Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Cây bưởi (Citrus grandis (L.) Osbeck) là một trong những loại cây ăn quả có múi chủ lực tại Việt Nam, mang lại giá trị dinh dưỡng cao (cung cấp đường, protein, vitamin C, khoáng chất) cùng tiềm năng kinh tế lớn. Nhiều giống bưởi đặc sản bản địa nổi tiếng như Năm Roi, Da Xanh, Diễn, Đoan Hùng, Phúc Trạch, bưởi Đỏ Mê Linh đã được mở rộng diện tích canh tác. Tuy nhiên, sản xuất bưởi trong nước phải đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là sự tàn phá của bệnh vàng lá Greening và bệnh tàn lụi Tristeza do virus gây ra, làm suy giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng quả.
Các phương pháp nhân giống truyền thống (gieo hạt, chiết cành, ghép cành) bộc lộ nhiều hạn chế: cây mọc từ hạt lâu ra quả và dễ biến dị; cây chiết ghép nhanh thoái hóa, tuổi thọ ngắn và dễ lây truyền mầm bệnh từ cây mẹ. Việc ứng dụng công nghệ sinh học—kết hợp nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen—là giải pháp kỹ thuật hiệu quả nhằm tạo nguồn giống sạch bệnh và tiếp nhận các đặc tính nông sinh học mong muốn. Nhằm xây dựng cơ sở thực nghiệm cho công tác chuyển gen trên cây ăn quả có múi, khóa luận tập trung giải quyết mục tiêu và các nhiệm vụ nghiên cứu sau:
- Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá khả năng chuyển nạp gen chỉ thị gus và gen chọn lọc bar vào giống bưởi đỏ thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
- Nhiệm vụ/Yêu cầu nghiên cứu:
- Xác định ảnh hưởng của tuổi mẫu thân mầm in vitro đến hiệu quả biến nạp gen gus vào bưởi đỏ.
- Xác định ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm (ngâm thường so với kết hợp siêu âm và hút chân không) đến hiệu quả biến nạp gen gus.
- Xác định ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen gus.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc phosphinothricin (PPT) đến khả năng chọn lọc chồi chuyển gen mang gen bar.
- Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng: Đoạn thân mầm in vitro thu từ hạt chín của giống bưởi đỏ.
- Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2013 đến tháng 05/2014.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết và mô hình chuyển gen gián tiếp
Nghiên cứu ứng dụng cơ chế chuyển gen gián tiếp qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. Khi mô thực vật bị tổn thương, các hợp chất phenol (như acetosyringone) kích hoạt hệ thống gen gây độc (virA, virG, virB, virD, virE) trên Ti-plasmid. Phức hợp enzyme cắt chuỗi đơn T-DNA tại hai bờ biên giới (Left Border - LB và Right Border - RB), vận chuyển sợi đơn T-DNA qua màng tế bào thực vật và tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen nhân của tế bào chủ.
- Hệ thống vector biến nạp: Sử dụng plasmid pCambia3301 trong chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105. Cấu trúc T-DNA của vector mang:
- Gen chỉ thị sàng lọc gusA (mã hóa enzyme β-glucuronidase, phân cắt cơ chất X-gluc tạo tủa màu xanh chàm), đặt dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S và terminator Nos polyA, chứa intron catalase để ngăn biểu hiện trên vi khuẩn.
- Gen chỉ thị chọn lọc bar (mã hóa phosphinothricin acetyltransferase - PAT, giải độc hoạt chất diệt cỏ PPT), chịu sự điều khiển của promoter CaMV35S.
- Gen kháng kháng sinh kanamycin phục vụ chọn lọc dòng vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp.
