mở đầu cho việc xâm nhiễm. Tuy nhiên, fiber không thể thực hiện được chức năng một mình, mà phải luôn liên kết với protein penton; bộ phận nắm giữ vai trò đó chính là đuôi fiber (Hình 2A). A B Hình 2: Cấu trúc fiber và sự liên kết với penton A. Cấu trúc chung protein fiber [71], B.
Sự sắp xếp penton trong cấu trúc DF (cắt nửa) [56] Sự kết hợp của hai protein fiber và penton của HAdV-3 đã được chỉ ra là “chìa khóa” giúp HAdV bám lên và xâm nhiễm tế bào chủ [6]. Chúng tạo thành cấu trúc Dodecahedron-fiber (DF) được tổng hợp rất nhiều trong vòng đời của HAdV- 3,4,7,9,11,15 [18, 56]. Trên thực tế, trong quá trình xâm nhiễm của HAdV-3, cấu trúc DF còn được tổng hợp nhiều hơn cả các hạt vi-rút hoàn chỉnh. Mỗi DF được cấu thành từ 12 pentamer penton gắn với 12 trimer fiber tương ứng (Hình 2B).
Cơ chế hoạt động chính xác của DF vẫn chưa sáng tỏ, nhưng đã biết được đầu tương tác fiber của HAdV-3 nhận biết 2 domain SCR1 và SCR2 của thụ thể CD46, kết hợp với Penton để “mở đường” chui vào tế bào (Hình 3). Nhiều nhóm nghiên cứu đã ứng dụng những hiểu biết về cấu trúc DF để tạo ra những vector chuyển gen ở người [17, 18, 31, 42]. 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 3: Sự liên kết giữa fiber và domain SCR1-2 của thụ thể CD46 [40] 1. Protein penton của HAdV Có thể nói penton là protein trung gian giữa hai protein fiber và hexon bởi vì penton liên kết chặt chẽ với 2 protein này ở những phần cấu trúc riêng biệt: Phần lõi lõm vào của pentamer penton là đặc điểm thích hợp để gắn protein fiber; còn hình dáng bên ngoài của penton là “hẹp ở chân, rộng ở đầu” – bắt cặp khít với hình dáng “hẹp ở đầu, rộng ở chân” của hexon [72].
Đáng chú ý, penton của các chủng HAdV khác nhau có trình tự axit amin tương đối bảo thủ hơn so với fiber và hexon [72], điều này thích hợp để lý giải cho những chức năng quan trọng của protein này. Đặc biệt hơn là penton còn thể hiện thêm nhiều vai trò quan trọng khác khi liên kết với nhiều thành phần lõi của vi-rút như: protein IIIa và genome [30]. Một nghiên cứu đã chỉ ra penton là protein đích thứ 2 của các tế bào miễn dịch T (chỉ xếp sau hexon) [57]. Chính vì vậy mà penton được xem là giữ vai trò quan trọng trong tính đặc hiệu và hiệu quả của các vector chế tạo từ human adenovirus [33].
10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Protein hexon của HAdV Hexon là protein cấu trúc có kích thước lớn nhất và có số lượng nhiều nhất trong lớp vỏ của HAdV. Một trimer hexon có cấu trúc không gian dạng lục giác, việc này giúp chúng có thể liên kết sát nhau và hạn chế các khoảng trống trên bề mặt capsid. Hơn nữa, protein hexon liên kết chặt chẽ với protein penton để tạo nên cấu trúc “nhóm sáu” (Group of Six – GOS) giúp liên kết các “nhóm chín” (Group of Nine – GON) với nhau (GOS và GON là hai đơn vị thành phần tạo nên lớp vỏ 20 mặt của HAdV) (Hình 4) [9, 30].
Đặc biệt, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng: hexon là mục tiêu nhận biết của hệ miễn dịch để chống lại HAdV [47, 65]. Nghiên cứu năm 2007 của David Onion đã thể hiện rõ ràng sự nhận biết của tế bào miễn dịch CD4+ đối với hexon chứ không phải fiber hay penton [39]. Các tế bào miễn dịch có thể nhận biết được hexon là vì protein này có những vùng cấu trúc siêu biến (hypervariable regions - HVR). Các vùng siêu biến này cũng từng được sử dụng như một đặc điểm riêng biệt để phân biệt các chủng HAdV khác nhau [50].
