Luận văn Thạc sĩ: nghiên cứu vai trò của gen stua ở nấm sợi aspergillus

Khám phá vai trò gen stua trong nấm Aspergillus niger thông qua chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens. Nghiên cứu sâu về cơ chế phân tử.

• Tác giả: Đỗ Thị Bình Xuân Lộc
• Người hướng dẫn: TS. Trần Văn Tuấn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm sợi Aspergillus niger sử dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger trong công nghệ sinh học

Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến và quan trọng nhất thuộc chi Aspergillus. Loài nấm sợi này tồn tại khắp nơi trong tự nhiên, từ đất, thức ăn đến không khí. Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận loài này an toàn (GRAS). Trong ngành công nghệ sinh học, nó đóng vai trò là "nhà máy tế bào" sản xuất axit hữu cơ và enzym ngoại bào. Khả năng tiết lượng lớn protein vào môi trường giúp tối ưu hóa quy trình lên men công nghiệp. Việc nghiên cứu sâu về đặc điểm di truyền phân tử của loài này mở ra cơ hội cải biến chủng giống hiệu quả. Hiểu rõ cơ chế sinh trưởng và hình thái nấm sợi giúp kiểm soát tốt hơn quá trình sản xuất axit citric và các enzym quan trọng như amylase hay protease. Tài liệu nghiên cứu của Đỗ Thị Bình Xuân Lộc (2019) đã nhấn mạnh tầm quan trọng của việc làm sáng tỏ chức năng gen để nâng cao năng suất sinh học.

1.1. Lịch sử và đặc điểm sinh học đặc trưng của Aspergillus niger

Năm 1867, nhà thực vật học Philippe Edouard Léon van Tieghem lần đầu mô tả Aspergillus niger. Loài này thuộc ngành Ascomycota, có khả năng phát triển mạnh trong dải pH rộng từ 1,5 đến 9,8. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng nằm trong khoảng 35-37°C. Hình thái nấm sợi đặc trưng bởi các chuỗi bào tử đen than hình thành trên bọng bào tử. Cấu trúc hệ sợi phát triển theo ba lớp riêng biệt: lớp trên, lớp dưới và mạng lưới ở giữa. Sự biệt hóa tế bào từ sợi nấm sinh dưỡng sang cấu trúc sinh bào tử là một quá trình phức tạp. Quá trình này đòi hỏi sự phối hợp của nhiều yếu tố điều hòa phiên mã khác nhau để đảm bảo tính kị nước và khả năng phân tán bào tử trong không khí.

1.2. Ứng dụng của nấm sợi trong sản xuất enzym và axit hữu cơ

Aspergillus niger chiếm gần 95% sản lượng thương mại của các loại enzym trên thế giới. Nó được dùng để sản xuất axit citric, axit gluconic và các enzym như phytase, cellulase. Trong ngành thực phẩm, các sản phẩm từ loài này giúp cải thiện hiệu quả hấp thụ dinh dưỡng ở vật nuôi. Đặc biệt, enzym protease và amylase từ nấm được ứng dụng rộng rãi trong dệt may, thuộc da và sản xuất đồ uống. Khả năng trao đổi chất linh hoạt cho phép chúng phân hủy các chất lạ sinh học, hỗ trợ đắc lực cho công tác phục hồi sinh học môi trường. Nghiên cứu vai trò của các gen chủ chốt như Gen stuA sẽ giúp kiểm soát tốt hơn các con đường chuyển hóa này.

II. Thách thức nghiên cứu vai trò của gen stuA ở nấm sợi hiện nay

Việc giải trình tự hoàn toàn hệ gen của Aspergillus niger đã tạo tiền đề cho các nghiên cứu di truyền phân tử. Tuy nhiên, việc xác định chức năng cụ thể của từng gen vẫn đối mặt với nhiều khó khăn. Gen stuA được biết đến là yếu tố điều tiết then chốt trong quá trình biệt hóa tế bào và bào tử hóa. Ở các loài nấm khác, gen này ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành cuống sinh bào tử và chuyển hóa thứ cấp. Tuy nhiên, vai trò cụ thể của nó ở loài nấm đen này vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ trước nghiên cứu của Đỗ Thị Bình Xuân Lộc. Thách thức lớn nhất nằm ở việc tạo ra các đột biến ổn định để quan sát kiểu hình. Các phương pháp biến nạp truyền thống thường có hiệu suất thấp và khó thực hiện trên quy mô lớn. Do đó, việc áp dụng phương pháp chuyển gen tiên tiến là yêu cầu cấp thiết để giải quyết bài toán này.

