Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen ssiv mã hóa enzyme starch synthase, tăng cường sinh tổng hợp tinh bột.

• Tác giả: Nguyễn Mậu Hưng
• Người hướng dẫn: Ts. Phạm Bích Ngọc
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• Mục đích nghiên cứu
• Nội dung nghiên cứu
• Ý nghĩa khoa học
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột
• 1.1.1. Giới thiệu về tinh bột
• 1.1.2. Cấu trúc của tinh bột
• 1.2. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT
• 1.3. HÌNH DẠNG TINH BỘT
• 1.3.1. Các loại hạt tinh bột hay gặp
• 1.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan
• 1.3.3. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh bột
• 1.3.4. Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam
• 1.3.5. Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất protein tái tổ hợp
• 1.3.6. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật
• 1.3.7. Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật
• 1.3.8. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
• 2.2. Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV
• 2.3.2. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140
• 2.3.3. Phản ứng RT-PCR
• 2.3.4. Tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO
• 2.3.5. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phương pháp PCR từ khuẩn lạc
• 2.3.6. Tách chiết plasmid
• 2.3.7. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu được với các trình tự tương ứng trên GenBank
• 2.3.8. Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway
• 2.3.9. Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
• 2.3.10. Phương pháp đánh giá mô chuyển gen trên môi trường chọn lọc
• 2.3.11. Phương pháp xử lí số liệu
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase ở sắn
• 3.2. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140
• 3.3. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp cDNA
• 3.4. Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV của sắn
• 3.5. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV và tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tương ứng
• 3.6. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật Gateway
• 3.7. Tạo chủng vi khuẩn mang cấu trúc vector chuyển gen đã thiết kế
• 3.8. Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV
• 3.9. Phân tích các dòng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật PCR
• 3.10. Phân tích cây chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật RT-PCR
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• Tài Liệu Tham Khảo
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen SSIV

Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen SSIV nhằm tăng cường tổng hợp tinh bột là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Tinh bột là nguồn carbohydrate chính trong thực vật, có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng và công nghiệp. Việc tối ưu hóa quá trình tổng hợp tinh bột thông qua việc sử dụng vector chuyển gen sẽ giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

1.1. Tinh bột và vai trò của nó trong đời sống

Tinh bột là nguồn năng lượng chính cho con người và động vật. Nó được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và công nghiệp. Việc hiểu rõ về cấu trúc và chức năng của tinh bột sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất.

1.2. Công nghệ sinh học và ứng dụng trong nghiên cứu

Công nghệ sinh học đã mở ra nhiều hướng đi mới trong việc cải thiện giống cây trồng. Việc sử dụng vector chuyển gen giúp tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột, từ đó nâng cao năng suất cây trồng.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu tổng hợp tinh bột

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc tăng cường tổng hợp tinh bột. Các yếu tố như điều kiện môi trường, giống cây trồng và phương pháp chuyển gen đều ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Việc tìm ra giải pháp cho những vấn đề này là rất cần thiết.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp tinh bột

Nhiều yếu tố như ánh sáng, độ ẩm và dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp tinh bột. Việc nghiên cứu các yếu tố này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất.

2.2. Thách thức trong việc chuyển gen vào cây trồng

Quá trình chuyển gen vào cây trồng gặp nhiều khó khăn như tỷ lệ thành công thấp và khả năng biểu hiện gen không ổn định. Cần có các phương pháp cải tiến để nâng cao hiệu quả chuyển gen.

III. Phương pháp nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen SSIV

Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc phân lập gen SSIV, thiết kế vector chuyển gen và đánh giá hiệu quả của gen trong các dòng rễ tơ khoai lang. Sử dụng kỹ thuật Gateway để thiết kế vector là một trong những bước quan trọng trong nghiên cứu này.

3.1. Phân lập gen SSIV từ giống sắn

Quá trình phân lập gen SSIV từ giống sắn KM140 giúp cung cấp nguồn gen cần thiết cho việc thiết kế vector. Việc này đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong nghiên cứu.

