CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10 1.2 Tính cần thiết của đề tài 14 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 2.1 Chủng vi khuẩn 15 2. Enzyme cắt và nối tạo DNA tái tổ hợp 16 2.5 Nguyên liệu thực vật 17 2.6 Hoá chất và môi trường 17 2.7 Một số thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu 17 2. PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Cấu trúc plasmid mới 19 2.1 Chuẩn bị DNA plasmid (pCAMBIA3301) và DNA gen 19 mục tiêu (gna) cho cấu trúc vector tái tổ hợp 2.2 Phương pháp nối kết plasmid gốc pCAMBIA3301 và 21 cassette gen gna để tạo plasmid tái tổ hợp 2.2 Biến nạp vào vi khuẩn E. coli và khảo sát sự hiện diện 22 của plasmid mới 2.1 Phương pháp tạo E.
coli có khả năng biến nạp 22 2.2 Phương pháp biến nạp plasmid mới vào vi khuẩn E.3 Chọn khuẩn lạc và kiểm tra plasmid mới 23 2.3 Biến nạp plasmid mới vào Agrobacterium tumefaciens 24 chuẩn bị cho thao tác chuyển gen 2.1 Quy trình tạo vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens khả 24 biến 3 2.2 Quy trình chuyển plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium 25 tumefaciens khả biến 2.3 Sơ chọn khuẩn lạc để kiểm tra plasmid 25 2.4 Phân tích PCR để xác định sự hiện diện của gen gna 25 trong plasmid mới 2.4 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá (Nicotiana 26 tabacum L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2.1 Xác định nồng độ chọn lọc tối ưu chuẩn bị cho các thí 27 nghiệm chuyển gen 2.2 Chuyển gen vào thuốc lá nhờ vi khuẩn Agrobacterium 27 tumefaciens 2.5 Khảo sát sự hiện diện và biểu hiện của các gen được 29 chuyển ở cây thuốc lá chuyển gen 2.1 Khảo sát sự hiện diện của gen chỉ thị gusA bằng kỹ 29 thuật hóa mô 2.2 Tái kiểm tra (in vitro) sự biểu hiện của gen chọn lọc bar 29 2.3 Thử tính kháng thuốc trừ cỏ Basta của cây chuyển gen 29 ngoài vườn ươm 2.4 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar và gna bằng phân 29 tích PCR CHƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 32 3. CẤU TRÚC PLASMID MỚI 32 3. Tách chiết DNA plasmid từ hai dòng vi khuẩn E. coli 32 DH5 mang pBluescript SK+ và pCAMBIA3301.
Kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn và điện di trên gel agarose 3. Kết nối tạo plasmid tái tổ hợp và tạo dòng E. coli mang 33 plasmid mới 3.1 Kết nối tạo plasmid mới 33 4 3.2 Biến nạp và nhân bản plasmid mới trong E.3 Tách chiết plasmid mới từ E. coli được biến nạp và kiểm 34 tra sự hiện diện của gen gna trong plasmid mới 3.2 TẠO DÒNG AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 36 MANG PLASMID MỚI pCAMBIA3301GNA 3.1 Biến nạp pCAMBIA3301GNA vào A.2 Phân tích PCR gen gna của plasmid tách chiết từ dòng 37 A.