Phương pháp nghiên cứu thực tế
- Chuẩn bị mẫu thực vật và dịch khuẩn: Hạt bưởi đỏ chín được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% (2–3 phút) và dung dịch NaClO 0,1% (8–10 phút), tách vỏ gỗ, nuôi cấy nảy mầm trên môi trường GM (Germination Medium) ở nhiệt độ 26 ± 1°C, chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày để thu đoạn thân mầm (0,7–1,0 cm, cắt vát 2 đầu). Chủng vi khuẩn EHA105 được nuôi tăng sinh trên môi trường YEP có bổ sung rifamycin (30 mg/l) và spectinomycin (100 mg/l), ly tâm thu sinh khối và huyền phù trong môi trường đồng nuôi cấy lỏng (CCM) bổ sung 100 mM Acetosyringone (AS), điều chỉnh mật độ quang $\text{OD}_{600} = 0,5 - 0,7$.
- Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD), nhắc lại 3 lần:
- Thí nghiệm 1: Đánh giá 4 mức tuổi thân mầm (14, 20, 25, 30 ngày) trên môi trường GM, cấy 10 mẫu/lần nhắc lại.
- Thí nghiệm 2: Đánh giá 3 phương thức lây nhiễm: Ngâm dịch khuẩn 30 phút (đối chứng); Siêu âm 20 giây + Hút chân không 30 giây + Ngâm 30 phút ($S_{20}V_{30}D_{30}$); Siêu âm 30 giây + Hút chân không 30 giây + Ngâm 30 phút ($S_{30}V_{30}D_{30}$).
- Thí nghiệm 3: Đánh giá 4 mức thời gian đồng nuôi cấy trên môi trường CCM đặc (1, 2, 3, 5 ngày) ở 25°C, độ ẩm 60%.
- Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng sống sót và phát triển của chồi trên môi trường tái sinh tạo chồi (SIM) chứa PPT ở các nồng độ 2 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l (40 mẫu/lần nhắc lại).
- Phương pháp phân tích sinh học và hóa sinh:
- Đánh giá biểu hiện tạm thời gen gus: Nhuộm mô với dung dịch X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide), ủ 48 giờ ở 37°C, tẩy diệp lục bằng ethanol 96%.
- Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng phương pháp CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) bổ sung 0,1% β-mercaptoethanol ở 65°C, tinh sạch bằng chloroform:isoamyl alcohol (24:1) và tủa bằng isopropanol.
- Khuếch đại PCR gen bar: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu:
- Mồi xuôi (F):
5'-TCC GTA CCG AGC CGC AGG AA-3'
- Mồi ngược (R):
5'-CCG GCA GGC TGA AGT CCA GC-3'
- Chu trình nhiệt: 94°C (5 phút); 35 chu kỳ [94°C (30 giây), 55°C (30 giây), 72°C (45 giây)]; 72°C (2 phút); giữ ở 4°C. Điện di sản phẩm trên gel agarose 0,8%, nhuộm và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại.
- Xử lý số liệu: Thu thập dữ liệu tỷ lệ mẫu dương tính GUS ($GUS^+$), tỷ lệ nảy chồi và tỷ lệ sống sót; phân tích thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2003 và IRRISTAT 5.0 (tính hệ số biến động CV% và sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa $LSD_{0.05}$).
Nội dung chính theo từng phần của khóa luận
Phần 1: Mở đầu
Tác giả trình bày tính cấp thiết của việc cải tạo giống bưởi đỏ thông qua kỹ thuật di truyền nhằm khắc phục nguy cơ dịch bệnh do virus và thoái hóa giống trong nhân giống vô tính truyền thống. Xác định rõ mục tiêu chuyển nạp hệ thống gen gus và bar vào giống bưởi đỏ bản địa, thiết lập các yêu cầu thực nghiệm và nêu bật ý nghĩa khoa học trong việc hoàn thiện quy trình công nghệ sinh học trên cây ăn quả thân gỗ.
Phần 2: Tổng quan tài liệu
Chương tổng quan hệ thống hóa các tư liệu học thuật liên quan:
- Thực vật học và giá trị cây bưởi: Nguồn gốc, phân loại (Citrus grandis), đặc điểm sinh thái, cấu trúc rễ-thân-lá-hoa-quả. Phân tích hàm lượng dinh dưỡng theo công bố của USDA (nước 88,06 g, đường, vitamin C 31,2 mg, canxi 22 mg, khoáng vi lượng).