2.1. Đặc điểm di truyền và hệ gen phức tạp của loài nấm sợi

Hệ gen của Aspergillus niger có kích thước khoảng 33,9 đến 38,5 Mb, chia thành tám nhiễm sắc thể. Nó chứa hơn 14.000 gen mã hóa protein, trong đó một lượng lớn liên quan đến vận chuyển nội bào và chuyển hóa cacbohydrate. Sự phức tạp này gây khó khăn cho việc thực hiện Knockout gen đích nếu không có công cụ hỗ trợ chính xác. Các cơ chế sửa chữa DNA tự nhiên của nấm thường ưu tiên con đường nối đầu mút không tương đồng (NHEJ), dẫn đến tần số tích hợp gen ngẫu nhiên cao. Điều này làm giảm tỉ lệ thành công khi muốn thay thế gen bằng cơ chế tái tổ hợp tương đồng truyền thống.

2.2. Tầm quan trọng của yếu tố điều hòa phiên mã đối với sự phát triển

Gen stuA mã hóa cho protein thuộc họ APSES, một nhóm yếu tố điều hòa phiên mã đặc trưng ở nấm. Protein StuA sở hữu tên miền liên kết DNA bảo thủ, tham gia vào việc định hình tổ chức không gian của cuống sinh bào tử. Nếu thiếu hụt yếu tố này, quá trình biệt hóa tế bào bình thường sẽ bị gián đoạn, dẫn đến các khiếm khuyết về hình thái. Ngoài ra, StuA còn điều tiết các nhóm gen liên quan đến sinh tổng hợp độc tố và các hợp chất chuyển hóa thứ cấp. Việc hiểu rõ StuA giúp các nhà khoa học điều khiển được quá trình sinh trưởng và tiết enzym theo ý muốn công nghiệp.

III. Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phương pháp Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) đã cách mạng hóa công nghệ biến nạp gen ở nấm. So với các kỹ thuật sử dụng tế bào trần hay điện biến nạp, Cơ chế ATMT tỏ ra đơn giản và hiệu quả hơn. Vi khuẩn này có khả năng tự nhiên chuyển một đoạn DNA (T-DNA) vào tế bào vật chủ. Kỹ thuật này không yêu cầu các enzym đắt tiền để loại bỏ thành tế bào nấm, giúp tiết kiệm chi phí đáng kể. Phương pháp này áp dụng thành công trên nhiều loại nấm sợi, bao gồm cả những loài khó biến nạp nhất. Trong nghiên cứu của mình, Đỗ Thị Bình Xuân Lộc đã sử dụng ATMT để thực hiện Knockout gen stuA một cách chính xác. Đây là công cụ hữu hiệu để tạo ra các thư viện đột biến phục vụ phân tích chức năng gen hệ thống. Ưu điểm nổi bật của ATMT là phần lớn các thể chuyển gen chỉ tích hợp một bản sao T-DNA duy nhất vào hệ gen.

3.1. Tìm hiểu cơ chế ATMT trong quá trình biến nạp gen ở nấm

Cơ chế ATMT dựa trên hoạt động của vùng độc lực (vir) trên Ti plasmid của vi khuẩn. Khi có mặt các hợp chất phenolic như acetosyringone, các gen vir được kích hoạt để cắt và vận chuyển T-DNA. Đoạn T-DNA này được bảo vệ bởi các protein chuyên biệt và đưa vào nhân tế bào nấm qua hệ thống tiết loại IV. Sau đó, T-DNA sẽ tích hợp bền vững vào hệ gen của nấm sợi. Quá trình này diễn ra tương tự như sự lây nhiễm tự nhiên ở thực vật nhưng được cải tiến để mang các gen mong muốn. Sự tương tác giữa protein VirD2 và hệ thống vận chuyển của vật chủ đóng vai trò quyết định đến hiệu suất chuyển gen ở nấm.

