Đặt vấn đề Trong thế giới các loài hoa có thể nói hoa lan là loài hoa có vẻ đẹp quyến rũ mê hồn về màu sắc và hƣơng thơm, đặc biệt là các đƣờng nét của hoa thật cầu kỳ, sắc sảo, thêm vào đó hoa lan có đặc tính bền và tƣơi lâu ngoài các giá trị làm cảnh và trang trí, hoa lan còn đƣợc sử dụng với nhiều mục đích khác nhau nhƣ: Dùng làm thực phẩm (giống Orchis), rau xanh (giống Anoetochilus), trà uống (loài Jumellea fragrans), hƣơng liệu (Vannila plannifolia) và đặc biệt lan còn đƣợc dùng làm dƣợc liệu, có tác dụng chữa bệnh nhƣ một số loài lan thuộc chi Orchis, Platanthera, Gymnadenda, Dactylorhiza và đặc biệt là chi Lan Hoàng Thảo (Dendrobium nobile, Caulis Dendrobium, dendrobium loddgesii, Dendrobium Chrysanthum, Dendrobium fimbriatum, Dendrobium nobile Lindi). Tuy nhiên trong quá trình phát triển kinh tế, xã hội do những nguyên nhân khác nhau nhiều loài lan Hoàng Thảo nƣớc ta đã bị tuyệt chủng hoặc đang bị đe dọa tuyệt chủng (Vũ Ngọc Lan và cs 2011) [3]. Năm 2004 một số loài lan thuộc chi hoàng thảo đã có trong danh lục đỏ “Sách đỏ Việt Nam” nhƣ: Thủy Tiên Hƣờng (Dendrobium amabile (Lour. Hạc Vĩ (Dendrobium aphyllum (Roxb.
Fisch 1928), Ngọc Vạn Vàng (Dendrobium Chrysanthum Lindl. 1830), Kim Diệp (Dendrobium fimbriatum Hook. 1823), Hoàng thảo hoa Trắng – Vàng (Dendrobium nobile var. Do vừa có giá trị làm cây hoa cảnh vừa làm cây dƣợc liệu nên nhiều loài lan bản địa miền trung du phía bắc bị khai thác quá mức vào mục đích thƣơng mại và đứng trƣớc nguy cơ bị cạn kiệt.
Vì vậy việc nghiên cứu nhân giống nhằm c 2 mục đích cung cấp sản phẩm cho thị trƣờng đồng thời bảo tồn giống lan rừng là việc làm cấp thiết. Xuất phát từ tình hình thực tiễn đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất hữu cơ dịch chiết khoai tây, cà rốt và hàm lƣợng nƣớc dừa khác nhau kết hợp với các chất kích thích sinh trƣởng Kinetine, BA, NAA, GA3 khả năng nhân nhanh, ra rễ và giai đoạn ngoài vƣờn ƣơm Lan Hoàng Thảo’’.2 Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu hàm lƣợng của các chất hữu cơ khoai tây, cà rốt và nƣớc dừa kết hợp với chất kích thích sinh trƣởng Kinetine, BA, NAA, GA3 đến quá trình nhân nhanh và ra rễ của cây Lan Hoàng Thảo giúp hoàn thiện quy trình nhân nhanh Lan Hoàng Thảo bằng phƣơng pháp in vitro. Yêu cầu của đề tài - Xác định đƣợc hàm lƣợng chất hữu cơ dịch chiết khoai tây, cà rốt và nƣớc dừa kết hợp chất kích thích sinh trƣởng Kinetine, BA đến quá trình nhân nhanh của lan Hoàng Thảo. - Xác định đƣợc hàm lƣợng than hoạt tính, kết hợp chất chất kích thích NAA, GA3 đến khả năng tạo rễ và giai đoạn ngoài vƣờn ƣơm.
Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa trong khoa học + Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học. + Biết đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, biết cách trình bày một bài báo khoa học. + Xác định đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến nuối cấy, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. - Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp số lƣợng cây con dồi rào cho thị trƣờng, giảm giái thành sản phẩm.
c 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào trên môi trƣờng nuôi cấy đƣợc xác định rõ: việc nuôi cấy đƣợc duy trì dƣới điều kiện kiểm soát. Vì nhân giống là phƣơng pháp nhân nhanh với số lƣợng lớn và giảm giá thành.
Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật Haberlandt (1902), [18]. Lần đầu tiên đã quan niệm rằng tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật đều có khẳ năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ điều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây lan Phong lan là cây thành công nhất trong nhân giống vô tính bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô ở quy mô thƣơng mại.
nuôi cấy mô đã đƣợc thí nghiệm từ thế kỷ 17. Năm 1956 White và Gautheret mới áp dụng nuôi cấy mô thành công trên cây lan. Đã tạo đƣợc giống cây Cymbidium sạch virut từ cây bị bệnh bằng nuôi cấy chồi nách trên môi trƣờng Knudson C. Bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô.