3.2. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D

Vector pK7WG2D được thiết kế để mang gen SSIV, giúp tối ưu hóa quá trình chuyển gen vào cây trồng. Kỹ thuật này cho phép kiểm soát tốt hơn quá trình biểu hiện gen.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng vector chuyển gen SSIV đã nâng cao khả năng tổng hợp tinh bột trong các dòng rễ tơ khoai lang. Các ứng dụng thực tiễn từ nghiên cứu này có thể giúp cải thiện năng suất cây trồng và chất lượng sản phẩm nông nghiệp.

4.1. Đánh giá hiệu quả của gen SSIV

Các dòng rễ tơ khoai lang mang gen SSIV cho thấy sự gia tăng đáng kể trong khả năng tổng hợp tinh bột. Điều này mở ra hướng đi mới cho việc cải thiện giống cây trồng.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Nghiên cứu này có thể được áp dụng trong sản xuất nông nghiệp để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc cải thiện giống cây trồng sẽ giúp đáp ứng nhu cầu thực phẩm ngày càng tăng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen SSIV là một bước tiến quan trọng trong công nghệ sinh học. Kết quả đạt được không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng mới trong lĩnh vực nông nghiệp.

5.1. Tương lai của nghiên cứu về tinh bột

Nghiên cứu về tinh bột sẽ tiếp tục được mở rộng với nhiều phương pháp mới. Việc ứng dụng công nghệ sinh học trong cải thiện giống cây trồng sẽ là xu hướng tất yếu.

5.2. Định hướng phát triển công nghệ sinh học

Công nghệ sinh học sẽ tiếp tục phát triển mạnh mẽ, mở ra nhiều cơ hội mới cho nghiên cứu và ứng dụng trong nông nghiệp. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất sẽ là mục tiêu hàng đầu.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhu cầu sử dụng tinh bột trên toàn cầu hiện đạt khoảng 60 triệu tấn mỗi năm, phục vụ đa dạng các ngành công nghiệp từ chế biến thực phẩm, dệt may, sản xuất giấy cho đến năng lượng sinh học. Tại Việt Nam, cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là một trong những cây lương thực chủ lực với định hướng diện tích canh tác duy trì khoảng 500.000 ha và năng suất mục tiêu 17,8 tấn/ha (tương đương 178 tạ/ha), cung cấp sản lượng hàng năm xấp xỉ 8,9 triệu tấn. Mặc dù giống sắn lai KM140 sở hữu nhiều ưu điểm vượt trội với hàm lượng tinh bột đạt khoảng 28% và tỷ lệ chất khô từ 38% đến 40%, việc nâng cao hàm lượng tinh bột thông qua phương pháp lai hữu tính truyền thống gặp nhiều rào cản do đặc tính hiếm khi ra hoa và tỷ lệ đậu hạt thấp.

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, nghiên cứu của học viên Nguyễn Mậu Hưng thực hiện tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật phối hợp cùng Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tập trung vào con đường sinh tổng hợp tinh bột ở cấp độ phân tử. Mục tiêu trọng tâm của đề tài là phân lập thành công gen Starch Synthase IV (SSIV) từ giống sắn KM140, thiết kế vector biểu hiện thực vật tái tổ hợp và đánh giá hoạt động phiên mã của gen trong mô hình rễ tơ khoai lang. Đề tài mở ra hướng tiếp cận mới trong việc ứng dụng công nghệ sinh học phân tử để chủ động điều hòa và gia tăng hiệu suất chuyển hóa carbohydrate ở cây lấy củ tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở thực vật bậc cao diễn ra chủ yếu trong lục lạp và thể vô sắc, bao gồm ba bước cơ bản: vận chuyển glucose-6-phosphate vào thể lạp, tổng hợp ADP-glucose (ADPG) dưới sự xúc tác của enzyme ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase), và polyme hóa phân tử glucan nhờ hệ enzyme starch synthase (SS). Hệ enzyme starch synthase được phân chia thành 5 nhóm chính: Granule-Bound Starch Synthase (GBSS) chịu trách nhiệm tổng hợp mạch thẳng amylose, cùng các nhóm enzyme hòa tan gồm SSI, SSII, SSIII và SSIV xúc tác tạo mạch nhánh amylopectin. Trong đó, enzyme SSIV đóng vai trò mấu chốt ở giai đoạn khởi tạo hạt tinh bột và kéo dài các chuỗi glucan ban đầu.