- Tình hình sản xuất và thị trường: Trích dẫn số liệu thống kê FAOSTAT và Tổng cục Thống kê về diện tích, năng suất, sản lượng bưởi thế giới và Việt Nam giai đoạn 2006–2012. Năm 2012, sản lượng bưởi thế giới đạt 8.040.038 tấn (châu Á dẫn đầu với 5.155.479 tấn); diện tích bưởi Việt Nam năm 2012 đạt 2.300 ha với sản lượng 27.500 tấn.
- Phương pháp nhân giống và kỹ thuật chuyển gen: So sánh ưu nhược điểm giữa phương pháp truyền thống (gieo hạt, giâm, chiết, ghép) và công nghệ sinh học (nuôi cấy mô in vitro, vi ghép, đột biến thực nghiệm). Tổng quan các phương pháp biến nạp trực tiếp (PEG, xung điện, súng bắn gen) và gián tiếp qua A. tumefaciens. Điểm lại các công trình chuyển gen thành công trên cây có múi của Gutiérrez-E (1997), Diane Luth & Gloria Moore (1999), Yang (2000), Oliveira (2009), Lê Trần Bình (1993, 2008), Nguyễn Văn Phượng (2010), Phan Hữu Tôn (2013).
Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu thực vật (hạt bưởi đỏ thu thập tại Thái Nguyên), hệ thống thiết bị (máy siêu âm Mujigae, máy hút chân không Welch, buồng cấy Airtech, máy điện di Mupid-plus, máy luân nhiệt TE-Thermo cycle), hóa chất môi trường (khoáng MS, chất kích thích sinh trưởng, kháng sinh cefotaxim, ticarcillin, vancomycin, chất chọn lọc PPT, X-gluc). Thiết lập quy trình 11 bước tách chiết DNA bằng đệm CTAB và quy trình phản ứng PCR đặc hiệu nhận diện đoạn gen bar.
Phần 4: Kết quả và thảo luận
Chương kết quả tập trung phân tích 4 nội dung thí nghiệm tối ưu hóa quy trình biến nạp và phân tích phân tử dòng chồi tái sinh:
1. Ảnh hưởng của tuổi mẫu thân mầm đến hiệu quả biến nạp gen gus
Tuổi thân mầm in vitro quyết định trực tiếp tới khả năng phân chia tế bào, tái sinh chồi và mức độ mẫn cảm với vi khuẩn biến nạp. Kết quả theo dõi sau 14 ngày nuôi cấy được ghi nhận tại bảng sau:
| Công thức |
Tuổi thân mầm (ngày) |
Số mẫu nhuộm X-gluc (mẫu) |
Tỷ lệ mẫu có GUS⁺ (%) |
Tỷ lệ mẫu nảy chồi (%) |
Mức độ biểu hiện GUS |
| CT 1 |
14 |
30 |
17,8 |
17,2 |
+ |
| CT 2 |
20 |
30 |
26,7 |
36,7 |
++ |
| CT 3 |
25 |
30 |
22,2 |
30,0 |
+++ |
| CT 4 |
30 |
30 |
18,9 |
20,0 |
+++ |
| CV (%) |
|
|
2,6 |
2,1 |
|
| LSD₀.₀₅ |
|
|
0,97 |
1,12 |
|
Ghi chú: Mức độ biểu hiện: +++ (màu xanh đậm, vùng biểu hiện rộng); ++ (màu xanh nhạt, vùng biểu hiện trung bình); + (màu xanh nhạt, vùng biểu hiện hẹp). Thân mầm 20 ngày tuổi đạt sự cân bằng tối ưu giữa tỷ lệ $GUS^+$ (26,7%) và tỷ lệ nảy chồi (36,7%).
2. Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm đến hiệu quả biến nạp gen gus
Việc kết hợp sóng siêu âm và áp suất âm (hút chân không) tạo ra các vi vết thương trên bề mặt mô, hỗ trợ giải phóng hợp chất phenolic dẫn dụ vi khuẩn và gia tăng diện tích tiếp xúc với dịch khuẩn:
| Công thức |
Phương thức lây nhiễm |
Số mẫu nhuộm X-gluc (mẫu) |
Tỷ lệ mẫu GUS⁺ (%) |
Tỷ lệ mẫu nảy chồi (%) |
Mức độ biểu hiện GUS |
| CT 1 (Đ/c) |
Ngâm 30 phút |
30 |
22,5 |
72,5 |
++ |
| CT 2 |
Siêu âm 20s + Hút CK 30s + Ngâm 30p ($S_{20}V_{30}D_{30}$) |
30 |
52,5 |
65,0 |
+++ |
| CT 3 |
Siêu âm 30s + Hút CK 30s + Ngâm 30p ($S_{30}V_{30}D_{30}$) |
30 |
62,5 |
45,0 |
+++ |
| CV (%) |
|
|
3,1 |
2,6 |
|
| LSD₀.₀₅ |
|
|
3,3 |
3,6 |
|
Công thức $S_{20}V_{30}D_{30}$ được lựa chọn là tối ưu do duy trì được tỷ lệ nảy chồi cao (65,0%) trong khi tỷ lệ $GUS^+$ đạt 52,5% với mức độ biểu hiện mạnh (+++). Tăng thời gian siêu âm lên 30 giây làm tổn thương mô sâu, khiến tỷ lệ nảy chồi giảm mạnh xuống còn 45,0%.
3. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp
Thời gian đồng nuôi cấy trên môi trường CCM quyết định sự thành công của quá trình chuyển T-DNA vào hệ gen thực vật:
| Công thức |
Thời gian đồng nuôi cấy (ngày) |
Số mẫu nhuộm X-gluc (mẫu) |
Tỷ lệ mẫu GUS⁺ (%) |
Mức độ biểu hiện GUS |
| CT 1 |
1 |
30 |
22,5 |
++ |
| CT 2 |
2 |
30 |
35,7 |
+++ |
| CT 3 |
3 |
30 |
42,1 |
+++ |
| CT 4 |
5 |
30 |
39,6 |
+++ |
| CV (%) |
|
|
5,5 |
|
| LSD₀.₀₅ |
|
|
3,8 |
|
Thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày cho tỷ lệ $GUS^+$ cao nhất (42,1%). Nuôi cấy ngắn (1–2 ngày) chưa đủ thời gian để vi khuẩn lây nhiễm tối đa; kéo dài đến 5 ngày làm vi khuẩn phát triển quá mức, gây thối mô, suy giảm sức sống và khó loại bỏ khuẩn dư thừa.
4. Đánh giá chọn lọc chồi và phân tích phân tử
Chồi sau tái sinh được đưa vào môi trường chọn lọc chứa PPT ở các dải nồng độ 2, 5 và 10 mg/l để ức chế các chồi không chuyển gen (chồi thoát). Phân tích kiểm tra DNA tổng số chiết xuất từ lá chồi sống sót và khuếch đại phân đoạn gen bar bằng PCR xác nhận sự hiện diện của băng sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trên bản gel agarose 0,8%, khẳng định các chồi tái sinh sống sót đã mang gen chuyển.
Phần 5: Kết luận và đề nghị
Đúc kết các thông số kỹ thuật đã được tối ưu hóa trong quy trình và đề xuất các bước nghiên cứu tiếp theo để hoàn thiện quy trình tạo cây hoàn chỉnh.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm
Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình chuyển gen gián tiếp vào giống bưởi đỏ thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với các thông số tối ưu:
- Vật liệu khởi đầu: Đoạn thân mầm in vitro thu được từ hạt chín sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường GM (tỷ lệ $GUS^+$ đạt 26,7%, tỷ lệ nảy chồi đạt 36,7%).
- Phương thức lây nhiễm: Xử lý kết hợp cắt vát 2 đầu mô, siêu âm 20 giây, hút chân không 30 giây và ngâm trong dịch khuẩn 30 phút ($S_{20}V_{30}D_{30}$), nâng tỷ lệ biến nạp $GUS^+$ lên 52,5% (vượt trội so với mức 22,5% của phương pháp ngâm đối chứng) và tỷ lệ nảy chồi đạt 65,0%.
