 0,27% (tăng gần gấp 3 lần so với hệ thống 1). Tương tự, hệ thống 3 bổ sung tế bào màng vòi trứng cho tỷ lệ phân chia đạt 72,73 ± 0,24% và phôi nang đạt 12,01 ± 0,23%.

Thảo luận kết quả

Sự gia tăng vượt bậc về tỷ lệ noãn chín ở phác đồ hai pha được giải thích bởi cơ chế tác động liên hoàn của gonadotropin. FSH thúc đẩy tế bào hạt tích lũy cAMP, trong khi sự duy trì một lượng nhỏ LH và Estrogen ở pha thứ hai giúp tế bào cumulus duy trì sự liên lạc qua các cầu nối khe, cung cấp năng lượng pyruvate và kích hoạt yếu tố thúc đẩy thành thục (Maturation Promoting Factor - MPF) giải phóng cực cầu thứ nhất.

Sự bứt phá của tỷ lệ phôi nang trong môi trường có tế bào MEF và tế bào màng vòi trứng khẳng định vai trò sống còn của các yếu tố dinh dưỡng sinh học. Môi trường cơ bản thường tích tụ các gốc tự do (ROS) và thiếu hụt các chất chuyển hóa trung gian khiến phôi lợn dễ bị ức chế phát triển tại giai đoạn 4 tế bào. Khi có mặt tế bào MEF hoặc tế bào vòi trứng, các tế bào này liên tục hấp thụ ion kim loại độc hại, phân giải lactate dư thừa và tiết ra các yếu tố tăng trưởng nội sinh mô phỏng chuẩn xác môi trường sinh lý tử cung.

Khi trình bày qua các biểu đồ hình cột so sánh, sự suy giảm tuyến tính từ giai đoạn phân chia đến phôi nang ở môi trường cơ bản có độ dốc rất lớn, trong khi các cột biểu diễn tỷ lệ sống sót ở hệ thống có tế bào đệm duy trì độ ổn định cao hơn hẳn. Mặc dù tỷ lệ phôi nang 13,19% thấp hơn một số công bố quốc tế trên lợn giống chuyên dụng (khoảng 16-20%), điều này phản ánh tính đặc thù của nguồn mẫu thu thập từ lợn thương phẩm giết thịt ở độ tuổi 4-5 tháng tuổi tại địa phương, vốn chưa đạt độ hoàn thiện tối ưu về chức năng sinh lý của hệ cơ quan sinh sản.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa quy trình nuôi thành thục noãn bào hai pha có hormone: Các phòng thí nghiệm và cơ sở công nghệ sinh học cần áp dụng đồng bộ quy trình bổ sung phối hợp FSH, LH (10 µg/ml) và Estrogen (0,1 µg/ml) trong 22-24 giờ đầu, sau đó duy trì 1/5 nồng độ trong 20 giờ tiếp theo nhằm đảm bảo tỷ lệ noãn đạt giai đoạn MII ổn định trên 78% trong thời gian 3-6 tháng triển khai.
2. Xây dựng ngân hàng tế bào nguyên bào sợi phôi chuột (MEF) đông lạnh: Các viện nghiên cứu nên tổ chức thu nhận thai chuột ở giai đoạn vàng 12-14 ngày tuổi để bảo quản trữ lạnh ở nhiệt độ âm 196°C trong nitơ lỏng, thiết lập mật độ tế bào gieo nuôi chuẩn 7 x 10^6 tế bào/giếng nhằm chủ động 100% nguồn tế bào đệm chất lượng cao cho các đợt sản xuất phôi liên tục.
3. Tuyển chọn nghiêm ngặt nguồn mẫu vòi trứng theo tiêu chuẩn hình thái học: Kỹ thuật viên thu mẫu tại các lò mổ cần chọn lọc những vòi trứng to, sáng màu, mạch máu tối thiểu để đạt tỷ lệ cụm tế bào biểu mô hoạt động tốt trên 65%, giúp duy trì thời gian chuyển động vi nhung mao trên 6 ngày phục vụ đồng nuôi cấy.
4. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy chuyển tiếp kết hợp môi trường NCSU-37 cải tiến: Khuyến nghị các trung tâm giống vật nuôi ứng dụng hệ thống đồng nuôi cấy với tế bào MEF kết hợp điều chỉnh nồng độ glucose và bổ sung chất chống oxy hóa để nâng tỷ lệ phôi nang in vitro lên ngưỡng mục tiêu 15-20% trong lộ trình 12 tháng tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Chăn nuôi - Thú y: Nắm vững tài liệu tham khảo chuẩn mực về các kỹ thuật vi thao tác tế bào, phương pháp phân lập noãn bào, đánh giá chất lượng tế bào trứng theo 3 cấp độ (loại A, B, C) và kỹ thuật nhuộm nhân tế bào bằng thuốc nhuộm Orcein 1%.
• Chuyên viên nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm công nghệ phôi: Ứng dụng ngay các thông số kỹ thuật chi tiết về nồng độ hormone, thời gian xử lý enzyme trypsin-EDTA và phác đồ bất hoạt tế bào soma bằng Mitomycin C trong quy trình sản xuất phôi động vật in vitro.
• Kỹ sư công nghệ sinh học tại các trung tâm giống gia súc chất lượng cao: Khai thác quy trình tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để sản xuất hàng loạt phôi lợn thuần chủng, phục vụ chuyển đổi phương thức nhân giống truyền thống sang công nghệ cấy truyền phôi quy mô lớn.
• Các nhà hoạch định chính sách bảo tồn nguồn gen vật nuôi: Sử dụng cơ sở dữ liệu thực nghiệm để xây dựng các đề án lưu trữ tế bào mầm và ngân hàng phôi đông lạnh, bảo tồn bền vững các giống lợn bản địa quý hiếm của Việt Nam trước nguy cơ suy thoái di truyền.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần duy trì bổ sung hormone ở liều thấp trong giai đoạn MAT II? Bổ sung 1/5 liều lượng hormone ở giai đoạn MAT II giúp duy trì kích thích thụ thể bề mặt màng tế bào hạt, ngăn chặn hiện tượng thoái hóa sớm của tế bào cumulus. Cơ chế này đảm bảo tín hiệu nội bào được liên tục, giúp tỷ lệ noãn đạt giai đoạn Metaphase II tăng từ 47,72% lên 79,30%.