Hình 4: Sự liên kết giữa GON và GOS tạo nên vỏ capsid HAdV [8] 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Như vậy, 3 protein vỏ: fiber, penton, và hexon kết hợp chặt chẽ với nhau để giúp HAdV tồn tại, lây nhiễm và gây ra nhiều loại bệnh cho con người. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu sâu về các protein nêu trên còn cực kỳ hạn chế. Luận văn này là công trình nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc của 3 protein fiber, penton, và hexon ở Việt Nam. Việc phân tích và so sánh với các công bố trên thế giới sẽ chỉ ra những biến đổi quan trọng trên 3 protein vỏ, giúp HAdV-3 ở Việt Nam có khả năng lây lan mạnh mẽ.
Ưu điểm và hạn chế của phương pháp giải trình tự Sanger Về cơ bản thì hai phương pháp giải trình tự này sử dụng cùng một cơ chế là: các nucleotide (gắn huỳnh quang) được sử dụng để tổng hợp nên mạch ADN mới, và tín hiệu huỳnh quang phát ra được đọc bởi các máy quay siêu nhạy. Điểm khác biệt lớn nhất là phương pháp Sanger chỉ giải được trình tự của 1 đoạn ADN mỗi lần chạy, trong khi đó, NGS có thể giải trình tự được hàng triệu đoạn ADN cùng một lúc (kích thước mỗi đoạn ADN ngắn hơn so với phương pháp Sanger). Chính vì điểm khác biệt này mà phương pháp NGS có những ưu điểm vượt trội về: thời gian ngắn và lượng dữ liệu đầu ra rất lớn. Tuy nhiên, NGS chỉ thích hợp để giải trình tự của những hệ gen lớn (trên 100 gen mỗi lần chạy).
Còn trong luận văn này, chúng tôi chỉ giải trình tự của 3 gen fiber, penton và hexon, nên phương pháp Sanger là lựa chọn tiết kiệm hơn, phù hợp với điều kiện kinh phí của đề tài. Hơn nữa, giải trình tự Sanger được xem là tiêu chuẩn vàng với độ chính xác lên tới là 99,99%, và thường được sử dụng để kiểm tra lại kết quả giải trình tự NGS. Khẳng định này được đưa ra bởi một trong những công ty hàng đầu thế giới về NGS là ThermoFisher [81]. Tổng quan về axit amin Axit amin là những hợp chất hữu cơ sinh học quan trọng trong mọi cơ thế sống.
Cấu trúc chung của mỗi axit amin gồm 3 phần: Nhóm chức amin (-NH2), Nhóm axit cacboxylic (-COOH) và một nhóm thay thế (gọi là R). Ba bộ phận này được kết nối bởi một nguyên tử Cacbon tại vị trí α (Hình 5). 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhóm thay thế R Nhóm Amin Nhóm Axit cacboxylic Hình 5: Cấu trúc axit amin [59] Trong đó, các tính chất vật lý và hóa học nhóm R chính là yếu tố quyết định những đặc điểm riêng biệt của mỗi axit amin, từ đó tạo ra các chức năng, vai trò riêng của mỗi chuỗi polypeptide (cấu trúc bậc 1 của protein, mục 1. Chính từ những tính chất của nhóm R, 20 axit amin được tổng hợp trong cơ thể người được chia thành 4 nhóm chính: axit amin không phân cực, axit amin phân cực tích điện âm, axit amin phân cực tích điện dương, và axit amin phân cực trung tính [80].