- Điều kiện đồng nuôi cấy: Đồng nuôi cấy trên môi trường CCM trong thời gian 3 ngày ở 25°C cho tỷ lệ $GUS^+$ đạt cực đại 42,1%.
- Kiểm chứng sinh học phân tử: Xác định được khả năng sống sót của chồi chuyển gen trên môi trường chọn lọc chứa chất diệt cỏ PPT và chứng minh sự tích hợp của gen bar qua phân tích điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Đóng góp học thuật và thực tiễn
- Về mặt học thuật: Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm chi tiết về sự tương tác giữa mô cây thân gỗ có múi (Citrus grandis) với chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105; chứng minh hiệu quả của việc hỗ trợ cơ học (siêu âm kết hợp hút chân không) trong việc vượt qua rào cản xâm nhiễm của tế bào thực vật thân gỗ.
- Về mặt thực tiễn: Thiết lập hệ thống chuyển nạp gen chuẩn hóa cho giống bưởi đỏ bản địa, tạo tiền đề để chuyển các gen chức năng quan trọng (như gen kháng virus CTV, gen chịu hạn, gen tạo quả không hạt) vào giống bưởi đỏ trong tương lai.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của đề tài
- Khóa luận mới tập trung khảo sát sự biểu hiện tạm thời của gen chỉ thị gus và kiểm tra bước đầu sự có mặt của gen chọn lọc bar trên các chồi in vitro sống sót sau chọn lọc PPT.
- Chưa hoàn thiện giai đoạn kích thích ra rễ (Rooting Medium - RM) hoặc ghép chồi chuyển gen lên gốc ghép sạch bệnh để phát triển thành cây hoàn chỉnh ngoài vườn ươm.
- Chưa tiến hành các phân tích biểu hiện gen bền vững ở mức độ phiên mã và dịch mã chuyên sâu (như lai Southern blot, Northern blot hoặc Western blot).
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Tiếp tục nghiên cứu quy trình ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro hoặc tối ưu hóa kỹ thuật vi ghép chồi chuyển gen lên các gốc ghép khỏe mạnh.
- Đánh giá tính ổn định di truyền và mức độ biểu hiện bền vững của gen chuyển ở các thế hệ sinh trưởng tiếp theo ngoài nhà lưới/vườn ươm.
- Ứng dụng quy trình chuyển gen đã thiết lập để đưa các gen kháng bệnh (kháng bệnh vàng lá Greening, kháng virus Tristeza) hoặc gen điều hòa phát triển (như gen tạo quả không hạt) vào giống bưởi đỏ.
Giá trị tham khảo
Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng:
- Sinh viên, học viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Khoa học Cây trồng, Nông học: Nguồn tài liệu tham khảo chi tiết về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật thân gỗ, kỹ thuật biến nạp gen qua Agrobacterium, quy trình nhuộm hóa mô gus và kỹ thuật phát hiện gen chuyển bằng PCR.
- Cán bộ nghiên cứu chọn tạo giống cây ăn quả có múi: Cung cấp thông số vận hành thực nghiệm chuẩn hóa (tỷ lệ siêu âm, thời gian hút chân không, chu kỳ nhiệt PCR) giúp rút ngắn thời gian thử nghiệm khi triển khai đề tài chuyển gen trên các đối tượng cây ăn quả có múi khác.
- Phần nội dung đáng tham khảo nhất: Quy trình gây tổn thương mô kết hợp siêu âm và hút chân không (Mục 3.6.3 & Bảng 4.2), cùng giao thức chuẩn bị mẫu và chu trình nhiệt PCR phát hiện gen kháng thuốc diệt cỏ bar (Mục 3.6.6).
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao nghiên cứu lựa chọn mẫu thân mầm 20 ngày tuổi thay vì 25 hay 30 ngày tuổi?
Mặc dù mẫu thân mầm 25 và 30 ngày tuổi cho mức độ biểu hiện màu xanh đậm hơn (+++), nhưng thân mầm 20 ngày tuổi mang lại tỷ lệ nảy chồi cao nhất (36,7%) và tỷ lệ mẫu $GUS^+$ cao nhất (26,7%). Khi tuổi thân mầm tăng lên 25 và 30 ngày, mô bị già hóa, khả năng phân chia và tái sinh chồi suy giảm đáng kể (tỷ lệ nảy chồi giảm xuống lần lượt là 30,0% và 20,0%).
