Luận văn thạc sĩ về đa dạng di truyền chi Ancistrocladus tại Việt Nam

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài thuộc chi trung quân ancistrocladus ở việt nam, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả

• Tác giả: Phạm Thị Thanh Hương
• Người hướng dẫn: TS. Lê Quỳnh Liên
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu đa dạng di truyền một số loài thuộc chi Trung quân (Ancistrocladus) ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Lí do chọn đề tài
• 0.2. Mục tiêu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Chi Trung quân Ancistrocladus
• 1.1.1. Phân loại học
• 1.1.2. Sơ lược về chi Trung Quân
• 1.1.3. Đa dạng di truyền chi Trung Quân
• 1.1.4. Tình hình nghiên cứu chi Trung Quân ở Việt Nam
• 1.1.5. Đánh giá đa dạng di truyền bằng phương pháp sinh học phân tử
• 1.1.5.1. Các chỉ thị DNA trong đánh giá đa dạng di truyền
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu nghiên cứu
• 2.2.2. Phương pháp tách DNA tổng số từ lá
• 2.2.3. Phương pháp nhân đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR
• 2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pT257 R/T
• 2.2.6. Tiến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli
• 2.2.7. Tách chiết DNA plasmid
• 2.2.8. Phương pháp điện di kiểm tra kết quả
• 2.2.9. Phương pháp phân tích trình tự nucleotide và phân tích cây phát sinh chủng loại
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tách DNA tổng số
• 3.2. Kết quả nhân các đoạn chỉ thị bằng phương pháp PCR
• 3.3. Kết quả gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pTZ57 R/T
• 3.4. Kết quả xác định trình tự
• 3.5. Kết quả phân tích đa dạng di truyền của Trung quân nghiên cứu
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đa dạng di truyền chi Ancistrocladus ở Việt Nam

Chi Ancistrocladus là một trong những chi thực vật có giá trị y học cao, với nhiều loài phân bố tại Việt Nam. Nghiên cứu đa dạng di truyền của chi này không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen mà còn mở ra cơ hội khai thác dược liệu. Việt Nam với hệ sinh thái phong phú là nơi lý tưởng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của chi Ancistrocladus.

1.1. Đặc điểm sinh học và phân loại chi Ancistrocladus

Chi Ancistrocladus thuộc họ Ancistrocladaceae, có nhiều loài dây leo với đặc điểm sinh học đa dạng. Các loài trong chi này thường chứa nhiều hợp chất alkaloid có giá trị dược lý, được sử dụng trong y học cổ truyền.

1.2. Tình hình nghiên cứu chi Ancistrocladus tại Việt Nam

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về chi Ancistrocladus trên thế giới, nhưng tại Việt Nam, số lượng nghiên cứu còn hạn chế. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào hình thái học, trong khi di truyền học vẫn chưa được khai thác đầy đủ.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu đa dạng di truyền chi Ancistrocladus

Nghiên cứu đa dạng di truyền chi Ancistrocladus gặp nhiều thách thức, bao gồm sự tương đồng về hình thái giữa các loài và thiếu thông tin di truyền. Điều này gây khó khăn trong việc phân loại và xác định các loài mới.

2.1. Sự tương đồng hình thái giữa các loài

Nhiều loài trong chi Ancistrocladus có hình thái tương tự nhau, dẫn đến khó khăn trong việc phân loại. Việc sử dụng các phương pháp di truyền học có thể giúp phân biệt các loài này.

2.2. Thiếu thông tin di truyền và tài liệu tham khảo

Số lượng tài liệu nghiên cứu về di truyền học của chi Ancistrocladus tại Việt Nam còn rất ít. Điều này làm hạn chế khả năng áp dụng các phương pháp hiện đại trong nghiên cứu.

III. Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền chi Ancistrocladus hiệu quả

Để đánh giá đa dạng di truyền của chi Ancistrocladus, các phương pháp sinh học phân tử như phân tích gen và chỉ thị DNA được áp dụng. Những phương pháp này giúp xác định sự khác biệt di truyền giữa các loài.

3.1. Phân tích gen ITS và MatK trong nghiên cứu

Gen ITS và MatK là hai chỉ thị di truyền quan trọng trong việc phân tích đa dạng di truyền. Chúng giúp xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các loài trong chi Ancistrocladus.

