MỞ ĐẦU Một số loài thực vật họ Sâm (Araliaceae) nói chung, sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nói riêng – giống đặc hữu của nước ta là các loài cây dược liệu rất quý đối với nhiều nước trên thế giới đặc biệt đối với các nước châu Á như Trung Quốc, Triều Tiên, Việt Nam,.; rễ sâm chứa nhiều hợp chất có tác dụng dược lý quan trọng. Sâm Ngọc Linh đã được chứng minh ngoài tác dụng bổ dưỡng còn có nhiều tác dụng khác như kích thích hoạt động não bộ, nội tiết tố sinh dục, tạo hồng cầu, kháng khuẩn đặc hiệu với chủng Streptococcus, chống oxy hóa, chống lo âu, chống trầm cảm, bảo vệ gan, giảm cholesterol và lipid máu, hạ đường huyết, điều hòa tim mạch, điều hòa miễn dịch và phòng chống ung thư. Ngoài các nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn theo phương pháp truyền thống, hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và biến nạp gen nói riêng trong công tác giống sâm Ngọc Linh đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước đặc biệt quan tâm. Như chúng ta đã biết, ipt là gen mã hóa isopentenyl transferase - enzyme quan trọng của con đường sinh tổng hợp cytokinin ở thực vật.
Vai trò tích cực của gen ipt trong cơ thể thực vật chuyển gen thể hiện tập trung ở một số điểm như: 1/ Làm chậm sự lão hóa, tăng sinh trưởng và năng suất, tăng độ bền của lá và hoa đối với nhiều loại thực vật như Arabidopsis, thuốc lá, Petunia, bông cải, cải xà lách, cúc; 2/ Ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp - tăng hàm lượng artemisinin ở cây Thanh hao chuyển gen; 3/ Làm tăng khả năng chịu hạn khi gen ipt biến nạp được điều khiển bởi promoter đặc trưng P SARK (senescence R R associated receptor protein kinase); 4/ Có thể ứng dụng tác động của gen này như yếu tố chọn lọc in vitro – thay thế tác nhân chọn lọc khác. Với ý nghĩa nêu trên, nghiên cứu biến nạp gen ipt là vấn đề cần được quan tâm. Đến nay trên thế giới cũng như ở trong nước chưa ghi nhận được công trình công bố kết quả nghiên cứu về biến nạp gen nói chung và biến nạp gen ipt nói riêng trên đối tượng sâm Ngọc Linh. 2 Do vậy, đề tài “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen ipt (isopentenyl transferase) vào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” được đặt ra với mục đích tạo được mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen ipt bằng kỹ thuật biến nạp gen phục vụ cho mục đích nghiên cứu dài hạn về ảnh hưởng của gen chuyển ipt đến khả năng tăng sinh tổng hợp các chất thứ cấp.
Mục tiêu của đề tài Tạo được một số dòng mô sẹo sâm Ngọc Linh mang gen đích ipt qua biến nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Giới hạn của đề tài Đề tài chỉ tập trung nghiên cứu tạo ra dòng mô sẹo chuyển gen, bước đầu đánh giá sự hiện diện và biểu hiện của các gen chuyển bằng thử nghiệm định tính (thử GUS) và phương pháp sinh học phân tử (PCR). Chưa nêu nội dung phân tích hàm lượng hợp chất thứ cấp. GIỚI THIỆU CHI PANAX 1.
Đặc điểm Panax là chi thực vật có nhiều cây làm thuốc quan trọng, trong đó có họ Nhân sâm. Đến nay đã biết 14 loài được công bố trên thế giới. Vùng phân bố của chi Panax ở bắc bán cầu, từ trung tâm Hymalaya qua đông bắc Trung Quốc, vùng Viễn đông nước Nga, Triều Tiên, Nhật Bản đến Bắc Mỹ…[5], [67] Đặc biệt, ở Việt Nam năm 1973 đã phát hiện một loài Panax mọc hoang trên diện tích rộng, ở độ cao 1.000m trên dãy Trường Sơn nam, đó là loài sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), còn gọi là sâm K5, sâm Ngọc Linh. Ngoài ra, ở Việt Nam còn phát hiện loài sâm Vũ Diệp (Panax bipinatifidus) và sâm Tam Thất (Panax pseudoginseng) ở các tỉnh miền núi phía Bắc giáp Trung Quốc.