3.2. Ưu điểm của phương pháp chuyển gen ở nấm bằng vi khuẩn

Sử dụng Agrobacterium tumefaciens giúp loại bỏ quy trình chuẩn bị tế bào trần phức tạp. Các cấu trúc như bào tử, sợi nấm hay thể quả đều có thể dùng làm nguyên liệu đầu vào. ATMT thúc đẩy quá trình tái tổ hợp tương đồng, giúp việc Knockout gen đạt hiệu suất cao hơn từ 3 đến 6 lần so với phương pháp hóa học truyền thống. Hơn nữa, các thể chuyển gen thu được thường có tính ổn định di truyền cao qua nhiều thế hệ. Điều này cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu dài hạn về chức năng gen và cải biến đặc tính sinh học của nấm trong sản xuất công nghiệp.

IV. Cách tạo vector chuyển gen và kỹ thuật knockout gen stuA chi tiết

Để điều tra vai trò của Gen stuA, việc thiết kế Vector chuyển gen là bước đi tiên quyết. Nghiên cứu đã sử dụng khung vector nhị thể pKO2 để xây dựng cấu trúc xóa gen. Hai đoạn DNA tương đồng (vùng 5' và 3' của gen stuA) được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR và nối vào vector. Giữa hai vùng này, một marker chọn lọc như gen kháng kháng sinh (clonNAT) hoặc gen trợ dưỡng (pyrG) được chèn vào. Khi cấu trúc này được chuyển vào Aspergillus niger, cơ chế tái tổ hợp tương đồng sẽ thay thế gen stuA nguyên bản bằng marker chọn lọc. Quá trình này tạo ra các chủng đột biến sạch, cho phép đánh giá chính xác các thay đổi về kiểu hình. Việc sử dụng đa dạng các marker giúp tăng tính linh hoạt và độ tin cậy cho kết quả thực nghiệm. Các chủng sau biến nạp được sàng lọc kỹ lưỡng qua nhiều vòng cấy ria để đảm bảo tính thuần khiết.

4.1. Quy trình thiết kế vector chuyển gen và marker chọn lọc

Vector chuyển gen pKO2AstuA được tạo ra bằng cách nối các đoạn gen 5' và 3' stuA vào vị trí nhận biết của enzym giới hạn. Việc lựa chọn marker chọn lọc là gen kháng nourseothricin (clonNAT) giúp dễ dàng nhận diện các khuẩn lạc đã nhận DNA ngoại lai. Ngoài ra, marker trợ dưỡng pyrG cũng được sử dụng để tăng hiệu suất xóa gen lên đến 13,83%. Các cấu trúc vector sau khi lắp ráp đều được xác nhận lại bằng cách cắt kiểm tra với enzym giới hạn và giải trình tự. Bước này đảm bảo rằng các đoạn DNA được sắp xếp đúng hướng và không có đột biến ngoài ý muốn trong quá trình nhân bản.

4.2. Kỹ thuật sàng lọc và xác nhận các thể biến nạp thành công

Sau khi đồng nuôi cấy vi khuẩn và nấm, các màng cellulose được chuyển sang môi trường chứa kháng sinh để sàng lọc. Chỉ những tế bào nấm đã thực hiện biến nạp gen thành công mới có thể sinh trưởng. Các khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu để xác nhận sự mất mát của Gen stuA. Kết quả điện di DNA hệ gen cho thấy sự biến mất của băng DNA đặc trưng cho khung đọc mở của gen mục tiêu. Việc sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi giúp loại bỏ các trường hợp tích hợp ngẫu nhiên (ectopic), đảm bảo chủng thu được là chủng xóa gen đích thực sự.

V. Kết quả phân tích vai trò gen stuA đối với hình thái nấm sợi

Kết quả nghiên cứu cho thấy Gen stuA đóng vai trò không thể thay thế trong việc định hình hình thái nấm sợi. Chủng xóa gen stuA (ΔstuA) biểu hiện kiểu hình màu trắng do không thể tích lũy sắc tố melanin đen đặc trưng. Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy cấu trúc cuống sinh bào tử bị biến dạng nghiêm trọng, thiếu các thể bình sơ cấp và thứ cấp. Quá trình bào tử hóa bị suy giảm mạnh, chỉ còn một vài bào tử hình thành trực tiếp từ bọng bào tử. Điều này chứng tỏ StuA là nhân tố điều phối chính sự biệt hóa tế bào sinh sản. Ngoài ra, việc xóa gen còn ảnh hưởng đến khả năng sử dụng nguồn cacbon và nitơ của nấm. Chủng đột biến sinh trưởng mạnh hơn trên glucose nhưng lại kém hiệu quả trên cellulose. Điều này gợi ý StuA có thể là yếu tố điều hòa âm đối với một số con đường chuyển hóa sơ cấp nhưng lại hỗ trợ biểu hiện các enzym phân giải sinh khối.