3.2. Sử dụng chỉ thị DNA trong đánh giá đa dạng di truyền

Các chỉ thị DNA như RFLP, ISSR và AFLP được sử dụng để đánh giá mức độ đa dạng di truyền. Những chỉ thị này cho phép phát hiện sự khác biệt di truyền giữa các mẫu nghiên cứu.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền chi Ancistrocladus

Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền chi Ancistrocladus không chỉ có giá trị trong việc bảo tồn nguồn gen mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển dược liệu. Các hợp chất chiết xuất từ chi này có tiềm năng trong y học hiện đại.

4.1. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng trong y học

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các loài trong chi Ancistrocladus chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, có thể được ứng dụng trong điều trị bệnh. Việc khai thác hợp lý các loài này sẽ góp phần bảo tồn đa dạng sinh học.

4.2. Tác động của nghiên cứu đến bảo tồn đa dạng sinh học

Nghiên cứu đa dạng di truyền chi Ancistrocladus có thể giúp nâng cao nhận thức về bảo tồn đa dạng sinh học. Việc bảo tồn các loài này không chỉ có lợi cho môi trường mà còn cho sức khỏe cộng đồng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu chi Ancistrocladus

Nghiên cứu đa dạng di truyền chi Ancistrocladus ở Việt Nam có nhiều tiềm năng phát triển. Cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn để khai thác và bảo tồn nguồn gen quý giá này.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong bảo tồn

Nghiên cứu đa dạng di truyền không chỉ giúp bảo tồn các loài mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành dược liệu tại Việt Nam.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về di truyền học và hóa học của các loài trong chi Ancistrocladus để phát hiện ra các hợp chất mới có giá trị y học.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam sở hữu nguồn tài nguyên thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài, trong đó có 3.948 loài thực vật bậc cao và nấm được ghi nhận sử dụng làm dược liệu, chiếm xấp xỉ 30% tổng số loài trong các bài thuốc cổ truyền. Trong số các loài cây thuốc quý, chi Trung quân (Ancistrocladus) thuộc họ Ancistrocladaceae thu hút sự quan tâm đặc biệt của y dược học hiện đại nhờ chứa các hợp chất alkaloid quý giá, tiêu biểu là michellamine với khả năng ức chế virus HIV ở mức độ in vivo và các hoạt chất kháng tế bào u tủy, chống oxy hóa mạnh. Tuy nhiên, tình trạng khai thác quá mức cùng sự thu hẹp sinh cảnh tự nhiên đang đẩy nhiều quần thể Trung quân đứng trước nguy cơ cạn kiệt.

Thực trạng phân loại chi Trung quân tại Việt Nam và khu vực Đông Nam Á từ trước đến nay gặp nhiều trở ngại lớn do các phương pháp hình thái học bị giới hạn bởi sự đa hình của lá và dạng dây leo có móc câu biến đổi linh hoạt theo điều kiện môi trường. Để giải quyết triệt để vấn đề này, đề tài nghiên cứu được triển khai trong giai đoạn 2014-2016 nhằm đánh giá chính xác mức độ đa dạng di truyền và định danh loài cho 12 mẫu Trung quân thu thập đại diện từ 6 tỉnh thành trải dài khắp 3 miền Bắc, Trung, Nam. Nghiên cứu sử dụng 2 chỉ thị phân tử chuẩn hóa gồm đoạn ITS từ hệ gen nhân và gen MatK từ hệ gen lục lạp. Đóng góp nổi bật của luận văn là đã chuẩn hóa quy trình phân tích phân tử từ 50mg mô lá, định danh chính xác 100% mẫu nghiên cứu ở cấp độ loài và làm sáng tỏ cấu trúc phân hóa quần thể theo địa lý, tạo tiền đề khoa học vững chắc cho công tác bảo tồn nguồn gen và khai thác dược liệu bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết tiến hóa phân tử và hệ thống phân loại thực vật APG II (Angiosperm Phylogeny Group II), khẳng định vị trí phân loại của họ Ancistrocladaceae trong bộ Cẩm chướng (Caryophyllales). Khung phân tích sử dụng mô hình khoảng cách tiến hóa Kimura 2-Parameter kết hợp thuật toán Neighbor-Joining (NJ) của Saitou và Nei nhằm tái hiện chính xác mối quan hệ phát sinh loài.