Cơ chế tạo rễ tơ dựa trên sự tương tác giữa vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes và tế bào thực vật. Khi xâm nhiễm, đoạn T-DNA nằm giữa biên trái (TL-DNA) và biên phải (TR-DNA) trên Ri-plasmid (kích thước 200-800 kb) sẽ tích hợp bền vững vào hệ gen vật chủ. Vùng TL-DNA mang các locus quan trọng gồm rolA, rolB, rolC và rolD, trong đó gen rolB giữ vai trò quyết định cảm ứng phân chia tế bào và kích thích tạo rễ tơ sinh trưởng nhanh mà không phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh. Kỹ thuật Gateway dựa trên cơ chế tái tổ hợp đặc hiệu vị trí giữa các đoạn attL và attR được ứng dụng để chuyển gen đích từ entry vector vào destination vector một cách chính xác mà không cần dùng enzyme cắt giới hạn.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu gồm củ sắn giống KM140 thu thập tại Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc và cây khoai lang in vitro giống KB1. Cỡ mẫu nghiên cứu được thiết kế với tổng số 216 mảnh lá và 216 đoạn thân khoai lang 3 tuần tuổi, chia đều qua 3 lô thí nghiệm độc lập nhằm đảm bảo tính lặp lại thống kê. Phương pháp chọn mẫu chủ đích được áp dụng để lựa chọn các mô thực vật có hoạt tính phân chia tế bào mạnh nhất.

Quy trình phân tích phân tử bắt đầu từ việc tách chiết RNA tổng số bằng bộ hóa chất PureLink Plant RNA Reagent, sau đó tổng hợp cDNA sợi đơn bằng enzyme M-MuLV Reverse Transcriptase ở 42°C trong 60 phút. Gen SSIV được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu SSIV_F/SSIV_R cùng enzyme Pfu DNA polymerase có hoạt tính sửa sai cao. Đoạn gen sau khi tinh sạch được tạo dòng vào vector pENTR/D-TOPO thông qua phản ứng TOPO cloning ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, tiếp tục chuyển sang vector đích pK7WG2D bằng phản ứng tái tổ hợp LR với bộ kit LR Clonase II trong 90 phút ở 25°C. Cấu trúc pK7WG2D/SSIV được biến nạp vào tế bào vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes K599 bằng xung điện (điện thế 2,5 kV, điện dung 25 µF, điện trở 400 Ω). Quá trình sàng lọc rễ tơ chuyển gen được thực hiện trên môi trường khoáng MS bổ sung 30-50 mg/L Kanamycin và 500 mg/L Cefotaxime. Dữ liệu trình tự gen được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng Lasergene 7, BioEdit 7 và công cụ BLAST.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã phân lập thành công đoạn trình tự mã hóa (CDS) của gen SSIV từ giống sắn KM140. Sản phẩm PCR khuếch đại đạt kích thước chính xác 3.189 bp, mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 1.063 axit amin. Kết quả so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu Phytozome (mã định danh cassava4.1_000719m) cho thấy độ tương đồng đạt tới 99%, khẳng định tính chính xác của gen mục tiêu. Trình tự này đã được chuẩn bị đăng ký trên Ngân hàng GenBank với mã số KT033500.

Trong bước thiết kế vector chuyển gen, phản ứng tái tổ hợp Gateway LR đã tích hợp thành công gen SSIV vào vector pK7WG2D. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI trên gel agarose 0,8% hiển thị đúng 3 phân đoạn DNA có kích thước theo lý thuyết lần lượt là 10.661 bp, 2.201 bp và 1.486 bp. Phản ứng Colony-PCR với cặp mồi SSIV-Frag_F/R cũng cho thấy phân đoạn đặc hiệu khoảng 960 bp trên chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes K599.

