Đặt vấn đề Theo tổ chức y tế thế giới, viêm phổi là nguyên nhân chính gây tử vong ở trẻ dƣới 5 tuổi, chiếm 19% trong các nguyên nhân. Ở các nƣớc phát triển, chỉ số mắc mới của ệnh ở lứa tuổi này là 0.29 đợt ệnh/trẻ/n m. Trong các trƣờng hợp viêm phổi, 7 – 13% trẻ có d u hiệu nặng đe doạ tính mạng cần phải nhập viện. Tại Việt Nam, hàng n m vẫn có khoảng 4000 trẻ em dƣới 5 tuổi chết vì viêm phổi.
Viêm phổi ở trẻ em có thể do virus, vi khuẩn hoặc vi sinh vật khác [3]. Adenovirus ở ngƣời (HAdV) là đại diện nhóm tác nhân gây ệnh và tử vong đáng kể trên toàn thế giới và ở mọi lứa tuổi, thông qua các ệnh nhiễm trùng có khả n ng lây truyền cao tại các vị trí niêm mạc, ao gồm cả mắt và đƣờng tiết niệu, hô h p và đƣờng tiêu hóa [4]. HAdV cũng là tác nhân virus tiêu iểu gây ra hội chứng suy hô h p c p tính gây tử vong ở ngƣời lớn khỏe mạnh và đặc iệt gây tử vong ở trẻ sơ sinh và ngƣời có hệ miễn dịch ị tổn thƣơng [5-7]. Một số loại HAdV, chẳng hạn nhƣ HAdV3 và HAdV7, có thể gây ùng phát dịch ệnh với diễn iến dung hợp nhanh chóng của các mô phổi gây tình trạng viêm hô h p c p thể nặng hoặc thậm chí tử vong, nhẹ hơn là viêm hô h p c p hay hội chứng suy hô h p [8-10].
Trong số đó, các genotypes từ 1–52 đã ghi nhận đƣợc kiểu huyết thanh thông qua các xét nghiệm trung hòa huyết thanh hoặc xét nghiệm ức chế ngƣng kết hồng cầu; trong khi các genotypes 53–103 (kiểu gen) đƣợc phân loại ằng phân tích tin sinh học. Trong số các genotypes HAdV gây ệnh, các genotypes và kiểu huyết thanh riêng iệt thƣờng liên quan đến các hội chứng ệnh tật, ối cảnh dịch tễ học và các nhóm nhân khẩu học khác nhau. Việc xác định chính xác đối tƣợng 1 nhiễm và kiểu gen HAdV giúp nhanh chóng nhận dạng mối nguy trong diễn iến lâm sàng tƣơng ứng cũng nhƣ các liệu pháp điều trị phù hợp. Ở Việt Nam, việc thiếu vắng các dữ liệu liên quan đến tỷ lệ lƣu hành HAdV trong cộng đồng nói chung và ở nhóm ệnh nhân viêm phổi nói riêng vô tình hạn chế việc tiếp cận trong phát hiện và điều trị kịp thời, hiệu quả các ệnh hô h p gây ra ởi HAdV, v n đề vẫn là mối quan tâm lớn của ngành y tế.
Hiện nay, tiêu chuẩn vàng trong việc chẩn đoán HAdV là kỹ thuật nuôi c y virus, yếu điểm kỹ thuật là m t nhiều thời gian và trang ị đơn vị thí nghiệm tốn kém. Đồng thời với các đối tƣợng ệnh nhân có hệ miễn dịch yếu, tình trạng suy hô h p c p diễn ra phổ iến nhƣ là iến chứng của nhiễm trùng HAdV, một công cụ chẩn đoán ổn định, nhanh chóng là vô cùng quan trọng. Với việc sự phát triển công cụ sinh học phân tử mà tiêu iểu là kỹ thuật real-time PCR, việc tiếp cận phát hiện ệnh nhân ị xâm nhiễm HAdV hiện tại là r t dễ dàng. Xu t phát từ những c p ách trên đề tài “Phân bố genotype của Human Adenovirus ở bệnh nhi bị viêm phổi mắc phải cộng đồng” đƣợc thực hiện với mục tiêu phát hiện xâm nhiễm HAdV trong các đối tƣợng ệnh nhi mắc phải viêm phổi, đồng thời hƣớng đến phân tích trình tự di truyền để xác định kiểu gen virus từ đó ghi nhận dữ kiện tỷ lệ lƣu hành và phân ố của HAdV trên nhóm đối tƣợng này nhƣ một gợi ý y khoa trong việc chẩn đoán và điều trị.