Tế bào MEF giúp tăng tỷ lệ phát triển phôi nang bằng cách nào? Nguyên bào sợi phôi chuột hoạt động như một hệ thống lọc sinh học, loại bỏ các gốc tự do gây độc và tiết ra các yếu tố tăng trưởng polypeptide. Nhờ đó, phôi vượt qua pha ức chế phân chia 4 tế bào, nâng tỷ lệ tạo phôi nang từ 4,54% lên 13,19%.

Tiêu chuẩn chọn vòi trứng để thu tế bào đệm đạt hoạt lực cao là gì? Vòi trứng cần được thu từ lợn cái Yorkshire khỏe mạnh, chọn đoạn ống to đều, mô liên kết mỏng, màu sắc sáng và ít mạch máu tụ huyết. Mẫu đạt chuẩn này cung cấp tỷ lệ cụm tế bào quay khỏe lên tới 65,3% với thời gian sống kéo dài trên 6 ngày.

Tế bào đông lạnh sau khi giải đông có làm giảm hiệu quả nuôi phôi không? Không. Số liệu theo dõi cho thấy tế bào MEF giải đông đạt chu kỳ nhân đôi 3,4-3,6 ngày và tế bào vòi trứng giải đông duy trì thời gian quay 6,4 ngày, hoàn toàn tương đương với tế bào tươi (6,6 ngày), đảm bảo hiệu quả đồng nuôi cấy tối ưu.

Làm thế nào để hạn chế hiện tượng đa tinh trùng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn? Sử dụng tế bào màng vòi trứng giúp cung cấp protein tiết đặc hiệu pOSP lên màng trong suốt của trứng. Yếu tố này củng cố phản ứng vỏ noãn, hỗ trợ chọn lọc tinh trùng đơn lẻ xâm nhập và giảm đáng kể tỷ lệ thụ tinh bất thường.