Quá trình chuyển gen vào mô khoai lang KB1 mang lại kết quả rõ rệt sau 20 đến 30 ngày nuôi cấy trên môi trường chọn lọc chứa 30 mg/L Kanamycin. Sau 3 đợt thí nghiệm trên tổng số 432 mẫu mô, nhóm nghiên cứu đã thu nhận được 47 dòng rễ tơ sống sót và phát triển mạnh. Tỷ lệ tạo rễ tơ trung bình ở mẫu mảnh lá đạt 24,43% (28/216 mẫu), cao hơn đáng kể so với mẫu đoạn thân đạt 18,98% (19/216 mẫu), tương đương mức chênh lệch 5,45%. Phân tích quang phổ cho thấy DNA tổng số từ 47 dòng rễ tơ đạt độ tinh sạch cao với tỷ số A260/A280 dao động từ 1,8 đến 2,0. Phân tích RT-PCR khẳng định gen chuyển SSIV hoạt động phiên mã ổn định trong các dòng rễ tơ khoai lang.

Thảo luận kết quả

Sự vượt trội về tỷ lệ cảm ứng rễ tơ ở mô lá (24,43%) so với đoạn thân (18,98%) phản ánh khả năng tiếp nhận T-DNA và đáp ứng tạo mô phân sinh bất định tốt hơn tại các vết cắt gân lá. Khi mô lá bị tổn thương, các hợp chất phenol tự nhiên như acetosyringone tiết ra nhiều hơn, kích hoạt mạnh mẽ các locus thuộc vùng vir trên Ri-plasmid, từ đó nâng cao tần số chuyển gen vào nhân tế bào. Mức hiệu suất này phù hợp với các mô hình chuyển gen trên cây hai lá mầm, mặc dù thấp hơn mức 54% đến 90% ở cây họ đậu do tính chất mô học đặc thù của khoai lang.

Để trực quan hóa các dữ liệu thực nghiệm, kết quả nghiên cứu có thể được thể hiện thông qua biểu đồ cột so sánh hiệu suất tạo rễ giữa các loại mô thực vật và bảng đối chiếu kích thước các phân đoạn cắt giới hạn EcoRI. Biểu đồ điện di đồ RT-PCR cung cấp bằng chứng rõ ràng về mức độ tích lũy mRNA của gen SSIV so với gen nội chuẩn actin, chứng minh rằng cấu trúc vector pK7WG2D/SSIV hoàn toàn tương thích và biểu hiện chức năng tốt trong mô thực vật chủ.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện quy trình công nghệ và đưa các kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn sản xuất, luận văn đề xuất 4 nhóm giải pháp chiến lược sau:

Thứ nhất, tối ưu hóa quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ các dòng rễ tơ mang gen SSIV. Viện Công nghệ Sinh học và các đơn vị nghiên cứu chuyên ngành cần tập trung cải tiến hệ thống môi trường dinh dưỡng bổ sung phytohormone, đặt mục tiêu nâng tỷ lệ tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh đạt trên 15% đến 20% trong khung thời gian 12 đến 24 tháng tới.

Thứ hai, tiến hành phân tích định lượng hàm lượng tinh bột tổng số và cấu trúc tỷ lệ amylose/amylopectin trong các cơ quan tích lũy. Nhóm nghiên cứu hóa sinh thực vật cần triển khai các phép đo sắc ký và đo quang phổ trong vòng 6 đến 12 tháng, hướng tới mục tiêu đánh giá mức độ tăng trưởng hàm lượng tinh bột từ 15% đến 30% so với đối chứng không chuyển gen.

Thứ ba, phát triển hệ thống bioreactor nuôi cấy rễ tơ quy mô bán công nghiệp 5 đến 10 lít. Các cơ sở nghiên cứu công nghệ tế bào thực vật cần thiết lập thông số sục khí và nồng độ dinh dưỡng để tăng sinh khối rễ tơ gấp 3 đến 5 lần sau chu kỳ nuôi cấy 30 ngày, phục vụ tách chiết enzyme tái tổ hợp và nghiên cứu trao đổi chất liên tục.