Một số nghiên cứu các cây thuộc họ Nhân sâm có đặc điểm chung sau: Về thành phần hóa học: hợp chất saponin thường được đánh giá là thành phần hoạt chất chính của những cây thuộc họ Nhân sâm và được tập trung nghiên cứu để xác định cấu trúc. Về tác dụng dược lý: các tác dụng chính của những cây thuộc họ Nhân sâm là tác dụng bổ, tăng lực, chống stress và một số tác dụng khác như giải độc gan; tác dụng trên nội tiết tố; thận; cơ, xương, khớp,… [5], [6], [45] 1. Phân bố Cho đến nay các nhà khoa học đã biết trên thế giới có khoảng 14 loài thuộc chi Panax, phân bố: [70] * Panax ginseng C. (Nhân sâm) = Panax schinseng Nees: loài hoang dại, hiện nay rất hiếm, được trồng ở Đông Bắc, châu Á.
(Sâm Mỹ): mọc hoang và được trồng ở vùng Bắc Mỹ. Feng: phân bố của loài hoang dai chưa rõ, đã được trồng ở Vân Nam, Trung Quốc. 4 * Panax pseudo-ginseng Wall. Pseudo-ginseng Hara: mọc hoang dại, rất hiếm, được tìm thấy ở phía đông dãy Himalaya.
(Panax pseudo-ginseng Wall. Japonicus (Meyer) Hara): mọc hoang dại ở Nhật Bản và miền Nam Trung Quốc. Feng (Panax pseudo-ginseng Wall var.): mọc hoang dại ở miền Nam Trung Quốc.) Chen et Chu: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc.
Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc. Feng: mọc hoang ở miền Nam Trung Quốc từ Vân Nam đến Tây Tạng và miền Bắc Việt Nam. * Panax pseudo-ginseng Wall. Himalaycus Hara: mọc hoang ở phái Đông dãy Himalaya.: gồm mẫu C (thu hái ở Chame, Nepal) và mẫu G (thu hái ở Ghorapani, Nepal): mọc hoang ở miền Trung Nepal.
* Panax vietnamensis Ha et Grushv.: mọc hoang và được trồng ở hai tỉnh Kon Tum và Quảng Ngãi. Phân loại Đã có một số nghiên cứu về thực vật của các loài thuộc chi Panax. Và gần đây nhất là hệ thống phân loại của Jun Wen (2001) thống kê 12 trong số 14 loài và dưới loài của chi Panax đã được đề cập ở trên. Hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax ở châu Á và thế giới H.
Wu et al Jun Wen (1942) (1970) (1973) (1973) (2001) P. ginseng Nees Mey. Pseudoginseng Pseudoginseng Var. Notoginseng Notoginseng Var.) Hoo et (Burk.
Chen Tseng Subsp. Wanggianus (Sun) Hoo et S. Sun Tseng Var. Angustatus (Makino) Hara Var.) Li Himalaycus (Burk.) Wu et (Burk.
Hara Feng Var. Angustifolius Angustifolius (Burk. Stipuleanatus Stipuleanatus Tsai et Feng Tsai et Feng P. Wu et Feng K.
Vietnamensis Ha et Grushv. Thành phần hóa học Saponin và polyacetylen là hai nhóm hoạt chất chính có trong chi Panax. Hợp chất saponin [1], [5], [6], [7], [79], [80] T 8 2 28T Saponin còn gọi là saponin glycoside hay saponoside do chữ Latinh “sapo” có nghĩa là xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng), là một nhóm glycoside lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Mỗi một saponin đều có hai phần: sapogenin (aglycon) và đường.
