Thiết kế vector chuyển gene RNAi tạo cây thuốc lá kháng virus phổ rộng

Luận văn nghiên cứu thiết kế vector chuyển gene bằng công nghệ RNAi, tạo giống cây thuốc lá mang gen kháng virus phổ rộng, bảo vệ cây trồng hiệu quả.

• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ RNAi
• Loại tài liệu: Luận văn

Tóm tắt

I. Tổng quan về cây thuốc lá và các bệnh virus

Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, đóng góp đáng kể vào ngân sách của nhiều quốc gia. Ngoài vai trò kinh tế, cây thuốc lá được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotine, axit hữu cơ và chiết xuất dầu thực vật. Với khả năng tái sinh tốt và chấp nhận gene ngoại lai hiệu quả, thuốc lá là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu sinh học cơ bản. Tuy nhiên, cây thuốc lá rất mẫn cảm với các bệnh do virus gây nên, đặc biệt là TMV (Tobacco mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus), TSWV và TYLCV. Những bệnh virus này có thể làm giảm năng suất lên tới 95-100%, gây thiệt hại nghiêm trọng cho nền kinh tế.

1.1. Ý nghĩa kinh tế và sinh học của thuốc lá

Cây thuốc lá đem lại công ăn việc làm cho hàng triệu lao động trên toàn thế giới. Ngoài sử dụng trực tiếp, thuốc lá cung cấp nguyên liệu cho các ngành sản xuất công nghiệp khác. Trong lĩnh vực nghiên cứu, cây thuốc lá được dùng làm đối tượng mô hình để nghiên cứu quá trình trao đổi chất, vai trò của gene và protein, cũng như tiếp nhận gene ngoại lai hiệu quả.

1.2. Các bệnh virus chính gây hại trên thuốc lá

Hơn 2000 loài virus đã được phát hiện gây hại trên thực vật. Trên cây thuốc lá, các virus chính bao gồm TMV gây bệnh khảm lá, CMV, TSWV và TYLCV gây héo và xoăn lá. Những bệnh virus này gây thiệt hại nghiêm trọng, có thể làm mất toàn bộ sản lượng và tác động tiêu cực lên nền kinh tế các quốc gia.

II. Công nghệ RNAi trong chọn tạo cây kháng virus

RNA interference (RNAi) là công nghệ sinh học phân tử hiệu quả nhất trong việc tạo cây trồng kháng virus. Công nghệ này sử dụng các vật liệu di truyền từ virus gây bệnh như gene mã hóa protein vỏ (CP) và protein di chuyển (MP) để chuyển vào cây trồng. Qua đó, tạo ra cây chuyển gene có khả năng kháng lại virus gây bệnh. Nhiều nghiên cứu thành công đã áp dụng công nghệ RNAi để tạo giống kháng virus như khoai tây kháng virus Y, lúa kháng RYMV, hay cây kháng CMV và TMV. Tuy nhiên, hầu hết các công trình hiện tại chỉ chuyển đơn gene hoặc gene kép, không đảm bảo khả năng kháng virus phổ rộng trên nhiều loài virus khác nhau.

2.1. Nguyên lý hoạt động của công nghệ RNAi

RNAi hoạt động bằng cách sử dụng các gene từ virus gây bệnh để tạo cấu trúc gene đặc biệt. Khi chuyển vào cây, những gene này sẽ tạo ra RNA can thiệp có thể nhận diện và tiêu diệt RNA của virus khi nó xâm nhiễm. Cơ chế này giúp cây phát triển khả năng kháng virus tự nhiên, không sử dụng hóa chất hại môi trường.

2.2. Ứng dụng thành công của RNAi trong tạo cây kháng virus

Nhiều quốc gia đã áp dụng công nghệ RNAi để tạo giống cây kháng virus thành công. Các dự án này bao gồm khoai tây kháng virus Y, lúa kháng RYMV, dưa chuột kháng CMV và thuốc lá kháng TMV. Những giống này giúp tăng năng suất và giảm tổn thất cho nông dân, đồng thời giảm nhu cầu sử dụng thuốc trừ sâu.

III. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu kháng virus phổ rộng

Đề tài luận văn "Thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ RNAi" nhằm vượt qua những hạn chế của các nghiên cứu trước đó. Mục tiêu chính là thiết kế cấu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus gây hại trên thuốc lá, tạo vector RNAi mang các cấu trúc này, và phát triển cây thuốc lá chuyển gene với khả năng kháng virus phổ rộng. Nội dung nghiên cứu bao gồm thiết kế mồi đặc hiệu, ghép nối gene, tạo vector pDONOR, chuyển gene bằng kỹ thuật Gateway, và chuyển gene vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium tumefaciens. Phương pháp này cho phép cây kháng lại đồng thời nhiều loài virus khác nhau.

3.1. Mục tiêu chính của đề tài nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là thiết kế cấu trúc gene đa đoạn chứa thông tin di truyền từ 4 loài virus khác nhau. Từ đó tạo vector RNAi hiệu quả và cây thuốc lá chuyển gene có khả năng kháng virus phổ rộng. Điểm khác biệt với các nghiên cứu trước là sử dụng nhiều gene virus cùng lúc thay vì chỉ một hoặc hai gene.

3.2. Nội dung kỹ thuật của nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng trình tự gene protein vỏ (CP) của các virus để thiết kế mồi đặc hiệu. Tiếp theo là ghép nối các đoạn gene và xác định trình tự gene chính xác. Tạo vector pDONOR chứa cấu trúc gene CP của 4 loại virus, sau đó chuyển vào vector RNAi pK7GWIWG(II) bằng kỹ thuật Gateway, rồi chuyển vào cây thuốc lá qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

IV. Lịch sử phát triển cây thuốc lá và triển vọng ứng dụng

Cây thuốc lá có nguồn gốc từ châu Mỹ, được các dân tộc bản địa sử dụng trong nghi lễ tôn giáo và làm thuốc chữa bệnh. Sau khi Christopher Columbus phát hiện, thuốc lá được đưa vào châu Âu từ năm 1496-1498 và lan rộng sang Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ vào thế kỷ XVI-XVII. Ở Việt Nam, cây thuốc lá được du nhập từ năm 1660, nhưng phải đến năm 1876 mới phát triển thành ngành sản xuất chính thức tại Gia Định, Tuyên Quang và các tỉnh miền Bắc. Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học, cây thuốc lá có triển vọng trở thành mô hình lý tưởng cho việc phát triển các giống cây kháng virus phổ rộng, mở ra những ứng dụng mới trong nông nghiệp hiện đại.

4.1. Quá trình phát triển lịch sử của cây thuốc lá

Thuốc lá bắt đầu được trồng ở châu Âu từ những năm 1490, sau đó lan sang Trung Quốc, Nhật Bản vào giữa thế kỷ XVI. Ở Ấn Độ, thuốc lá được giới thiệu vào khoảng năm 1605. Các nước này nhanh chóng trở thành các nhà sản xuất thuốc lá lớn, phục vụ tiêu dùng nội địa và thị trường thế giới.

4.2. Triển vọng ứng dụng công nghệ RNAi trên thuốc lá

Với khả năng tái sinh tốt và chấp nhận gene ngoại lai hiệu quả, cây thuốc lá là mô hình lý tưởng cho ứng dụng công nghệ RNAi. Thành công trong việc tạo cây thuốc lá kháng virus phổ rộng sẽ mở ra tiềm năng ứng dụng công nghệ này lên các cây trồng khác, giúp giải quyết vấn đề bệnh virus trong nông nghiệp toàn cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU  LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao và đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia trên thế giới. Việc trồng và sản xuất thuốc lá góp phần tạo công ăn việc làm và thu nhập cho nhiều đối tƣợng lao động. Ngoài ra, cây thuốc lá còn đƣợc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotine, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt. Hơn nữa, với khả năng dễ tái sinh và chấp nhận gene ngoại lai tốt, thuốc lá còn đƣợc xem là cây mô hình trong nhiều nghiên cứu sinh học cơ bản nhƣ: nghiên cứu quá trình trao đổi chất ở thực vật; nghiên cứu vai trò, chức năng của gene và protein cũng nhƣ làm đối tƣợng để tiếp nhận gene ngoại lai.