Mục tiêu nghiên cứu Xác định tỷ lệ lƣu hành Human Adenovirus trên đối tƣợng ệnh nhi viêm phổi cộng đồng mắc phải. Xác định genotype và tần xu t phân ố genotype của HAdV nhằm giúp lâm sàng đánh giá nguy cơ diễn iến tình trạng ệnh viêm phổi mắc phải liên quan đến kiểu gen đã đƣợc áo cáo 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tƣợng mẫu: Cặp mồi và đoạn dò, hoá ch t real-time PCR Cặp mồi và đoạn dò, hoá ch t giải trình tự gen 2 Mẫu ệnh phẩm hô h p trên: quệt hầu họng Mẫu ệnh phẩm hô h p dƣới: đàm, dịch rửa phế quản – phế nang 3.2 Phạm vi nghiên cứu Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 01 n m 2019 đến tháng 03 n m 2022 Địa điểm thực nghiệm đề tài: Phòng xét nghiệm thuộc công ty TNHH Dịch vụ và Thƣơng mại Nam Khoa 4. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Xác định tỷ lệ lƣu hành HAdV trên bệnh phẩm hô hấp bệnh nhi viêm phổi cộng đồng mắc phải Thu nhận mẫu ệnh phẩm, phân loại, mã hoá thông tin mẫu Xử lý mẫu tiền ly trích Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử Thực hiện phản ứng real – time PCR định tính HAdV Thống kê tỷ lệ dƣơng tính trong quần thể 4.2 Phân bố kiểu gen HAdV trên mẫu bệnh phẩm dƣơng tính Khuếch đại trình tự đa hình trên vùng gen ảo tồn mã hoá hexon của virus Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại trên gel Agarose Tinh sạch sản phẩm PCR, thực hiện phản ứng PCR sequencing Chạy điện di mao quản ghi nhận trình tự gen khuếch đại Xác định genotype 5.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Xác định tỷ lệ nhiễm HAdV trên đối tƣợng ệnh nhi ị viêm phổi mắc phải cộng đồng. Từ đó gợi ý về nguy cơ nhiễm trùng do virus trên đối tƣợng này song song với yếu tố nhiễm khuẩn phổ iến. Giúp nhanh chóng phát hiện hoặc loại trừ nguy cơ lây nhiễm từ HAdV trên các trƣờng hợp ệnh diễn iến lâm 3 sàng không đặc trƣng. Đồng thời cung c p thông tin về dịch tễ, sự thay đổi đặc tính miễn dịch đối với HAdV trong quần thể.
Xác định tỷ lệ phân ố genotype virus giúp bác s lâm sàng trong các trƣờng hợp ghi nhận genotype virus đƣợc áo cáo là liên quan đến diễn iến lâm sàng phức tạp. Từ đó định hƣớng phát đồ điều trị nhanh chóng và hiệu quả. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Human Adenovirus (HAdVs) Adenovirus là tác nhân nhiễm trùng phổ iến ở ngƣời và nhiều loài động vật. Adeno gây ệnh trên ngƣời (human adenovirus) là một trong các virus quan trọng cả về lâm sàng và sức khoẻ cộng đồng.