Phần sapogenin có thể là một chất steroid hay triterpenoid. Phần đường thường là glucose, galactose, pentose hay metyl pentose. Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài sâm. Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định cấu trúc của hơn 100 saponin từ các loài Panax L.
có thành phần chính là các saponin triterpenoid tetracylic nhóm dammaran, gọi chung là glycoside. Hợp chất polyacetylene [1], [6], [80], [93], [112] T 8 2 T 8 2 Polyacetylene được phát hiện trong sâm Triều Tiên và những năm 60 và phát hiện thấy có tác dụng phòng chống ung thư vào những năm 80 của thế kỷ 20. Cấu tạo của polyacetylen thường là các hydrocacbon mạch thẳng có 17 hoặc 18 carbon có gắn với các nhóm chất liên kết. Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại là chuỗi C 7 H 15.
R R R R Việc nghiên cứu những hợp chất polyacetylen trong các cây họ Nhân sâm đã cho thấy chúng thể hiện một số đặc tính sinh học như: kháng nấm, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng ngưng tập tiểu cầu, độc tế bào và kháng ung thư. Tác dụng chính của sâm Sâm Triều Tiên nói riêng và Nhân sâm nói chung có vai trò quan trọng trong dự phòng và điều trị các bệnh mãn tính như: bệnh tiểu đường, ung thư, sơ vữa động mạch, huyết khối, lipid máu, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não,… do có tác dụng tăng cường thể lực và gia tăng sức đề kháng của cơ thể. Tác dụng tăng lực, phục hồi sức [36], [89], [92] T 8 2 T 8 2 Bột chiết sâm Triều Tiên và các ginsenosid chính như G-Rg1, G-Rb1 làm thay đổi các thông số sinh hóa trong máu liên quan đến chuyển hóa năng lượng trong quá trình vận động như làm tăng hàm lượng glucose, giảm hàm lượng glycogen trong máu (do tăng dự trữ glycogen trong gan), giảm acid béo tự do, giảm hàm lượng triglyceride, giảm hàm lượng acid lactic và acid pyruvic. Điều này cho thấy bột chiết sâm Triều Tiên làm thay đổi cơ chế hằng định nội môi về năng lượng trong quá trình vận động theo chiều hướng làm gia tăng khả năng sinh hóa của cơ xương, oxy hóa acid béo tự do sản sinh năng lượng vận động thay cho glucose.
Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương Sâm Triều Tiên thể hiện tác dụng lên hệ thần kinh theo hai hướng là kích thích hoặc ức chế tùy theo thành phần ginsenosid và trạng thái bệnh lý. Takagi và cộng sự đã chứng minh rằng các saponin thuộc nhóm protopanaxadiol mà tiêu biểu là G- Rb1 hoặc hỗn hợp saoponin có G-Rb1 và G-Rc thể hiện ức chế hệ thần kinh trung ương, trong khi các saponin thuộc nhóm protopanaxatriol, tiêu biểu là G-Rg1 và những hợp chất tan trong lipid thể hiện tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, chống mệt mỏi. [36], [70], [80], [89] Sâm Mỹ còn có tác dụng điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, G-Rb1 và G-Rg1 đóng vai trò chủ yếu trong tác dụng này. Tác dụng cải thiện trí nhớ Bột chiết hồng sâm Triều Tiên có tác dụng cải thiện rõ khả năng học tập- ghi nhớ do hoạt chất G-Rg1 quyết định, nhất là những tổn thương trong hoạt năng não bộ liên quan đến tuổi già.
Tác dụng đáp ứng thích nghi và chống stress Tác dụng dược lý quan trọng của sâm Triều Tiên là duy trì sự hằng định nội môi, đưa về bình thường những trạng thái sinh lý bất thường của cơ thể do stress gây ra. G-Rg1 thuộc nhóm protopanaxatriol saponin là hoạt chất có tác dụng quyết định chống stress của sâm Triều Tiên. Cơ chế tác động chống stress có liên quan 8 đến trung khu điều hòa nhiệt độ và sự tạo thành chất hóa học trung gian histamin của vùng dưới đồi. Tác dụng chống oxy hóa và chống lão hóa Các ginsenosid thuộc nhóm panaxatriol như G-Rb1, G-Rb2 và ginsenosid thuộc nhóm panaxadiol như G-Rg1 được chứng minh là những chất có tác dụng chống oxy hóa điển hình của sâm Triều Tiên.