Thuốc lá là cây trồng mẫn cảm với nhiều loại bệnh hại, đặc biệt là các bệnh do virus gây nên. Cho tới nay, hơn 2000 loại virus gây hại trên thực vật đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu, trong đó có nhiều loài gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lƣợng cây trồng nhƣ: bệnh khảm lá chủ yếu là do Tobaco mosaic virus (TMV) và Cucumber mosaic virus (CMV) gây nên; bệnh xoăn đọt vàng lá, héo ngọn do virus héo đốm cà chua Tomato spotted wilt (TSWV) và Tomato yellow leaf curved virus (TYLCV) gây nên. Các virus này gây thiệt hại nghiêm trọng tới năng suất cây trồng có thể lên tới 95% thậm chí là 100%, làm ảnh hƣởng lớn tới nền kinh tế của nhiều quốc gia và trong đó có Việt Nam [3]. Bệnh do virus gây ra không có biện pháp diệt trừ mà chỉ có thể phòng bệnh.

Các biện pháp truyền thống đã đƣợc áp dụng để phòng ngừa, hạn chế sự lây lan của virus nhƣ: loại bỏ những cây bị bệnh ngay khi mới phát hiện, trồng luân canh giữa các cây trồng, vệ sinh đồng ruộng. đều không mang lại hiệu quả cao mà còn đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng. Việc tìm ra các biện pháp để ngăn chặn sự phát triển và lây lan của virus thực vật đang là một vấn cấp bách. Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có rất nhiều ứng dụng sinh học phân tử trong chọn tạo giống cây trồng kháng virus, trong đó, công nghệ RNA interference (RNAi) là một giải pháp hữu hiệu nhất thông 1 qua việc sử dụng các vật liệu di truyền từ virus gây bệnh nhƣ gene mã hóa protein vỏ (coat protein, CP), protein di chuyển (movement protein, MP) để chuyển vào cây trồng tạo cây trồng chuyển gene kháng lại chính virus đó.

Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong việc sử dụng công nghệ RNAi để tạo ra giống cây trồng chuyển gene kháng virus gây bệnh nhƣ kiểm soát virus Y ở khoai tây [47], chuyển gene kháng RYMV (Rice yellow mottle virus) vào cây lúa [34]; kháng virus khảm dƣa chuột (CMV) [11][26], virus khảm thuốc lá (TMV) [12]. Tuy nhiên, hầu hết các công trình đã công bố chỉ là chuyển đơn gene hoặc gene kép để tạo cây trồng kháng một hoặc hai loài virus nhất định, cây trồng vẫn có thể bị nhiễm các loài virus khác. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ RNAi”.  MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Thiết kế đƣợc cấu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus gây bệnh hại trên cây thuốc lá hiện nay.

- Thiết kế vector RNAi chuyển gene mang các cấu trúc gene đa đoạn. - Tạo cây thuốc lá mang cấu trúc gene chuyển.  NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1. Thiết kế cấu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus - Sử dụng các trình tự gene CP của các virus để thiết kế mồi đặc hiệu.

- Ghép nối các đoạn gene. - Xác định trình tự gene 2. Thiết kế vector RNAi - Tạo vector pDONOR mang cấu trúc gene CP của 4 loại virus. - Chuyển cấu trúc gene CP vào vector chuyển gene pK7GWIWG(II) bằng kỹ thuật Gateway.

- Chuyển vector chuyển gene vào vi khuẩn A. Chuyển gene vào cây thuốc lá nhờ vi khuẩn A. tumefaciens - Chuyển gene - Phân tích cây chuyển gene 2 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.