Virus vừa liên quan đến hàng loạt các triệu chứng ệnh từ cảm lạnh, rối loạn tiêu hoá đến viêm hô h p c p hay viêm màng não [14] vừa là đối tƣợng nghiên cứu chuyên sâu trong việc phát triển các công cụ sinh học phân tử ở động vật có vú nhƣ vector chuyển gen trong vaccine hay các liệu pháp điều trị ung thƣ.1 Phân loài Human adenovirus (HAdVs) lần đầu tiên đƣợc xác định vào những n m đầu của thập niên 50 thế kỷ XX nhƣ là một tác nhân gây viêm đƣờng hô h p trên ở quân nhân nhập ngũ và đƣợc phát hiện thành công nên tế ào adenoid. Human adenovirus thuộc chi Mastadenovirus, họ Adenoviridae. Hiện có hơn 51 kiểu huyết thanh của HAdVs và hơn 100 kiển gen đã đƣợc mô tả, có thể phân HAdVs vào ảy loài đƣợc đặt tên từ HAdV – A đến HAdV – G dựa trên phân tích về phát sinh loài, tế ào học cũng nhƣ đặc điểm miễn dịch.1 Cấu trúc phân tử và xâm nhiễm Phân tử HAdV ao gồm một vỏ protein đa diện ao quanh lõi protein chứa ộ gen DNA mạch kép, dạng thẳng. Vỏ virus có đƣờng kính từ 70 đến 100 nm, đƣợc tạo thành từ 252 đơn vị capsomer.
12 đỉnh của khối đa diện đƣợc c u tạo ởi các đơn vị gọi là penton, gắn với mỗi đỉnh này có một tập hợp chuỗi protein liên kết dạng dây đƣợc gọi là sợi. 240 đơn vị capsomer tạo nên khối đa diện 20 mặt và các mặt này có dạng mảng lục giác. Vỏ cũng chứa một số phần tử polypeptide. Lõi virus đƣợc tạo thành từ hai protein chính (polypeptide V và polypeptide VII) và một protein giàu 5 arginine (μ).
Một protein 55 kDa đƣợc liên kết cộng hóa trị vào các đầu 5 ′ của DNA.1 C u trúc của phân tử adenovirus [2] 1.2 Cấu trúc hệ gen Bộ gen virus đƣợc chia thành các vùng chức n ng sớm (vùng E1A, E1B, E2A, E2B, E3 và E4), đƣợc iểu hiện đầu tiên trong quá trình sao chép và các vùng chức n ng muộn (vùng L1 đến L5), thƣờng đƣợc iểu hiện sau hoặc khi ắt đầu nhân đôi DNA của virus. Các gen muộn tham gia mã hóa các protein c u trúc của virus. Đoạn VA của ộ gen mã hóa cho các RNA nhỏ (VAI và VAII RNA) dài khoảng 160 nucleotide, không đƣợc dịch mã nhƣng điều chỉnh quá trình dịch mã của các mRNA của virus. Các VA RNA đƣợc phiên mã ởi RNA polymerase III của sinh vật nhân chuẩn.
Bộ gen cũng mã hóa trình tự RNA dẫn đầu đƣợc nối với t t cả các mRNA muộn của virus. N m 1977, quá trình gắn nối RNA đƣợc phát hiện trong các tế ào ị nhiễm HAdV. Các đầu kết thúc của phân tử DNA mang các trình tự lặp lại đảo ngƣợc để các sợi đơn ị iến tính có thể tạo thành các c u trúc kẹp tóc.2 Sắp xếp hệ gen virus Adeno [15] 1.3 Cơ chế xâm nhập Các tế ào chủ khác nhau cho phép sự xâm nhập của virus ở các mức độ khác nhau. Trong đó có các dòng tế ào cho phép sự xâm nhập, nhân lên hoàn chỉnh của virus.
Ở dòng tế ào này, virions đƣợc giải phóng và giết chết tế ào chủ (permissive cells). Một số khác chỉ cho phép sự nhân lên ở hiệu su t th p và phần còn lại có cơ chế ng n cản sự xâm nhiễm. Trong một số trƣờng hợp để né tránh việc từ chối xâm nhập, một phần hoặc toàn ộ gen virus có thể chèn vào DNA vật chủ, tạo ra thể nhiễm tiềm ẩn cũng là yếu tố phát sinh ung thƣ. Quá trình xâm nhập của virus ắt đầu ằng việc gắn kết các sợi c u trúc với các thụ thể đặc hiệu, tiếp theo sau đó là sự tƣơng tác của đơn vị penton với màng tế ào tạo thành thể trung gian nhập ào ao ọc virus.
Dƣới điều kiện pH acid lớp vỏ này đƣợc tháo ra và DNA virus đƣợc chuyển đến nhân tế ào chủ. Quá trình di chuyển từ tế ào ch t đến nhân của c u trúc nucleocapsid đƣợc giúp đỡ ởi các vi sợi.