tumefaciens LBA4404 được biến nạp 3.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC 37 TRỪ CỎ VÀ CÔN TRÙNG VÀO CÂY THUỐC LÁ 3.1 Khảo sát tính chống chịu tự nhiên Phosphinothricin đối 38 với của giống thuốc lá K326 3.2 Kết quả chuyển gen bằng vi khuẩn A.3 Kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của các gen được 41 chuyển ở cây thuốc lá giả định chuyển gen 3.1 Kiểm tra sự biểu hiện gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ 42 Basta) của cây chuyển gen in vitro và ngoài vườn ươm 3.2 Sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA chuyển gen 43 3.3 Sự hiện diện của của gen bar và gna trong cây thuốc lá 44 chuyển gen bằng phân tích PCR CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 PHỤ LỤC 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 5 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT ATP : Adenosine 5’- triphosphate bar : gen kháng Phosphinothricin Bp : Base pair, cặp base Bt : Bacillus thuringiensis CAMBIA :Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture CAMV : Cauliflower Mosaic Virus CG : Chuyển gen Cry : Crystal (gen) dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid ĐC : Đối chứng EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr : Ethidium bromide GNA : Galanthus Nivalis Agglutinin gusA : Gen tạo enzyme -D-glucuronidase GUS : -D-glucuronidase (enzyme) hph : Hygromycin phosphotransferase (gen) HPH : Hygromycin phosphotransferase (enzyme) IPTG : Isopropyl thio--D-galactoside KB : Kilobase KDa : Kilodalton LB : Luria-Bertani MS : Murashige và Skoog nptII : Neomycin phosphotransferase (gen) NPT II : Neomycin phosphotransferase (enzyme) PAT : enzym phosphinothricin acetyl transferase PPT : Phosphinothricin 6 RE : Restriction enzyme RNA : Ribonucleic acid Rnase : Enzyme thủy giải RNA SDS : Sodium dodecyl sulphate PCR : Polymerase chain reaction Taq : Thermus aquaticus T-DNA : Transferred - DNA Ubi : Ubiquitin (gen) X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside X-gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 1 Kích thước Thang -Hind III 15 2 Kích thước Thang 1Kb 15 3 Tỷ lệ tái sinh chồi (cây con) từ các mẫu lá trên môi 40 trường chọn lọc Phosphinothricin DANH SÁCH HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1 Sơ đồ1: Cấu trúc plasmid pCAMBIA3301 46 2 Sô ñoà 2: Trình töï nhaän bieát vaø vò trí caét cuûa hai enzyme 46 giôùi haïn Sac I vaø Kpn I 3 Sơ đồ 3: sự tạo dòng gen mục tiêu gna vào 47 pCAMBIA3301 7 4 Sơ đồ 4: Quy trình tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng 48 thuốc trừ cỏ và côn trùng 5 Hình điện di và chọn lọc cây thuốc lá chuyển gen 48 6 Hình biểu hiện gen gus và kết quả PCR 49 8 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước Sự phát triển của công nghệ gen đang tạo ra những bước đột phá mới, đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ gen đã cho phép đưa các gen hữu dụng vào thực vật, từ đó tạo ra cây trồng thể hiện tính trạng mong muốn.
Cách đây khoảng ba thập kỷ, kể từ khi những báo cáo đầu tiên công bố sự thành công trong việc chuyển gen trên cây trồng, các phương pháp đưa gen lạ trực tiếp vào tế bào thực vật không thông qua lai hữu tính đã phát triển dần với tốc độ tiến bộ ngày một nhanh. Thuốc lá, cùng với cà chua và khoai tây là những cây trồng được sử dụng để chuyển gen Bt ngay từ năm 1987. Trong các đối tượng đó, thuốc lá là nguyên liệu tốt cho các nghiên cứu về di truyền vì người ta dễ dàng kiểm soát được sự thụ phấn của cây cũng như có thể thu được số lượng lớn hạt giống. Bên cạnh đó, thuốc lá rất thích hợp cho nuôi cấy mô và chuyển gen nhờ khả năng hơn hẳn trong việc tái sinh chồi và phân hóa thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo, tế bào huyền phù hoặc tế bào trần.
Cây trồng mang gen kháng sâu Bt (Bacillus thuringiensis) là một trong những ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc cải tiến cây trồng từ rất sớm. Cây mang gen tạo độc tố này có khả năng kháng với các sâu hại chính thuộc họ Lepidoptera, Coleoptera và Diptera. Nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam và trên thế giới đã chuyển nạp thành công gen này vào cây thuốc lá như: - Nguyễn Hữu Hổ & ctv (1998): chuyển các gen kháng sâu CryIIB, gen kháng hygromycin hpt, gen chỉ thị gusA nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. - Strizkov (1996): chuyển gen CryIC vào cây thuốc lá qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium, cùng với gen chitinase chiAII (có nguồn gốc từ Serratia marcescens) nhằm nâng cao hiệu quả của độc tố Bt do chitinase có 10 khả năng phá hủy màng chitin trong ruột côn trùng.