Lịch sử phát triển của cây thuốc lá Thuốc lá (Nicotiana tabacum và Nicotiana rustica) có nguồn gốc từ châu Mỹ, là cây nhiệt đới và á nhiệt đới, có hƣơng vị đặc trƣng và đƣợc ngƣời bản địa sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo và dùng làm thuốc chữa bệnh [6]. Khi Christopher Columbus đặt chân lên Tây Ấn Độ Dƣơng, ông đã phát hiện ngƣời bản xứ vừa nhảy múa, vừa hút một loại lá cuộn tròn gọi là Tabaccos. Các thông tin về sự phân bố rất sớm của thuốc lá ở các vùng khác nhau đã đƣợc một số tác giả đƣa ra [13]. Thuốc lá bắt đầu đƣợc trồng ở châu Âu vào khoảng những năm 1496 - 1498 do nhà truyền đạo ngƣời Tây Ban Nha mang từ châu Mỹ về.

Andre Teve mang hạt từ Braxin về trồng ở Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha năm 1556 [9]. Thuốc lá đƣợc du nhập vào trồng tại Trung Quốc và Nhật Bản từ giữa thế kỷ thứ XVI, ở Ấn Độ vào khoảng năm 1605. Từ đó, các nƣớc này đã trở thành các nhà sản xuất thuốc lá lớn, phục vụ cho tiêu dùng nội địa và thị trƣờng thuốc lá thế giới. Ở Việt Nam, thuốc lá đã đƣợc du nhập vào từ năm 1660 thời vua Lê Thánh Tông, nhƣng phải đến năm 1876, nghề trồng thuốc lá mới chính thức đƣợc phát triển tại Gia Định (1899), Tuyên Quang (1940) và ở một số tỉnh miền bắc với giống ban đầu là Virginia Bland Cash [10].

Phân loai và nguồn gốc Thuốc lá có tên khoa hoc là : Nicotiana sp.,thuộc ngành thực vật hạt kín Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Cúc Asteridae, bộ hoa mõm sói Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana [35]. Chi Nicotiana có khoảng 50-70 loài, đa số là cây dai , căn cứ vào hình thái , màu sắc của hoa ngƣời ta phân chia thành 4 loại chính: Loài Nicotiana tabacum L. Có hoa màu hồng , đỏ tƣơi hoăc đỏ thẫm la loài phổ biến nhất chiếm 90% diên 3 tích thuốc lá trên thế giới , hầu hết các 4 giống thuốc lá sơi vàng thuôc loaị này. Loài Nicotiana rustica L.

Có hoa màu vàng , chiếm 10% diên tích, hầu hết các giống thuốc lá sơi nâu và sơi đen thuôc loaị này , thƣờng dùng để nhai, ngƣ̉€ i, làm thuốc xì gà. Loài Nicotiana petunioide L. Có hoa màu trắn,gphớ t hồng hay tím, thƣờ ng co trong vƣờn thƣc vâṭ hoc phu vu ̣‚ nguồn dƣ̣‚ trƣ̃ gene cho trong sản xu.ất ƒ c l,aíittcaóo Loài Nicotiana polidieide L. Có hoa màu trắng, trong thƣc tế cũng có ít trong sản sản xuất, chỉ có trong vƣờn thực vật học của một số nƣớc.

Các giống thuốc lá sợi vàng có chất lƣợng cao là Virginia gold, Virginia blond cash, Virginia bright… đƣợc trồng nhiều ở Mỹ , Italia, Bungari, Trung Quốc, Ba Lan, Đức và một số nƣớc khác ở Nam Mỹ. Ở Việt Nam, các giống thuốc lá sợi vàng đƣợc trồng lâu năm ở Ba Vì và Cao Bằng, giống Trung Hoa Bài trồng ở các tỉnh phía Bắc , các giống C-83, K 51E, Coker 176, K326, C9-1, Burley và Flue-Cured virginia trồng phổ biến ở Nam và Trung bô. ̣‚Hiện nay, giống thuốc lá N. K326 và C9-1 đƣợc trồng phổ biến nhất [3].