Với kỹ thuật nhân giống này đã tạo ra tốc độ cực mạnh mẽ trong phát triển nghề trồng phong lan có quy mô công nghiệp. Những nghiên cứu chi tiết cho từng loại, từng giống ở từng khu vực đã và đang đƣợc cải tiến ngày một hoàn chỉnh hơn Đỗ Năng Vịnh, (2005) [5]. Tính toàn năng của tế bào Ngay cuối thế kỷ XIX nhà sinh lý thực vật học ngƣời đức Haberlandt đã phát biểu tính toàn năng của tết bào: Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng mang toàn bộ thông tin di truyền (AND) của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
Tính toàn năng của tế bào của Haberlandt chính là cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Hơn 50 năm sau, các nhà thực nghiệm về nuôi cấy mô và tế bào thực vật mới đạt đƣợc thành tựu chứng minh cho khả năng tồ n ta ̣i và phát triể n đô ̣c lâ ̣p của tế bào. Tính toàn thế của tế bào thực vật đã đƣợc từng bƣớc chƣ́ng minh. Nổ i bâ ̣t là các công triǹ h : Miller và Skoog (1953) tạo đƣợc rễ từ mảnh mô cắt từ thân cây thuố c lá , Reinert và Steward (1958) đã ta ̣o đƣơ ̣c phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch, Cocking (1960) tách đƣợc tế bào trần và Takebe (1971) tái sinh đƣợc cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trầ n của lá cây thuốc lá Hazarika, 2003 [24].
Phân hóa và phản phân hóa tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô thực vật in vitro thực chất là quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt đầu từ tết bào phôi sinh. Sự phân hóa tết bào là: Chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hóa, đảm nhận chức năng khác nhau của cơ thể.
Quá trình phân hóa của tế bào: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hóa chức năng Tuy nhiên sau khi tế bào phân hóa thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khẳ năng phân chia của mình. Trong trƣờng hợp cần thiết. Điều kiện thích hợp của chúng có thể chở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ quá trình này gọi là quá trình phản phân hóa tế bào. c 5 Tế bào chuyên hóa (mô) Tế bào phôi sinh (NhutDT và cộng sự, 2003)[22]; (Okamoto và cộng sự, 2002) [23] Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen.
Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen đƣợc hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen mới lại ức chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen đƣợc hoạt hoá, quá trình phân chia sẻ đƣợc xảy ra theo một chƣơng trình đã định sẵn trong ADN của tế bào [12].
Môi trƣờng nuôi cấy Cũng nhƣ cây ở ngoài tự nhiên cây trong ống nghiệm cũng cần những thành phần dinh dƣỡng để cung cấp cho quá trình phát triển của cây. Thành phần của chúng gồm có: Các nguyên tố đa lƣợng, vi lƣợng và các hợp chất bổ xung khác. Các chất điều hòa sinh trƣởng Dựa vào đặc tính sinh học và hƣớng tác dụng chất này đƣợc chia làm 3 nhóm thƣờng đƣợc sự dụng trong nuôi cấy mô tế thực vật. Các hợp chất Auxin Quyết định sự ra rễ.
Nhóm này gồm các chất chính là: IAA, IBA, NAA, 2,4D đƣợc tổng hợp từ các tế bào non trên gọn cây và đƣợc vẩn chuyển một chiều xuống các cơ quan phía dƣới. Tham gia vào kích thích quá trình tạo rễ mới. Auxin lƣu thông từ đỉnh xuống dƣới cơ quan với một sự phân cực rõ ràng đƣợc thấy rõ trên các cơ quan còn non, nhƣng trong quá trình vận chuyển này chúng bị thoái hóa bởi sự Auxin-oxydase, điều này cho thấy nồng độ Auxin luôn cao hơn nơi tổng hợp chúng. Nhƣ vậy, Auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở các điểm tăng trƣởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào [12].
Các hợp chất Cyttokinin Quyết định sự phân chia tế bào và tái sinh chồi. Các chất trong nhóm đƣợc biết đến và sử dụng nhiều nhất là: Kinetin, BAP(5 Benzyl amino purin) và Zeatin. Chúng đƣợc sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô vì có khẳ năng kích thích chồi phát triển. Đƣợc ứng dụng làm tăng hệ số nhân trong nuôi cấy in vitro[12].
Các hợp chất Gibberellin Quyết định sự sinh trƣởng của cây Quan trọng nhất trong nhóm này là Gibberellin acid (GA3): Có tác dụng kéo dài lóng đốt, kích thích sự sinh trƣởng của mô phân sinh, chồi…[12]. Các chất khoáng Nguyên tố đa lƣợng, vi lƣợng: Các chất khoáng cung cấp cho cây trong nuôi cấy mô đều ở dạng muối vô cơ, cây lan có thể thích nghi phổ rộng các muối vô cơ. Đạm là thành phần của acid nucleic đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất, là thành phần chính của chất nguyên sinh tế bào, do đó có ảnh hƣởng trực tiếp đến sử sinh trƣởng và phát triển của cây. Đạm thƣờng sử dụng trong nuôi cấy mô thƣờng ở dạng muối (NH4+) và Nitrat (NO3-).
Lân tham gia vào việc vẩn chuyển năng lƣợng, sinh tổng hợp protein, Acid nucleic, tham gia vào cấu trúc của màng. Lân thƣờng sử dụng ở dạng ion là H2PO4- và H2PO22-. Nồng độ khoáng đa lƣợng và vi lƣợng trong môi trƣờng ra rễ thƣờng giảm xuống một nửa so với bình thƣờng. Nguyên nhân do nhu cầu về đạm giảm xuống [15].