Kết quả gây chết 100% sâu Spodoptera exigua ở các giai đoạn phát triển khác nhau. - Kota & ctv (1999): nhận thấy gen Cry2Aa2 khi chuyển vào lục lạp của cây thuốc lá thì gây tử vong hoàn toàn cho sâu Heliothis virescens, Heliothis zea, Spodoptera exigua vốn được xác định không còn mẫn cảm với Cry1A và Cry2Aa2. Lá cây chuyển gen biểu hiện tiền độc tố Cry2Aa2 ở mức 2 - 3% protein hòa tan tổng số, cao gấp 20 đến 30 lần so với cây chuyển gen vào nhân tế bào như hiện tại. Nghiên cứu chuyển gen trong những năm gần đây đã có những bước phát triển đáng kể nhờ vào việc đưa một số gen có ý nghĩa và quan trọng trong lĩnh vực nông nghiệp vào cây trồng.
Đối với nhiều loại côn trùng thuộc Homoptera như rầy nâu hoặc các loại rầy rệp khác truyền bệnh virus cho cây trồng, người ta ghi nhận hợp chất lectin có nguồn gốc từ thực vật có khả năng gây độc đối với chúng (Powell và ctv, 1993) cũng như một số các ấu trùng thuôc họ Lepidoptera và họ Coleoptera (Shukle và Murdock, 1983; Czaph và Lang, 1990; Gatehouse và cộng sự, 1995). Nhiều nghiên cứu và thí nghiệm trên thế giới cho thấy lectin thực vật rất có hiệu quả đối với hiện tượng làm giảm sức sống, sự phát triển, sự đẻ trứng của rầy nâu (Powell và cộng sự., 1993), giảm tuổi thọ và khả năng sinh dục của rầy mềm, đặc biệt là trên con cái (Rahbe và Febvay 1993, Sauvion và cộng sự., 1996) cũng như nhiều loại rầy rệp gây hại khác. Tuy nhiên không phải tất cả lectin nào cũng diệt được côn trùng. Người ta ghi nhận có nhiều mức độ hữu hiệu khác nhau của những hợp chất lectin khác nhau trên các loài côn trùng khác nhau.
Nhóm lectin với thuật ngữ chuyên môn “snowdrop lectin” (Galantus nivalis agglutinin - GNA) có độc tính mạnh nhất (Powell và cộng sự, 1995a) và đặc biệt có độc tính đối với côn trùng nhưng không ảnh hưởng đối với các loài động vật hữu nhũ (Pusztal 1991). Protein GNA và các gen mã hóa cho nó 11 đã được xác định trong phòng thí nghiệm bởi W. Cho đến nay, cơ chế tác động của lectin GNA đối với côn trùng vẫn chưa được mô tả thật đầy đủ. Có ý kiến cho rắng protein này gắn vào mặt ngoài của màng ruột theo cơ chế nối với thụ quan (Eisemann và cộng sự, 1994)).
Những côn trùng thường có khả năng phân giải thấp protein ở ruột bởi vì chúng sử dụng amino acid tự do trong nhựa luyện như một nguồn cung cấp chất đạm cho cơ thể sống. Birch và cộng sự (1999) đã chứng minh được lectin của khoai tây chuyển nạp gen GNA được tìm thấy gắn ở các tế bào màng ruột của rầy mềm in-vivo. Lợi dụng những tính chất trên, hiện nay trên thế giới người ta đã tổng hợp nhân tạo gen gna (mã hóa cho protein trên) để chuyển nạp vào trong cây trồng. Nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã tạo được một số giống cây trồng có khả năng kháng rầy rệp chích hút rất hiệu quả, như cây lúa kháng rầy nâu (Nilaparvata lugens), rầy xanh đuôi đen (Nephotettix spp.); khoai tây kháng ấu trùng Lacanobia oleracea, rầy mềm Aulacorthum solani…, và đặc biệt là cây thuốc lá kháng côn trùng thuộc họ Aphididae, một nhóm quan trọng nhất có khả năng lây lan bệnh do vi trùng hay siêu vi trùng cho thực vật.