Thứ tư, hoàn thiện hồ sơ đăng ký sở hữu trí tuệ và chuẩn hóa quy trình đánh giá an toàn sinh học. Ban quản lý nhiệm vụ khoa học và nhóm tác giả cần hoàn tất việc cập nhật mã số chính thức KT033500 trên cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI và xây dựng hướng dẫn kỹ thuật khảo nghiệm cây trồng biến đổi gen trong thời hạn 6 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và phương pháp tiếp cận của luận văn mang lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, Di truyền học và Công nghệ sinh học: Tài liệu cung cấp quy trình chuẩn mực về kỹ thuật tạo dòng Gateway, thiết kế vector nhị thể và phương pháp định lượng biểu hiện gen bằng RT-PCR để áp dụng vào các đề tài nghiên cứu tương tự.

2. Các nhà khoa học và chuyên gia chọn tạo giống cây trồng: Cung cấp nguồn dữ liệu phân tử giá trị về gen SSIV của cây sắn KM140, hỗ trợ quá trình nghiên cứu cải thiện tính trạng năng suất và tích lũy carbohydrate trên các giống cây lấy củ nhiệt đới.

3. Kỹ thuật viên tại các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và chuyển gen thực vật: Tài liệu đóng vai trò như một cẩm nang thao tác chi tiết về kỹ thuật chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes K599, cách xử lý mô sẹo và tối ưu hóa nồng độ kháng sinh chọn lọc Kanamycin và Cefotaxime.

4. Doanh nghiệp và nhà đầu tư trong ngành chế biến tinh bột và năng lượng sinh học: Tài liệu giúp định hình tiềm năng phát triển nguồn nguyên liệu sắn và khoai lang biến đổi gen có hàm lượng tinh bột cao, phục vụ công nghiệp sản xuất cồn sinh học và thực phẩm chế biến sâu.

Câu hỏi thường gặp

1. Enzyme Starch Synthase IV (SSIV) có vai trò như thế nào trong quá trình tổng hợp tinh bột? Enzyme SSIV đóng vai trò tiên quyết trong việc khởi tạo sự hình thành hạt tinh bột mới trong lục lạp và tham gia kéo dài chuỗi glucan mạch nhánh amylopectin. Trong nghiên cứu này, việc phân lập gen SSIV kích thước 3.189 bp từ giống sắn KM140 tạo tiền đề để tăng cường hoạt tính tổng hợp tinh bột trong cơ quan dự trữ của cây lấy củ.

2. Tại sao nghiên cứu lại lựa chọn công nghệ Gateway để thiết kế vector pK7WG2D/SSIV? Kỹ thuật Gateway cho phép chuyển gen đích từ vector pENTR/D-TOPO sang vector biểu hiện pK7WG2D chỉ qua một phản ứng tái tổ hợp vị trí đặc hiệu LR trong 90 phút ở 25°C. Phương pháp này đảm bảo gen SSIV được tích hợp đúng chiều và đúng khung đọc mã hóa mà không phụ thuộc vào các vị trí cắt của enzyme giới hạn.

3. Vì sao tỷ lệ tạo rễ tơ ở mẫu mảnh lá lại cao hơn so với mẫu đoạn thân khoai lang? Mảnh lá 3 tuần tuổi có mật độ tế bào phân sinh cao và giải phóng lượng hợp chất cảm ứng dồi dào hơn tại các vết cắt gân lá khi bị vi khuẩn xâm nhiễm. Dữ liệu thực nghiệm chứng minh tỷ lệ tạo rễ tơ ở mảnh lá đạt 24,43%, cao hơn mức 18,98% ở đoạn thân, cho thấy lá là nguồn vật liệu tối ưu hơn.

4. Phương pháp nào đã được sử dụng để chứng minh gen SSIV hoạt động trong rễ tơ? Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trên nền RNA tổng số tinh sạch với độ tinh sạch A260/A280 đạt từ 1,8 đến 2,0. Sự xuất hiện của băng sản phẩm phiên mã đặc hiệu của gen SSIV song song với gen đối chứng nội sinh actin khẳng định gen chuyển đã biểu hiện chức năng ổn định ở mức độ phân tử.

5. Ưu điểm nổi bật của hệ thống rễ tơ Agrobacterium rhizogenes so với nuôi cấy mô sẹo là gì? Hệ thống rễ tơ có tính ổn định di truyền cao, phân nhánh mạnh và sinh trưởng nhanh trên môi trường khoáng cơ bản mà không cần bổ sung hormone sinh trưởng đắt tiền. Điều này giúp loại bỏ dư lượng chất điều hòa sinh trưởng và cung cấp mô hình lý tưởng để đánh giá nhanh chức năng của gen chuyển trong thời gian 20 đến 30 ngày.