Kết luận

• Luận văn đã xác lập thành công quy trình nuôi thành thục noãn lợn hai pha với sự bổ sung phối hợp FSH, LH và Estrogen, giúp nâng tỷ lệ noãn đạt giai đoạn MII lên 79,30 ± 0,14%.
• Xây dựng hoàn chỉnh kỹ thuật phân lập, nhân nuôi và trữ lạnh nguyên bào sợi phôi chuột (MEF) đạt năng suất 17,67 triệu tế bào/chuột và cụm tế bào vòi trứng đạt 65,3% hoạt lực tốt.
• Chứng minh tính ưu việt của hệ thống đồng nuôi cấy với tế bào đệm soma, tạo ra bước đột phá khi nâng tỷ lệ tạo phôi nang từ 4,54% ở môi trường cơ bản lên 13,19% khi có mặt MEF.
• Cung cấp luận cứ khoa học giải thích nguyên nhân hạn chế của nguồn noãn từ lợn giết thịt thương phẩm và đề xuất giải pháp kỹ thuật khắc phục phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
• Trong lộ trình 12-24 tháng tiếp theo, các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp chăn nuôi cần đẩy mạnh thử nghiệm cấy truyền nguồn phôi in vitro này vào lợn nái nhận để hoàn thiện chuỗi công nghệ sản xuất con giống cao sản; hãy kết nối và ứng dụng ngay các phát hiện của luận văn để nâng cao năng suất chăn nuôi và bảo tồn nguồn gen quý.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ngày nay, công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học sinh sản nói riêng đã rất phát triển và đạt nhiều thành tựu quan trọng, đem lại nhiều ý nghĩa và lợi ích thiết thực trong cuộc sống. Một trong những thành tựu nổi bật nhất của công nghệ sinh học là sự kiện nhân bản vô tính thành công (1997) với sự ra đời của cừu Dolly. Còn trong sinh sản hữu tính thành tựu quan trọng nhất là tạo phôi trong ống nghiệm, phôi là nguồn vật liệu quan trọng trong chuyển cấy phôi tạo nguồn động vật đồng loạt, phục vụ cho các thử nghiệm trong y học, hoặc nhằm mục đích nâng cao năng suất vật nuôi trong chăn nuôi. Nước ta là nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển, song cũng là một điểm nóng về bảo vệ đa dạng sinh học nói chung và nguồn gen các giống lợn nói riêng.

Trong vòng đời sinh sản của một con vật, chu kỳ sống của chúng có loài chỉ sinh ra 4-5 con cái thông qua sinh sản bình thường, trong khi thông qua thụ tinh ống nghiệm có thể tạo ra 50-80 con cái trong chu kỳ sống của chúng. Vì vậy thụ tinh ống nghiệm giữ vai trò quan trọng trong việc tạo ra nhiều động vật với số lượng lớn và đặc tính gen cũng sẽ được cải thiện đáng kể. Kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm trên động vật nói chung và kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm trên lợn nói riêng đã có nhiều nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển phôi, nhưng vấn đề quan tâm nhiều nhất đó là việc nghiên cứu bổ sung, thay thế các chất khác nhau vào các môi trường cơ bản ban đầu. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng có lợi của đồng nuôi cấy đến sự phát triển của phôi như cải thiện chất lượng phôi, tăng tỷ lệ phát triển của phôi vào giai đoạn phôi nang [32], [64].

Bổ sung môi trường nuôi cấy với tế bào đệm như tế bào màng trong ống dẫn trứng là yếu tố tăng cường sự phát triển của phôi lợn trong ống nghiệm [14], [48]. Các nguyên bào sợi phôi chuột đã được sử dụng trong đồng nuôi cấy, nguyên bào sợi phôi chuột tiết ra các yếu tố nhằm nâng cao sự phát triển của phôi, cho kết quả tốt đối với sự phát triển của phôi bò và cừu [36], [47]. Cho đến nay các vấn đề về việc nghiên cứu môi trường tối ưu để có chất lượng phôi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn 2 phát triển tốt đã được cải thiện phần nào. Ở Việt Nam, việc nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm các trứng lợn đã được thực hiện từ những năm đầu của thế kỷ 21 [3], [6].