Giá trị kinh tế và giá trị khoa học của cây thuốc lá Thuốc lá là loại cây công nghiệp ngắn ngày có giái trị kinh tế cao, có tầm quan trọng bậc nhất đối với nền kinh tế thế giới.Việc trồng thuốc lá không chỉ trực tiếp tạo công ăn việc làm cho trên 33 triệu nông dân của hơn 120 quốc gia trên thế giới mà còn đóng vai trò quan trọng cho toàn bộ nền công nghiệp thuốc lá [13]. Các hãng sản xuất thuốc lá trên thế giới đều phải thƣ̀‡ a nhân rằng thuốc lá đem đến cho họ nguồn lợi nhuận khổng lồ. Ở một số nƣớc nhƣ Brazil , Zimbabue, Mỹ, Cu Ba, Bungari… thuốc lá là môt măṭ hàng chiêń lƣơc̣‚ , cho thu nhâ lớn hơn các các loai cây trồng khác. Các số liệu thống kê đã ƣớc tính p 5 khoảng ¼ sản lƣơng thuốc lá trên thế giới đã đƣa vào kim ngac̣ h xuất khẩu.

Ngoài ra, cây thuốc còn giải quyết nhiều vấn đề khác nhƣ luân canh , tăng vu, tân du g đất đai, lao đôṇ g và thu nhâp cao hơn môt số cây trồng khác. n 6 Ở Việt Nam, cây thuốc lá đƣợc trồng phổ biến ở các tỉnh thuộc Bắc Bộ và Nam Bộ. Đây là cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân và thu nhập cho quốc gia. Theo thống kê của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam (Vinataba) [3] trong 3 năm (2006-2008) tổng doanh thu của thuốc lá đạt 47,656 tỷ đồng, nộp ngân sách nhà nƣớc đƣợc 9,653 tỷ đồng, kim ngạch xuất khẩu đạt 192,136 triệu USD, việc làm của ngƣời lao động đƣợc bảo đảm, đời sống từng bƣớc đƣợc nâng cao.

Ngoài giá trị to lớn về kinh tế, cây thuốc lá còn có giá trị về mặt khoa học, thuốc lá là một trong những cây mô hình quan trọng trong các nghiên cứu trên đối tƣợng thực vật nhƣ: nuôi cấy mô tế bào thực vật, chuyển gene thực vật… vì nó dễ tái sinh và chấp nhận gene ngoại lai, có sức sinh trƣởng và chống chịu tốt [40]. Trong y dƣợc học, thuốc lá là dƣợc liệu tốt để trị giun đũa, ký sinh trùng nhƣ chấy, rận, ghẻ, lá khô giã đắp vào vết thƣơng để cầm máu [50]. MỘT SỐ BỆNH VIRUS THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ 1. Bệnh virus trên cây thuốc lá Hiện nay, năng suất và chất lƣợng thuốc lá giảm sút nghiêm trọng do bệnh virus hoành hành.

Trong đó, phổ biến và nghiêm trọng nhất là các bệnh khảm lá do TMV (Tomato mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra; bệnh xoăn vàng lá, héo đốm ngọn do các loài virus TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus) và TSWV (Tomato spotted wilt virus) gây hại (Bảng 1. Năm 2008, theo thống kê của Nguyễn Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích thuộc Tổng công ty thuốc lá Việt Nam, TMV và CMV là hai loài virus gây hại chủ yếu trên cây thuốc lá ở Việt Nam. Bệnh khảm xuất hiện khá sớm với tỷ lệ thấp (2,3-5,2%) và tăng dần hoặc tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo vùng, từ 18,5-26,5% thậm chí lên tới 100% nhƣ ở xã Lâu Thƣợng, tỉnh Thái Nguyên, trong đó giống thuốc lá rất mẫn cảm với TMV chủ yếu là K326. Thiệt hại do virus gây ra ở cây thuốc lá lên đến hàng chục tỷ đồng [3].