5.1. Ảnh hưởng của gen stuA đến quá trình bào tử hóa và sợi nấm

Sự thiếu hụt Gen stuA làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc sợi nấm khí sinh. Thay vì hình thành các cuống sinh bào tử vươn cao, chủng đột biến tạo ra các cấu trúc ngắn và bất thường. Mật độ bào tử giảm hàng nghìn lần so với chủng tự nhiên, gây khó khăn cho việc phát tán trong môi trường. Tuy nhiên, một phát hiện thú vị là khi tăng nhiệt độ nuôi cấy lên 37°C, khả năng hình thành bào tử của chủng ΔstuA được phục hồi một phần. Điều này cho thấy có những con đường bù trừ di truyền phụ thuộc nhiệt độ đang tồn tại trong hệ gen của Aspergillus niger, mở ra hướng nghiên cứu mới về tương tác gen-môi trường.

5.2. Tác động của gen đến chuyển hóa thứ cấp và khả năng gây bệnh

Gen stuA còn ảnh hưởng đến khả năng axit hóa môi trường và sinh tổng hợp enzym cellulase. Chủng xóa gen có khả năng gây hỏng quả nho sau thu hoạch giảm 52% so với chủng gốc. Điều này liên quan trực tiếp đến việc giảm tiết các axit hữu cơ và enzym phân giải thành tế bào thực vật. Kết quả này cho thấy StuA không chỉ điều khiển hình thái mà còn kiểm soát các hoạt động chuyển hóa thứ cấp quan trọng. Đây là cơ sở để phát triển các biện pháp kiểm soát nấm gây hại nông sản thông qua việc ức chế các yếu tố điều hòa phiên mã chủ chốt.

VI. Tương lai ứng dụng di truyền phân tử nấm sợi Aspergillus niger

Nghiên cứu về Gen stuA đã mở ra những hiểu biết sâu sắc về mạng lưới điều hòa của Aspergillus niger. Việc làm chủ phương pháp chuyển gen ATMT cho phép các nhà khoa học tiếp tục khám phá các gen đích khác trong hệ gen. Trong tương lai, kỹ thuật di truyền phân tử có thể giúp thiết kế các chủng nấm tối ưu cho sản xuất công nghiệp. Ví dụ, việc tạo ra các chủng nấm ít bào tử nhưng vẫn tiết lượng enzym cao sẽ giúp giảm ô nhiễm bào tử trong nhà máy. Đồng thời, các phát hiện về vai trò của StuA trong việc đáp ứng stress môi trường (H2O2, SDS) sẽ giúp tạo ra các chủng giống bền bỉ hơn. Sự kết hợp giữa công nghệ biến nạp gen hiện đại và phân tích sinh học hệ thống hứa hẹn sẽ mang lại những đột phá mới cho ngành công nghệ sinh học nấm sợi tại Việt Nam và trên thế giới.

6.1. Đánh giá hiệu quả của phương pháp chuyển gen ATMT

Phương pháp ATMT đã chứng minh được tính ưu việt trong việc thực hiện Knockout gen ở nấm sợi. Hiệu suất xóa gen đạt được trong nghiên cứu là minh chứng cho khả năng ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật này. Việc sử dụng các marker trợ dưỡng như pyrG không chỉ giúp chọn lọc hiệu quả mà còn tạo tiền đề cho việc thực hiện đa đột biến trên cùng một chủng. Đây là công cụ không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu về nấm hiện nay. Sự ổn định của các thể chuyển gen qua nhiều vòng cấy truyền đảm bảo tính chính xác cho các phân tích sinh hóa và sinh học phân tử tiếp theo.