Một số nghiên cứu đã được tiến hành trên đối tượng trứng và phôi lợn in vitro [4] [7], [9]. Tuy nhiên tỷ lệ thành thục của trứng và tỷ lệ tạo phôi vẫn còn thấp so với tỷ lệ chung trên thế giới. Nguyên nhân của hiện tượng này vẫn chưa được làm sáng tỏ. Việc nghiên cứu cải thiện hệ thống nuôi phôi in vitro bằng cách bổ sung các loại tế bào đệm như nguyên bào sợi thai chuột hay tế bào màng trong ống dẫn trứng nhằm nâng cao chất lượng phát triển cho các phôi động vật nói chung và phôi lợn nói riêng là cần thiết cho việc ứng dụng công nghệ này trong nghiên cứu và sản xuất.

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung tế bào và hormone lên sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm’’. Mục tiêu của đề tài - Đánh giá được ảnh hưởng của việc bổ sung hormone, bổ sung tế bào màng trong ống dẫn trứng và nguyên bào sợi thai chuột vào môi trường nuôi phôi lên kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn. - Thu nhận được các kết quả thí nghiệm cần thiết về sản xuất và bảo quản tế bào, chế độ bổ sung tế bào nhằm góp phần nâng cao hiệu quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Nội dung nghiên cứu - Thu trứng, nuôi thành thục trứng in vitro trong môi trường cơ bản và môi trường có bổ sung hormone.

- Thu và nhân nuôi tế bào màng trong ống dẫn trứng từ ống dẫn trứng lợn. - Thu và nhân nuôi tế bào nguyên bào sợi từ bào thai chuột. - Nuôi phôi trong môi trường cơ bản, môi trường có bổ sung tế bào màng vòi trứng và nguyên bào sợi phôi chuột. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN PHÔI IN VIVO Phôi lợn bắt đầu phát triển sau khi thụ thai - thời điểm của tinh trùng lợn đực thâm nhập vào các bức tường tế bào trứng của lợn cái. Trong thời gian từ 14 đến 16 giờ, các tế bào thụ tinh đã bắt đầu chia tách vào trong tế bào nhỏ hơn (blastomeres) bởi nguyên phân. Vào ngày thứ hai hoặc thứ ba của thai kỳ, túi phôi nguyên thủy này đã thông qua từ màng ống dẫn trứng vào một trong hai vòi trứng của lợn nái, nơi mà nó sẽ tiếp tục phát triển cho đến khi nó bắt đầu để gắn vào niêm mạc tử cung vào ngày 11 hoặc 12 [1]. Sự thụ tinh Sự tạo ra cá thể mới bắt đầu bằng sự thụ tinh.

Sự thụ tinh là sự kết hợp giữa noãn (giao tử cái) và tinh trùng (giao tử đực) để tạo hợp tử. Hợp tử là cá thể mới phát sinh và phát triển ở giai đoạn sớm nhất. Ở động vật, bình thường sự thụ tinh xảy ra ở 1/3 phần đầu vòi trứng [1]. Noãn trước khi thụ tinh: Khi được phóng thích ra khỏi buồng trứng, noãn được bọc từ trong ra ngoài bởi màng trong suốt và các lớp tế bào nang (tế bào vòng tia) của gò noãn.

Lúc này, noãn đang ở kỳ đầu lần phân chia thứ 2 của quá trình giảm phân, tức là noãn bào 2. Nếu không gặp tinh trùng, sự thụ tinh không xảy ra, noãn sẽ bị thoái hóa và bị thực bào bởi các đại thực bào. Noãn bào 2 không tự chuyển động được, sự di chuyển của nó trong vòi trứng nhờ 3 yếu tố: sự co bóp của lớp cơ vòi trứng, sự nhu động của các lớp vi lông của lớp tế bào niêm mạc vòi trứng và sự vận chuyển cuốn theo dòng dịch trong vòi trứng [5]. Tinh trùng trước khi thụ tinh: Sau khi được hình thành trong ống sinh tinh, lúc này tinh trùng có hình dạng đặc trưng nhưng chưa có khả năng di động.

Từ ống sinh tinh, tinh trùng tới mào tinh. Sự trưởng thành của tinh trùng chủ yếu xảy ra trong mào tinh: sự loại bớt bào tương và các bào quan không cần thiết để giúp tinh trùng chuyển động nhanh, ít tốn năng lượng. Ðầu tinh trùng cũng thay đổi, đặc biệt là hình dạng và kích thước cực đầu. Tinh trùng tăng dần khả năng di động khi di chuyển từ phần đầu đến phần đuôi mào tinh.