Bốn khái niệm khoa học cốt lõi được vận hành xuyên suốt đề tài bao gồm:

• Hệ gen nhân (Nuclear genome): Nơi chứa vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) với độ dài chuẩn khoảng 655-750 bp, có tốc độ tiến hóa nhanh và tính đa hình cao, lý tưởng để phân biệt các đơn vị dưới loài.
• Hệ gen lục lạp (Chloroplast genome): Nơi định vị gen MatK (Maturase K) dài khoảng 1280-1500 bp, mang tính bảo thủ cao và tần số đột biến thấp, phù hợp cho xác định quan hệ tiến hóa cấp chi và họ.
• Chỉ thị mã vạch DNA (DNA Barcoding): Công cụ phân tử chuẩn hóa dựa trên các đoạn trình tự nucleotide ngắn để định danh sinh vật độc lập với giai đoạn sinh trưởng.
• Giá trị kiểm định Bootstrap: Phép thử thống kê với 1000 lần lặp nhằm định lượng độ tin cậy của các nhánh trên cây phát sinh chủng loại.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành trên cỡ mẫu gồm 12 mẫu lá Trung quân được thu thập và xác định tiêu bản bởi chuyên gia thực vật học của Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam. Phương pháp chọn mẫu phân tầng theo địa lý sinh thái được áp dụng tại các vùng sinh thái trọng điểm: Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Nha Trang (Khánh Hòa) và đảo Phú Quốc (Kiên Giang).

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích kết hợp chỉ thị nhân ITS và chỉ thị lục lạp MatK là nhằm tạo ra cơ chế đối chiếu chéo đa chiều, khắc phục hoàn toàn hiện tượng lai tự nhiên hoặc phân ly dòng mẹ vốn thường làm sai lệch kết quả khi chỉ dùng một chỉ thị đơn lẻ.

Về quy trình thực nghiệm:

• Mẫu lá tươi được bảo quản trong túi zip chứa hạt hút ẩm silicagel, sau đó nghiền 50mg mô lá trong nitơ lỏng và chiết tách DNA tổng số bằng dung dịch đệm CTAB 4% cải tiến theo Doyle & Doyle (1990).
• Phản ứng nhân gen PCR được tối ưu hóa trong thể tích 25 µl sử dụng cặp mồi chuyên biệt MatKF/MatKR (nhiệt độ gắn mồi 50°C) và ITS1/ITS4 (nhiệt độ gắn mồi 60°C) cùng enzyme DreamTaq DNA Polymerase qua 30 chu kỳ nhiệt.
• Sản phẩm PCR tinh sạch bằng kit Wizard SV Gel được gắn dòng vào vector pTZ57R/T và biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli DH5α.
• Các dòng tái tổ hợp mang plasmid dương tính (khuẩn lạc trắng trên môi trường X-gal/IPTG/Ampicillin) được giải trình tự Sanger 2 chiều tại Singapore và xử lý dữ liệu qua phần mềm BioEdit và MEGA 3.1 trong giai đoạn nghiên cứu 2014-2016.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm và sinh tin học đã mang lại 3 phát hiện khoa học quan trọng:

Thứ nhất, quy trình tách chiết và nhân bản phân tử đạt hiệu quả tuyệt đối với 100% mẫu (12/12 mẫu) cho vạch DNA tổng số sắc nét và sản phẩm PCR tinh sạch không xuất hiện băng phụ. Đoạn gen MatK được nhân bản chính xác ở kích thước xấp xỉ 1280 bp và đoạn ITS đạt kích thước chuẩn 750 bp.

Thứ hai, toàn bộ 12 mẫu Trung quân thu thập từ Bắc, Trung, Nam đều được định danh chính xác thuộc loài Ancistrocladus tectorius với độ tương đồng nucleotide trên 98% (dao động từ 98.3% đến 99.9%) khi đối chiếu BLAST với dữ liệu quốc tế trên GenBank/EMBL.

Thứ ba, phân tích quan hệ di truyền đã phân chia 12 mẫu nghiên cứu thành 3 nhóm rõ rệt theo phân bố địa lý sinh thái:

• Nhóm I: Gồm 8 mẫu thuộc miền Bắc và Bắc Trung Bộ (Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Quảng Trị, Huế) với mức độ tương đồng nucleotide nội nhóm đạt từ 99.9% đến 100%, giá trị bootstrap nhánh ITS đạt trên 90%.
• Nhóm II: Gồm 3 mẫu thu tại Hòn Bà - Nha Trang thuộc Nam Trung Bộ với độ tương đồng nội nhóm tuyệt đối 100%.
• Nhóm III: Gồm 1 mẫu độc lập thu tại đảo Phú Quốc (Kiên Giang), có khoảng cách di truyền xa nhất, độ tương đồng với các mẫu miền Bắc chỉ đạt 99.5%.