6.2. Định hướng phát triển các chủng nấm sợi mang đặc tính ưu việt

Dựa trên hiểu biết về Gen stuA, các nhà nghiên cứu có thể điều chỉnh quá trình sinh trưởng của nấm để phục vụ mục đích cụ thể. Việc phục hồi gen (complementation) đã khẳng định chắc chắn vai trò của StuA, cho thấy tiềm năng của việc tái cấu trúc hệ gen. Định hướng tương lai sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa khả năng tiết protein ngoại lai bằng cách can thiệp vào các yếu tố điều hòa phiên mã. Đồng thời, việc nghiên cứu các gen hạ nguồn của StuA sẽ giúp lập bản đồ chi tiết về con đường truyền tín hiệu phát triển ở Aspergillus niger. Những nỗ lực này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị kinh tế to lớn cho ngành sản xuất chế phẩm sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Aspergillus niger là một trong những loài phô biến và quan trọng nhất thuộc chỉ Aspergilius. Loài nắm này có thể được tìm thấy khắp nơi trên Trái Đất, từ đất, thức ăn, các sản phẩm thực vật và ngay cả trong không khí. niger đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn và sản phẩm đo nó sinh ra được sử dụng phổ biến trong công nghệp thực phẩm và đồ uống. niger co kha nang tiét nhiều loại enzym vào môi trường nuôi cây, do đó loài nắm này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các axit hữu cơ và các enzym ngoại bảo, điển hình là axit citric, axit gluconic, các enzym quan trọng như phytase, amylase, protease, o-galactosidae va hàng loạt các enzym khác.

Nghiên cứu chức năng gen ở nắm sợi đã có những bước tiến lớn trong những năm gần đây. Năm 1998, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dugc áp dụng thành công lần đầu tiên ở nam sợi. Phương pháp này với ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, áp dụng được trên nhiều loại nắm khác nhau làm cho phương pháp này trở thành một công cụ hữu hiệu trong các thí nghiệm nghiên cứu tạo đột biến gen đích và điều tra chức năng gen ở nắm sợi. Xóa gen theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng là giải pháp toàn diện để điều tra và đánh giá một cách cụ thể chức năng của gen, đồng thời cho phép quan sát kiêu hình liên quan đên gen đã bị xóa một cách chính xác.

Gần đây, hệ gen của A. øiger đã được giải trình tự hoàn toàn, những dữ liệu thu được đã hỗ trợ tích cực cho các nghiên cứu về cải biến di truyền để điều tra vai trò của các gen mong muốn. Gen s/A là gen chủ chốt của quá trình phát triển và biệt hóa tế bào, hình thành bào tử, hình thành sợi, trao đổi chất bậc một và trao đổi chất bậc hai. Vai trò của gen s/⁄A đã được nghiên cứu ở nhiều nắm sợi khác như Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Acremonium chrysogenum.

Tuy nhiên, vai trò của gen nay 0 A. niger van chưa được điều tra. Do đó, đề tài luận văn với tiêu đê: “Nghiên cứu vai trò của gen s⁄A ở nâm soi Aspergillus niger st Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc dụng phương pháp chuyển gen nhờ vi khudn Agrobacterium tumefaciens” dugc xây dựng và thực hiện với những nội dung chính như sau: - _ Xóa gen sf/A ở A. niger sử dụng phương pháp chuyên gen nhờ vi khuẩn A.

tumefaciens va marker chon loc la gen khang khang sinh hoặc gen trợ dưỡng uridine/uracIl. - _ Phục hồi sự biểu hiện của gen s/zA ở chủng A. møiger đột biến đã xóa gen siuA. - Điều tra, so sánh đặc điểm sinh ly, sinh héa cua chung A.

niger xoa gen stuA so với chủng nầm gôc và chủng phục hôi. Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Chuong 1. Téng quan vé nam soi Aspergillus niger 1. Lịch sử nghiên cứu và đặc điểm sinh học của nấm sợi A.

niger Chi Aspergilius là một chỉ nắm sợi gồm hàng trăm loài phân bố ở các điều kiện khí hậu khác nhau trên toàn thế giới, bao gồm một số tác nhân gây bệnh cơ hội (A. terreus), sản xuất độc tô (A. parasiticus) và các loài được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp như A. oryzae, trong đó nổi bật hơn cả là A.