Nhờ có đuôi, tinh trùng có thể tự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn 4 chuyển động trong đường sinh dục cùng với sự trợ giúp do sự co thắt của tầng cơ đường sinh dục. *Sự tương tác trước khi kết hợp trứng và tinh trùng: Nhiều cơ chế đã được phát hiện cho thấy có sự đảm bảo để các tế bào sinh dục gặp nhau đúng lúc và đúng vị trí trong điều kiện thuận lợi khi thụ tinh ở động vật. Như vậy, có một sự sắp xếp hoàn hảo trong sự tương tác giữa cá thể đực và cá thể cái và giữa trứng và tinh trùng. Ở nhiều loài sinh vật, trứng tiết ra một chất hóa học nhằm thu hút tinh trùng về phía trứng.

Ở động vật có vú và các loài động vật khác, tinh trùng phải xảy ra một loạt các biến đổi sinh hóa trước khi thụ tinh với trứng. Tinh trùng muốn xuyên thủng màng sáng của trứng đòi hỏi phải trải qua quá trình biến đổi gọi là tiềm năng hóa (capacitation) [2], [5]. Quá trình thụ tinh Với cấu trúc của noãn sau rụng trứng, muốn lọt vào bào tương của noãn để kết hợp với noãn tạo ra hợp tử (cá thể mới), tinh trùng phải lần lượt vượt qua 3 chướng ngại vật, từ ngoài vào trong gồm: lớp tế bào nang, màng trong suốt, màng tế bào của noãn [1]. Sau khi tinh trùng dính chặt vào trứng, tinh trùng xuyên thủng vỏ trứng nhờ một loại men phân giải vỏ trứng gọi là enzym lytic nằm trên lớp vỏ của thể đỉnh.

Màng sinh chất của tinh trùng tiếp xúc với màng sinh chất của trứng. Sau khi màng sinh chất tiếp xúc xảy ra, trứng và tinh trùng kết hợp nhau tạo màng sinh chất hỗn hợp là một hiện tượng của sự thụ tinh. * Tinh trùng vượt qua màng trong suốt: Một số tinh trùng có thể tiếp xúc với màng trong suốt. Khi tiếp xúc với các thụ thể trên bề mặt màng trong suốt, phản ứng cực đầu xảy ra, các enzym bên trong túi cực đầu của tinh trùng được phóng thích.

Các enzym này làm tiêu hủy protein của màng trong suốt tại chỗ tiếp xúc cùng với tác động xuyên phá của đầu tinh trùng giúp tinh trùng xuyên thủng được màng trong suốt đi vào khoang quanh noãn và tiếp xúc với màng noãn [5]. *Tinh trùng lọt vào bào tương của noãn: Khi tinh trùng vượt qua màng trong suốt tới tiếp xúc với màng noãn, màng tế bào bọc tinh trùng sáp nhập với Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn 5 màng tế bào bọc noãn. Ở nơi tiếp xúc, màng tế bào của noãn và tinh trùng bị tiêu đi, nhân và bào tương của tinh trùng lọt vào bào tương của noãn để lại màng tế bào nằm bên ngoài noãn[5]. Sự xâm nhập của một tinh trùng đầu tiên vào noãn kích thích hàng loạt các phản ứng sinh học từ noãn gọi là phản ứng vỏ của noãn.

Noãn sẽ tiết vào khoang quanh noãn một chất làm thay đổi cấu trúc màng trong suốt, do đó ngăn cản sự xâm nhập của các tinh trùng khác, những thay đổi này gọi là phản ứng màng trong suốt. Những thay đổi của màng trong suốt được xem như để tạo ra sự phóng bế thứ phát (sự phóng bế muộn) hiện tượng đa thụ tinh. Khi tinh trùng lọt vào bào tương của noãn, noãn bào 2 tiếp tục hoàn tất lần phân chia thứ hai của quá trình giảm phân để sinh ra noãn chín, còn gọi là tiền nhân cái và cực cầu 2. Bào tương của tinh trùng hòa lẫn với bào tương của noãn, nhân của tinh trùng gọi là tiền nhân đực.