Thông thường, các axit amin không phân cực cũng sẽ được xếp vào nhóm kỵ nước, còn axit amin phân cực sẽ có tính ưa nước [59]. Để có thể đánh giá được độ mạnh-yếu những tính chất của các axit amin, hai chỉ số thường được sử dụng nhất là: giá trị pI và chỉ số H. Bảng 2 trình bày các giá trị cụ thể của giá trị pI theo tiến sỹ Allison Soult [80], và chỉ số H theo nghiên cứu của Jack Kyte [28]. 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 2: Giá trị pI và chỉ số pH của các axit amin Axit amin Giá trị pI Chỉ số H Axit amin Giá trị pI Chỉ số H Alanine (A) 6,11 1,8 Leucine (L) 6,04 3,8 Arginine (R) 10,76 -4,5 Lysine (K) 9,47 -3,9 Asparagine (N) 5,41 -3,5 Methionine (M) 5.
Đối với chỉ số H, theo nghiên cứu của Jack Kyte [28], khi H càng lớn thì axit amin càng kỵ nước, càng nhỏ thì càng ưa nước. Nói cách khác, H lớn thì axit amin dễ tan trong nước và ngược lại. Các nhóm chức amin và cacboxylic cũng có một chức năng rất quan trọng là tạo phản ứng trùng hợp để tạo ra chuỗi polypeptide. Khi nhóm chức amin của 1 axit amin tiếp cận với nhóm chức cacboxylic của 1 axit amin khác, chúng tương tác với nhau trong phản ứng khử nước, và tạo ra liên kết peptide nối 2 axit amin lại với nhau.
Quá trình phản ứng này lặp lại nhiều lần sẽ tạo ra một chuỗi polypeptide có một đầu mang nhóm amin tự do, một đầu mang nhóm cacboxylic tự do. Chuỗi liên kết các nhóm amin và cacboxylic được gọi là “xương sống” của chuỗi polypeptide. Thông thường, mỗi chuỗi polypeptide này bao gồm dưới 1.000 axit amin và được coi là một protein ở dạng cấu trúc bậc 1 [59]. 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Cấu trúc của protein Có tất cả 4 dạng cấu trúc của protein. Dạng cơ bản nhất chính là chuỗi polypeptide như đã nêu trên, tuy nhiên, protein chưa thể thực hiện được các chức năng sinh học khi tồn tại ở dạng này. Vì vậy mà các chuỗi polypeptide cần phải cuộn gập theo nhiều cách khác nhau để hình thành những cấu trúc không gian bậc cao hơn, tùy thuộc vào các axit amin thành phần và trật tự sắp xếp của chúng. Một protein ở dạng cấu trúc bậc 2 là một chuỗi polypeptide đã hình thành những đoạn cuộn xoắn α, hoặc nếp gấp β, hoặc kết hợp cả hai.
Điểm chung của hai dạng cấu trúc này là hình thành liên kết hydro giữa các nguyên tử nằm trên “xương sống” của chuỗi polypeptide. Sự khác biệt nằm ở chỗ, dạng xoắn α xuất hiện khi các axit amin thứ 4, 8, 12, 16,… trên cùng một chuỗi polypeptie liên kết với nhau bằng liên kết hydro. Còn dạng nếp gấp β hình thành khi các đoạn của chuỗi polypeptide liên kết với nhau bằng liên kết hydro theo phương song song và hướng ngược chiều (Hình 6). Trên thực tế, mỗi loại protein sẽ có tỉ lệ cuộn xoắn α và nếp gấp β khác nhau.
Ví dụ như protein α-keratin có phần lớn cấu trúc cuộn xoắn theo kiểu α để cấu tạo nên các sợi tóc; ngược lại, phần lớn các protein trong tơ nhện lại liên kết với nhau theo dạng nếp gấp β [59]. Hình 6: Cấu trúc chuỗi xoắn α và nếp gấp β [3] 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cấu trúc bậc 3 của protein đã có sự tham gia của các liên kết giữa các nhóm R. Cần kể đến trước tiên là liên kết kỵ nước giữa các nhóm R kỵ nước của các axit amin trên cùng chuỗi polypeptide. Vì các nhóm R kỵ nước có xu hướng quay vào bên trong trung tâm protein, khi chúng tiến đến gần nhau, lực tương tác van der Waals đã giữ chúng lại để tạo thành liên kết kỵ nước (Hình 7).