Năm 1867, lần đầu tiên A. niger duoc mô tả bởi nhà thực vật học người Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem trong ban thảo “Physiologie des mucédinées ”. Khi đó, 6ng phan lap dugc Aspergillus sp. có bào tử tương tự như As/ergillus glaucus nhưng có màu đen trên các môi trường khác nhau, tạo ra mùi mốc và một số đặc điểm khác.

Ông đã đặt tên cho loài nắm này là A. niger thuộc giới nam, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Eurotiales, ho Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhom Aspergillus phan nhom Nigri hay tén goi khac 1a phan nhom Aspergillus den [45]. niger phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, nó có thê được phân lập trên tat cả các châu lục và không co su chon loc nao voi điều kiện môi trường, chúng sinh trưởng một cách tự nhiên trên vật chất hữu cơ [92]. Loài nắm này phát triển mạnh trong đất và rác, phân compost và nguyên liệu thực vật đang phân rã, thậm chí có thê được tìm thấy trong môi trường băng giá và môi trường biên.

møiger là vi sinh vật hiếu khí, sinh trưởng và phát triển khi có mặt oxy. Chúng có thê sinh trưởng ở các điều kiện môi trường đa dạng từ nhiệt độ đến pH. øiger phát triển ở nhiệt độ từ 6 - 47°C, tối ưu ở khoảng 35 - 37°C. Nó có thê sống sót ở 60°C nhưng sẽ bị loại bỏ ở 63°C trong vòng 25”.

Khoảng pH cho phép A. øiger sinh trưởng rất rộng, từ 1,5 - 9,8 và tối ưu nhất là ở pH = 6 [7, 41, 57]. Luận văn tốt nghiệp Đã Ti hị Bình Xuân Lộc Hình 1. Hình thái nắm sợi A.

ziger trên đĩa và dưới kính hiển vi [43, 120] (A) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch, (B) Mép ngoài khuẩn lạc, (C) Trung tâm khuẩn lạc, (D) Hình thái hiển vi của cuống sinh bào tử. (E) Bào tử của nam soi A. niger dưới kính hiển vi. Thanh tỉ lệ = 10 pm Ở 30°C, đường kính khuẩn lạc của A.

miger tăng khoảng 0,25 mm trong vòng 1 giờ với điều kiện dư thừa chất đinh dưỡng. Hình ảnh đưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy răng vùng mép ngoài của khuẩn lạc A. ziger 7 ngày tuổi chỉ gồm một lớp sợi nắm duy nhất. Một vài milimet phía trong vùng ngoại vi thì hệ sợi dày hơn và có thể lên đến sáu lớp sợi nắm chồng lên nhau.

Sáu lớp sợi nắm này chia thành 3 lớp riêng biệt: lớp trên cùng, lớp dưới cùng và các lớp ở giữa gồm mạng lưới hệ sợi mỏng và dày. Cấu trúc hệ sợi với ba lớp riêng biệt cũng được quan sát thấy ở trung tâm của khuẩn lạc [47]. Luận văn tốt nghiệp Đã Ti hị Bình Xuân Lộc Hình 1. Quá trình phát triển của A.

niger được theo dõi dưới kính hiển vi điện tử quét [47] (A) Sợi nắm khí sinh tương tự với sợi nắm sinh dưỡng. (C, D) Đỉnh sợi khí sinh phông lên để tạo thành bọng bào tử. (E) Các chổi hình thành trên các bọng bào tử. (F, G) Chỗi phát triển thành thê bình sơ cấp.

(H) Thể bình thứ cấp hình thành trên đỉnh của thê bình thứ cấp. (1, J) Cac chuỗi bào tử được tạo thành trên thể bình thứ cấp. Thanh tỷ lệ từ hình A-F tương tự như hình G Sau thời kì tăng trưởng sinh dưỡng, A. niger tạo thành hai loại sợi nắm khí sinh.

Một loại khá giống với sợi nắm sinh dưỡng và có đường kính khoảng 2 - 3 um, loai còn lại có đường kính khoảng 6 - 7 um. Các sợi nắm khí sinh đường kính 2 - 3 um của được hình thành sau khi cây bao tử trên môi trường đầy đủ khoảng 8 giờ. Mặc dù thời gian hình thành sợi nắm khí sinh dường như không phụ thuộc vào môi trường nuôi cây nhưng mật độ của chúng trên môi trường tôi thiêu thâp hơn so Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc với môi trường đầy đủ. Sự hình thành của hệ sợi khí sinh bắt đầu ở trung tâm khuẩn lạc, di chuyên ra ngoài và dừng lại khi cách mép hệ sợi nắm vài milimet.