Thảo luận kết quả

Sự phân hóa di truyền thành 3 nhóm địa lý sinh thái phản ánh rõ nét tác động của các rào cản tự nhiên. Dãy núi Trường Sơn đóng vai trò rào cản tự nhiên ngăn cách dòng gen giữa các quần thể phía Bắc (Nhóm I) với các quần thể duyên hải Nam Trung Bộ (Nhóm II). Đặc biệt, sự biệt lập địa lý của quần thể đảo Phú Quốc (Nhóm III) trong vịnh Thái Lan đã thúc đẩy quá trình tích lũy các đột biến điểm nucleotide đặc thù, tạo nên sự phân kỳ rõ nét nhất so với các mẫu trong đất liền (chênh lệch 0.5% trình tự nucleotide so với Nhóm I).

Kết quả này hoàn toàn tương đồng với các công bố quốc tế về chi Trung quân ở Đông Nam Á, nơi hệ số xác định di truyền đạt mức cao khoảng 0.212. Toàn bộ cấu trúc quan hệ phát sinh loài này được thể hiện trực quan thông qua cây phát sinh chủng loại Neighbor-Joining với độ tin cậy bootstrap từ 61% đến 90%, kết hợp cùng ma trận bảng khoảng cách nucleotide và hình ảnh điện di gel agarose 0.8% - 1.0%, giúp minh chứng thuyết phục về tính đồng nhất và phân hóa của nguồn gen Trung quân tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng di truyền học phân tử thu được, 4 giải pháp cụ thể được đề xuất nhằm bảo tồn và khai thác bền vững chi Trung quân:

• Thiết lập khu vực bảo tồn nguồn gen ưu tiên: Cục Kiểm lâm phối hợp với Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tiến hành khoanh vùng bảo vệ nghiêm ngặt 100% diện tích phân bố tự nhiên của quần thể Trung quân đặc hữu tại Khu bảo tồn thiên nhiên Hòn Bà (Khánh Hòa) và Vườn quốc gia Phú Quốc (Kiên Giang) trước quý IV năm 2028.
• Mở rộng quy mô điều tra di truyền quần thể: Các viện nghiên cứu lâm nghiệp và trường đại học chuyên ngành triển khai lấy mẫu mở rộng với quy mô tối thiểu 50 cá thể trên 10 tỉnh thành trong giai đoạn 2027-2030, nhằm đánh giá chi tiết tần số alen và mức độ đa dạng nội quần thể.
• Giải mã toàn bộ hệ gen lục lạp: Nhóm nghiên cứu sinh học phân tử ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) để giải mã trọn vẹn bộ gen lục lạp dài khoảng 150 kb của loài Ancistrocladus tectorius, nâng cao độ phân giải phân loại đạt độ tin cậy trên 99.9% vào năm 2029.
• Ban hành quy chuẩn mã vạch DNA trong kiểm nghiệm: Bộ Y tế và Viện Dược liệu xây dựng bộ kit mã vạch DNA dựa trên 2 chỉ thị ITS và MatK để kiểm soát 100% nguồn dược liệu Trung quân lưu thông trên thị trường, ngăn chặn triệt để tình trạng nhầm lẫn loài trước năm 2028.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo học thuật chuyên sâu và ứng dụng thực tiễn giá trị cho 4 nhóm đối tượng:

• Nhà nghiên cứu thực vật học và sinh học phân tử: Tiếp cận quy trình chuẩn hóa chiết tách DNA từ 50mg mô lá chứa nhiều hợp chất thứ sinh phức tạp, đồng thời sử dụng hệ mồi chuẩn MatK và ITS cho các nghiên cứu phát sinh chủng loại thực vật nhiệt đới.
• Doanh nghiệp và chuyên gia phát triển dược liệu: Ứng dụng phương pháp mã vạch DNA để định danh chính xác 100% nguồn nguyên liệu đầu vào, bảo đảm hàm lượng các hoạt chất alkaloid quý phục vụ sản xuất thuốc chống suy giảm miễn dịch và kháng ung thư.
• Cơ quan quản lý tài nguyên và bảo tồn thiên nhiên: Sử dụng dữ liệu phân hóa di truyền giữa 3 miền để xây dựng chiến lược bảo tồn đa dạng sinh học tại các vườn quốc gia và khu dự trữ sinh quyển trọng điểm.
• Học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Di truyền học/Công nghệ sinh học: Nắm vững phương pháp luận nghiên cứu kết hợp giữa kỹ thuật sinh học phân tử thực nghiệm (PCR, cloning) và các phần mềm tin sinh học hiện đại (BioEdit, MEGA 3.1 với 1000 lần lặp bootstrap).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu cần kết hợp đồng thời chỉ thị ITS và gen MatK? Việc kết hợp 2 chỉ thị mang lại góc nhìn toàn diện: đoạn ITS từ hệ gen nhân dài 750 bp có tốc độ tiến hóa nhanh giúp phát hiện đa hình dưới cấp loài, trong khi gen MatK từ lục lạp dài 1280 bp có tính bảo thủ cao giúp xác định chính xác quan hệ cấp chi và họ, loại bỏ nguy cơ nhầm lẫn do lai chéo.

2. Khó khăn lớn nhất khi tách chiết DNA từ cây Trung quân là gì và cách khắc phục? Lá Trung quân chứa hàm lượng cao hợp chất polyphenol và polysaccharide gây ức chế phản ứng PCR. Luận văn đã khắc phục triệt để bằng phương pháp sử dụng đệm CTAB nồng độ cao 4% kết hợp nghiền 50mg mô lá trong nitơ lỏng, giúp thu nhận DNA tổng số tinh sạch đạt chuẩn cho phản ứng nhân gen.

3. Kết quả định danh 12 mẫu nghiên cứu mang lại kết luận gì về thành phần loài? Toàn bộ 12 mẫu thu thập từ 6 tỉnh đại diện 3 miền Bắc, Trung, Nam đều có độ tương đồng di truyền từ 98.3% đến 99.9% với loài Ancistrocladus tectorius công bố trên GenBank, chứng minh tính đồng nhất về loài của các quần thể Trung quân được khảo sát tại Việt Nam.

4. Sự phân hóa di truyền giữa quần thể đảo Phú Quốc và đất liền có ý nghĩa gì? Quần thể Phú Quốc có độ tương đồng thấp nhất với các mẫu miền Bắc (đạt 99.5%), hình thành một nhóm phân loại độc lập. Điều này phản ánh sự cô lập địa lý hải đảo kéo dài đã thúc đẩy tích lũy biến dị nucleotide riêng biệt, đòi hỏi phải có phương án ưu tiên bảo tồn nguồn gen độc đáo này.

5. Kiểm định Bootstrap 1000 lần lặp trong phần mềm MEGA 3.1 có vai trò gì? Kiểm định Bootstrap 1000 lần lặp tạo ra các mẫu phụ ngẫu nhiên để đánh giá độ bền vững thống kê của các nhánh phát sinh chủng loại. Giá trị bootstrap từ 61% đến trên 90% khẳng định cấu trúc phân chia 3 nhóm địa lý trong luận văn có độ tin cậy khoa học rất cao.

Kết luận

• Luận văn đã tối ưu hóa thành công quy trình tách chiết DNA tổng số và nhân bản phân tử chuẩn xác cho 2 vùng chỉ thị ITS (750 bp) và MatK (1280 bp) trên 12 mẫu cây Trung quân.
• Xác định 100% mẫu khảo sát tại 6 tỉnh thuộc 3 miền Việt Nam đều thuộc về loài Ancistrocladus tectorius với độ tương đồng nucleotide đạt trên 98% so với dữ liệu GenBank.
• Chứng minh rõ nét sự phân hóa di truyền của chi Trung quân thành 3 nhóm sinh thái tương ứng với miền Bắc - Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ và khu vực biệt lập đảo Phú Quốc.
• Cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử và quy trình mã vạch DNA đáng tin cậy phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu và thẩm định nguồn gốc giống cây thuốc quý.
• Đặt ra lộ trình nghiên cứu tiếp theo đến năm 2028 nhằm mở rộng khảo sát trên 50 cá thể và giải trình tự toàn bộ lục lạp, kêu gọi sự hợp tác chặt chẽ giữa các viện nghiên cứu và cơ quan quản lý trong việc bảo tồn khẩn cấp các quần thể Trung quân tự nhiên.