Kết luận

• Phân lập thành công đoạn gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase từ giống sắn KM140 với kích thước 3.189 bp, mã hóa 1.063 axit amin và đạt độ tương đồng 99% so với trình tự chuẩn trên Phytozome.
• Thiết kế hoàn chỉnh vector biểu hiện thực vật tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV bằng công nghệ Gateway LR và biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes K599.
• Thiết lập quy trình chuyển gen tạo rễ tơ trên cây khoai lang KB1, đạt tỷ lệ tạo rễ 24,43% ở mô lá và 18,98% ở mô thân trên môi trường chọn lọc chứa 30 mg/L Kanamycin.
• Xác nhận sự tích hợp bền vững và hoạt động phiên mã ổn định của gen SSIV trong 47 dòng rễ tơ chuyển gen thông qua các kỹ thuật phân tử PCR và RT-PCR.
• Kế hoạch tiếp theo trong vòng 12 đến 24 tháng tới là tái sinh cây hoàn chỉnh và phân tích hàm lượng tinh bột tích lũy trong điều kiện nhà lưới.

Công trình nghiên cứu đã tạo nền tảng khoa học vững chắc cho việc ứng dụng công nghệ gen nhằm nâng cao hàm lượng tinh bột ở cây lương thực tại Việt Nam. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp nông nghiệp công nghệ cao hãy kết nối và khai thác quy trình chuyển gen này để phát triển các giống cây trồng năng suất cao trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Tinh bột là nguồn carbohydrate dự trữ chính của cây trồng, là hợp chất cao phân tử có hàm lƣợng lớn trong tự nhiên và có ý nghĩa quan trọng đối với đời sống nhân loại. Tinh bột là chất rắn không hoà tan, có cấu trúc dạng polymer đƣợc tạo ra các monomer là glucose. Tùy thuộc vào dạng liên kết của các phân tử glucose mà tạo thành dạng mạch thẳng amylose, hoặc dạng mạch nhánh amylopectin. Tinh bột đƣợc tích lũy chủ yếu ở cơ quan củ của thực vật: củ sắn, củ khoai tây, củ khoai lang, củ rong giềng … Tinh bột có vai trò quan trọng trong đời sống, đây là nguồn cung cấp cacbonhydrat hay năng lƣợng chính cho con ngƣời.

Ngoài ra, tinh bột còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp nhƣ thực phẩm, dƣợc. Trung bình trên thế giới sử dụng tới 60 triệu tấn tinh bột hàng năm bao gồm bột mỳ, bột ngô, bột khoai tây, bột gạo, bột sắn, bột khoai lang. Hầu hết tinh bột đƣợc sử dụng cho các ngành công nghiệp chế biến nhƣ: sử dụng làm chất nền cho quá trình lên men của vi sinh vật (chủ yếu cho sản xuất mỳ chính), công nghiệp dệt vải sợi, công nghiệp giấy và nhiều ngành công nghiệp khác. Hàm lƣợng tinh bột, kích thƣớc hạt tinh bột và hàm lƣợng amylose là những tính chất quan trọng của tinh bột có ảnh hƣởng nhiều đến các sản phẩm trong các ngành công nghiệp thực phẩm (mì sợi, bánh bì và bánh cookies) và phi thực phẩm (dệt, giấy, và dƣợc phẩm).

Các tính chất này quyết định độ nở của bột mì và tinh bột lúa mì, đó là các chỉ số quan trọng liên quan đến các sản phẩm thực phẩm giàu tinh bột nhƣ mì sợi và mì ăn liền (McCormick et al., 1991; Konik et al., 1993; Sasaki & Matsuki 1998; Dennett et al., 2009; Salman et al. Đặc tính tinh bột chịu ảnh hƣởng của gen cũng nhƣ môi trƣờng tăng trƣởng (Rharrabti et al., 2001; Kindred et al., 2008; Weightman et al. Sự hiểu biến đổi của tính chất tinh bột đƣợc quyết định bởi hai yếu tố là giống và điều kiện môi trƣờng xung quanh. Cùng một điều kiện, tính chất tinh bột có thể thay đổi ở các giống khác nhau.