Điều này có nghĩa rằng khả năng hệ sợi hình thành hệ sợi khí sinh sẽ nhanh hơn khi khuẩn lạc già hơn [4]. Quá trình sinh trưởng khí sinh đã được đề xuất là liên quan đến tín hiệu mật độ tế bào của sợi nắm sinh dưỡng [112, 114]. Phân tử tín hiệu sẽ cảm ứng gen kị nước. Những gen này mã hóa protein làm giảm sức căng bề mặt nước để cho phép sợi nắm xuyên qua mặt phân cách để phát triển trong không khí và làm cho các cấu trúc như cấu trúc sinh bào tử và bào tử có tính kị nước.

Tính kị nước này đảm bảo rằng cấu trúc sinh sản không rơi trở lại cơ chất trong điều kiện âm ướt và giúp bào tử phân tán bằng gió hoặc vector. Tuy nhiên, những protein kị nước nào được tiết vào môi trường nuôi cấy đề làm giảm sức căng bề mặt vẫn chưa được biết đến [1 11, 113]. niger cũng như phần lớn các loài thuộc chỉ Aspergillus được biết mới chỉ có hình thức sinh sản vô tính với cấu trúc sinh bào tử khá đặc trưng [5]. Cấu trúc sinh bào tử được biệt hóa từ cuống sinh bào tử.

Cuống sinh bào tử đầu tiên của A. niger hình thành sau 10 giờ và cấu trúc sinh bào tử hình thành sau 20 giờ nuôi cấy ở 30°C. Khi cuống sinh bào tử đạt đến chiều cao tối đa của nó, phần đỉnh sợi sẽ phông lên và hình thành bọng bảo tử có đường kính 10 um. Trên các bọng bảo tử này sẽ hình thành các chi, từ đó phát triển thành thể bình.

Thẻ bình gồm hai lớp, lớp thể bình sơ cấp hình tam giác cân ngược, lớp thê bình thứ cấp hình chai; bào tử đính xòe ra, hình cầu xù xì, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4 - 5 um [27]. Các chuỗi bào tử đính được tạo thành trên thể bình thứ cấp và có tới hơn 10000 bào tử có thể được tạo ra từ một cấu trúc sinh bào tử [47]. Đặc điểm di truyền của nắm sợi A. niger Kích thước hệ gen của A.

øser ước tính vào khoảng từ 35,5 - 38,5 megabase (Mb) gồm tám nhiễm sắc thể có kích thước khác nhau, dao động từ 3,5 - 6,6 Mb. Luận văn tốt nghiệp Đỗ Thị Bình Xuân Lộc Năm 2007, trình tự toàn bộ hệ gen của chủng A.88 đã được công bố và dữ liệu hệ gen được lưu trữ tại http://www. 01 Metabolism: 3,002 08 Transport:975 |06 Protein fate: 901 | 01. So sanh cac nhom protein chitc nang 6 A.

niger với một số loài nắm khác [79]. Sce, Saccharomyces cerevisiae; Mgi, Magnaporthe grisea; Ncr, Neurospora crassa; Sno, Stagonospora nodulum; Ani, Aspergillus nidulans; Afu, Aspergillus fumigatus; Aor, Aspergillus oryzae; Ang, Aspergillus niger. Chuyén héa (01): chuyên hóa cacbon và hợp chất carbohydrate (01.05), chuyển hóa lipit, axit béo và isoprenoid (01.06), chuyển hóa thứ cấp (01. Vận chuyền nội bảo (08): vận chuyền bằng bóng bảo (08.07), vận chuyền ngoại bảo, xuất bào và quá trình tiết (08.

Số phận protein (06): quá trình tiết protein và số phận (06.04) và vận chuyền nội bào (06. Độ dài của các thanh tỷ lệ thuận với số lượng gen trong mỗi nhóm. Kích thước hệ gen của chủng CBS 513.88 là 33,9 Mb; gồm 14165 gen được dự đoán là mã hóa cho protein.