2. Việc áp dụng sóng siêu âm và hút chân không có tác dụng gì trong quá trình lây nhiễm vi khuẩn?
Sóng siêu âm tạo ra các vi tổn thương đồng đều trên bề mặt mô thân mầm mà không làm dập nát cấu trúc, kích thích mô tiết hợp chất phenolic để dẫn dụ vi khuẩn. Đồng thời, lực hút chân không loại bỏ các bọt khí trong gian bào, tạo điều kiện cho dịch khuẩn A. tumefaciens thâm nhập sâu vào các lớp tế bào bên trong, giúp tỷ lệ biến nạp $GUS^+$ tăng từ 22,5% (ngâm thường) lên 52,5% ($S_{20}V_{30}D_{30}$).
3. Cấu trúc T-DNA của plasmid pCambia3301 gồm những thành phần chức năng nào?
T-DNA của plasmid pCambia3301 bao gồm:
- Gen chỉ thị sàng lọc gusA chứa intron catalase, đặt dưới sự điều hòa của promoter CaMV35S và Nos polyA terminator.
- Gen chỉ thị chọn lọc thực vật bar kháng chất diệt cỏ phosphinothricin (PPT), chịu sự điều khiển của promoter CaMV35S.
- Hai trình tự biên giới bờ trái (LB) và bờ phải (RB) làm tín hiệu nhận biết cho enzyme cắt-chuyển T-DNA.
4. Trình tự cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt PCR nhân bản gen bar được thiết lập như thế nào?
- Trình tự mồi:
- Mồi xuôi (F):
5'-TCC GTA CCG AGC CGC AGG AA-3'
- Mồi ngược (R):
5'-CCG GCA GGC TGA AGT CCA GC-3'
- Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu ở 94°C trong 5 phút; tiếp nối bằng 35 chu kỳ gồm 94°C (30 giây), bắt cặp ở 55°C (30 giây), kéo dài ở 72°C (45 giây); kéo dài kết thúc ở 72°C trong 2 phút và giữ mẫu ở 4°C.
5. Tại sao thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày lại vượt trội hơn so với 1, 2 hoặc 5 ngày?
Đồng nuôi cấy 1 hoặc 2 ngày chưa đủ thời gian để vi khuẩn hoàn tất quá trình gắn kết và chuyển T-DNA vào nhân tế bào chủ, khiến tỷ lệ $GUS^+$ thấp (22,5% và 35,7%). Ngược lại, nếu kéo dài đến 5 ngày, vi khuẩn Agrobacterium sinh trưởng quá mức sẽ gây độc, thối mô thực vật và cản trở quá trình khử trùng sau đó, làm giảm tỷ lệ mẫu biến nạp thành công xuống 39,6%. Thời gian 3 ngày đạt điểm cân bằng sinh học tối ưu với tỷ lệ $GUS^+$ cao nhất (42,1%).
Kết luận
Khóa luận của tác giả Bùi Thị Ý đã nghiên cứu và thiết lập thành công các thông số kỹ thuật then chốt cho quy trình chuyển gen gián tiếp vào giống bưởi đỏ thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid pCambia3301. Kết quả thực nghiệm xác định mẫu thân mầm in vitro 20 ngày tuổi, kết hợp lây nhiễm bằng siêu âm 20 giây, hút chân không 30 giây, ngâm dịch khuẩn 30 phút và đồng nuôi cấy 3 ngày mang lại hiệu quả biến nạp gen $GUS^+$ và tái sinh chồi tối ưu. Sự hiện diện của gen chọn lọc bar trên các chồi sống sót đã được chứng minh qua phản ứng PCR đặc hiệu, tạo cơ sở thực nghiệm vững chắc cho các nghiên cứu chuyển nạp gen kháng bệnh và cải thiện phẩm chất giống cây có múi tại Việt Nam.