Tƣơng tự, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng cùng một giống trồng ở môi trƣờng khác nhau tính chất tinh bột cũng thay đổi, từ đó sẽ gây khó khăn cho các nhà dinh dƣỡng và nhà chế biến thực phẩm trong việc dự đoán thành phần hóa học và quá trình chế biến. Các nghiên cứu về chọn lọc các giống cho hàm lƣợng tốt đã và đang đƣợc đẩy mạnh nghiên cứu. Tuy nhiên, hầu hết chỉ dừng lại ở mức độ chọn lọc giống cho chất lƣợng tinh bột tốt và ổn định. Các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động của gen liên quan đến các giống tại Việt Nam đang còn ít và chƣa cụ thể.

Xuất phát từ thực tiễn đó, cùng với sự phát triển công nghệ và các nghiên cứu lâu năm của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, nhóm nghiên cứu tiến hành tập trung đánh giá cụ thể hoạt động của gen Starch Synthase IV. Đây là một trong 5 gen quyết định lớn đến sinh tổng hợp và cấu trúc của tinh bột. Để có đƣợc Starch Synthase IV cũng nhƣ đánh giá gen này chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột”. Mục đích nghiên cứu Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase, đồng thời bƣớc đầu đánh giá hoạt động của gen này đến khả năng tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột ở các dòng rễ tơ khoai lang.

Mục tiêu cụ thể: - Phân lập và thiết kế vector mang gen SSIV phục vụ cho mục đich chuyển gen vào cây khoai lang. - Tối ƣu hóa đƣợc quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes và tạo đƣợc các dòng rễ tơ. - Bƣớc đầu đánh giá khả năng hoạt động của gen trong các dòng rễ tơ khoai lang ở mức độ phiên mã 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu phân lập gen SSIV từ giống sắn KM140.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng - Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D mang gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway. - Tạo chủng Agrobacterium rhizogenes mang cấu trúc vector pK7WG2D/SSIV. - Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen và đánh giá hoạt động của gen SSIV trong các dòng rễ tơ khoai lang ở mức độ phiên mã. Ý nghĩa khoa học Làm cơ sở cho việc đánh giá hoạt động của các gen chức năng liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột ở các cây lƣơng thực tại Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột 1. Giới thiệu về tinh bột Tinh bột là một glucan không tan, đƣợc cấu thành từ hai chuỗi polymer (amylopectin và amylase) đƣợc cấu thành từ các tiểu phần là glucose.

Ở thực vật bậc cao, tinh bột đƣợc tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào quang hợp và không quang hợp. Là carbohydrate dự trữ chủ yếu, tinh bột đóng vai trò quan trọng trong suốt chu kỳ sống của thực vật. Trong lá, một phần nhỏ carbon đồng hóa thông qua quang hợp đƣợc giữ lại trong các lục lạp ở dạng tinh bột chứ không đƣợc chuyển đổi thành sucrose để vận chuyển đến các bộ phận khác. Dạng tinh bột tạm thời này sẽ đƣợc phân hủy vào ban đêm để cung cấp cơ chất cho quá trình hô hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác của cây(McMaugh et al.

Tinh bột, công thức hóa học: (C6H10O5)n) là một polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amyloza và amylopectin, tỷ lệ phần trăm amilose và amilopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này thƣờng từ 20:80 đến 30:70. Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau. Chúng đều là các polymer carbohydrat phức tạp của glucose (công thức phân tử là C6H12O6). Tinh bột đƣợc thực vật tạo ra trong tự nhiên trong các quả, củ nhƣ: ngũ cốc.

Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dƣỡng của loài ngƣời cũng nhƣ nhiều loài động vật khác. Ngoài sử dụng làm thực phẩm ra, tinh bột còn đƣợc dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, rƣợu, băng bó xƣơng. Tinh bột đƣợc tách ra từ hạt nhƣ ngô và lúa mì, từ rễ và củ nhƣ sắn, khoai tây, dong là những loại tinh bột chính dùng trong công nghiệp (Evans et al. Tinh bột lƣu trữ đƣợc tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác của cây.

Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài ngƣời phần lớn là cơ quan lƣu trữ tinh bột ở thực vật. Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (gạo, ngô, lúa mì, lúa mạch, lúa miến…) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ than Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng (khoai tây, khoai lang, khoai mỡ) và rễ củ (sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu. Hầu hết tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi. Tuy nhiên nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng lên.

Đặc biệt tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học đầu tiên do đặc tính dễ lên men. Cấu trúc phân tử amylopectin Cấu trúc phân tử amylose Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose 1. Cấu trúc của tinh bột Tinh bột đƣợc cấu tạo bởi 2 loại polysaccharid đƣợc gọi là amylose và amylopectin.

Amylose: phân tử amylose là một chuỗi hiện nay đƣợc biết đến hàng nghìn đơn vị β-D-glucose nối với nhau theo dây nối (1→ 4). Quan niệm trƣớc đây cho rằng chỉ có từ 200-400 đơn vị vì do quá trình chiết xuất và phân tích, mạch bị đứt. Phân tử amylose đa số là các chuỗi thẳng rất ít phân nhánh. Amylopectin: amylopectin có phân tử lƣợng lớn hơn khoảng 106-107 gồm 5000-50.000 đơn vị glucose và phân nhánh nhiều.

Các đơn vị α-D-glucose trong mạch cũng nối với nhau theo dây nối (1→ 4) còn chỗ phân nhánh thì theo dây nối (1→ 6). Để xét mức độ phân nhánh, ngƣời ta methyl hóa toàn bộ các nhóm OH của amylopectin rồi sau đó thủy phân và suy ra từ lƣợng 2, 3 dimethylglucose. Lƣợng 2, 3, 4, 6 tetramethylglucose ứng với những đơn vị tận cùng của mạch còn lƣợng 2, 3, 6 trimethylglucose ứng với những đơn vị glucose trong mạch (Evans et al. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Mậu Hưng Ngoài ra còn có thể xác định lƣợng glucose cuối mạch dựa vào tính khử của amylopectin không methyl hóa.

Chú ý rằng ở đây là glucose ở cuối mạch có OH bán acetal tự do. Mạch bên trong (mạch giữa 2 điểm phân nhánh) của amylopectin có khoảng 5-9 đơn vị glucose, những mạch bên ngoài có từ 10-18 đơn vị. Trong các loại tinh bột, trung bình tỉ lệ amylose là 25% còn amylopectin là 75%. Tuy nhiên ngƣời ta cũng tạo ra đƣợc những chủng có nhiều amylose, ví dụ ngô, có tinh bột chứa 75% amylose.

Amylose cho với thuốc thử iod màu xanh đậm có cực đại phổ hấp thu khoảng 660nm, còn amylopectin thì có màu tím đỏ và cực đại hấp thụ khoảng 540nm. Màu tạo thành giữa tinh bột và iod đƣợc giải thích do sự hấp phụ. Ngƣời ta cho rằng iod bị hấp phụ vào phía trong hình xoắn ốc. Ứng với một vòng xoắn ốc thì có 1 phân tử iod.

Những phân tử chƣa đủ 6 đơn vị glucose thì không phản ứng với iod(Mason-Gamer, Weil, and Kellogg 1998). SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT Khi thủy phân tinh bột bằng acid thì sản phẩm cuối cùng là glucose C6H12O6 (C6H10O5)n + nH2O -> (1+n) (C6H12O6) Sự thủy phân qua các chặng: dextrin, erythrodextrin, achrodextrin, maltose, glucose. Amylose dễ bị thủy phân hơn amylopectin vì dây nối (1-> 4) dễ bị cắt hơn là dây nối (1-> 6). Thủy phân bằng enzym Enzym amylase.

Có 2 loại chính: a-amylase và β-amylase. Enzym a phổ biến trong cây, nhiều nhất là các hạt ngũ cốc nẩy mầm, ngoài ra còn có trong nấm mốc, nƣớc bọt, dịch tụy.