MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây ra bệnh héo xanh, và có nguồn gốc trong đất, đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên các cây thuộc họ Cà ở Mỹ vào n m 1896. Cho đến nay bệnh phổ biến rất rộng ở hầu hết các nƣớc châu Á, Phi, Mỹ, Úc. Bệnh bắt đầu xuất hiện ở Châu Âu nhƣng gây hại nghiêm trọng chủ yếu ở các nƣớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới có khí hậu nóng, ẩm.
Bệnh này đƣợc coi là một trong n m loại bệnh cây trồng thuộc đối tƣợng quan tâm nhất của chƣơng trình phòng trừ sâu bệnh tổng hợp của FAO (1992) và chịu sự kiểm soát chặt chẽ của kiểm dịch Quốc tế, nhất là các nƣớc thuộc cộng đồng châu Âu [5]. Đây là loại vi khuẩn có khả n ng gây hại trên 200 loài cây cỏ, đặc biệt gây hại nặng trên cây họ cà nhƣ cà chua, cà tím, khoai tây, thuốc lá và các cây khác họ nhƣ đậu phụng, gừng chuối, chúng có khả n ng sống rất lâu trong đất và lây lan rất nhanh, di chuyển từ nơi này sang nơi khác. Vi khuẩn gây thiệt hại kinh tế lớn đối với các cây trồng có ý nghĩa kinh tế nhƣ lạc, cà chua, khoai tây, và có thể làm giảm đáng kể đến n ng suất và chất lƣợng của nông sản từ 5-100% tùy theo loài cây, giống cây, vùng địa lý Việt nam là một nƣớc có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, thuộc vùng phân bố chính của loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum , bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) đƣợc coi là bệnh hại phổ biến ở nhiều tỉnh trong cả nƣớc nhƣ: Bắc Giang, Bắc Ninh, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tây Ninh. Bệnh gây hại nghiêm trọng ở một số vùng trọng điểm ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa với tỷ lệ bệnh dao động trong khoảng 15% đến 35% và ở tỉnh Long An và Tây Ninh là từ 20% đến 30%.
Đặc biệt, trên địa bàn thành phố Đà Nẵng do sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnh héo xanh, nên quá trình sản xuất các loại cây họ cà gặp rất nhiều khó kh n. Trong đó, cà chua và lạc cho n ng suất thấp và hầu nhƣ không thể trồng đƣợc trên các cánh đồng (đối với cà chua). Trong thực tế sản xuất, phòng chống bệnh HXVK là vấn đề rất khó kh n, đã có nhiều nghiên cứu về canh tác và chọn giống cây trồng, sử dụng thuốc hóa học cũng nhƣ các chế phẩm sinh học có khả n ng ức chế và làm giảm tính độc của R. Tuy nhiên, các biện pháp đó còn nhiều hạn chế, bệnh HXVK vẫn luôn hiện diện, gây hại và luôn là mối lo ngại đối với ngƣời sản xuất.
1 Chọn tạo giống mang gen kháng bệnh đƣợc xem là biện pháp ƣu việt và hiệu quả nhất[13]. Nhƣng tính kháng của giống phụ thuộc rất nhiều vào độc tính của các chủng vi khuẩn [1, 14]. Và để tạo ra đƣợc giống kháng bền vững phải hiểu đƣợc đặc điểm di truyền cũng nhƣ độ độc tính của các chủng vi khuẩn ở các vùng sinh thái khác nhau. Chính vì những lý do trên, chúng tôi đã đề xuất thực hiện đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith gây bệnh héo xanh tại Đà Nẵng bằng chỉ thị phân tử”.
Mục tiêu đề tài Phân lập và đánh giá đƣợc tính đa dạng di truyền bằng phƣơng pháp sinh học phân tử các chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh tại các vùng sản xuất nông nghiệp của thành phố Đà Nẵng,. Ý nghĩa khoa học của đề tài Cung cấp dẫn liệu khoa học về sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Ralstonia solacearum đƣợc phân lập tại Đà Nẵng. Cung cấp các chủng phục vụ trong việc đánh giá tính kháng bệnh bằng phƣơng pháp gây bệnh nhân tạo. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Tổng quan về vi khuẩn 1. Phân loại vi khuẩn Bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) đƣợc gây ra bởi vi khuẩn Ralstonia solanacearum , mà trƣớc đây đƣợc gọi là Pseudomonas solanacearum do E.Smith nghiên cứu n m 1896, đƣợc cho là đã gây bệnh ở khoai tây gây tổn hại nhất, đứng thứ hai sau bệnh bạc lá ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (CGIAR 2005). Chúng gây bệnh cho khoảng 30 loài cây trồng cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm (Smith et al., 2003), trong đó cây dễ bị nhất là khoai tây, cà chua, ớt, cà tím, và lạc. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng có 5 chủng và 5 biovars của Ralstonia [13].1: Hình thái vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith dưới kính hiển vi[18] Các nghiên cứu trên thế giới cho biết: đầu tiên vi khuẩn đƣợc Smith đặt tên là Bacillus solanacearum.
Tiếp theo, vi khuẩn đƣợc đổi tên là Pseudomonas solanacearum (Smith, 1896). Các nghiên cứu phân loại gần đây về các vi khuẩn Pseudomonas không tạo sắc tố huỳnh quang đã tạo ra một chi mới là Burkholderia. solanacearum đã đƣợc phân loại lại thành Burkholderia solanacearum (Yabuuchi et al. Các nghiên cứu phân loại sau đó đã chứng minh rằng B.
solanacearum khác hoàn toàn các vi khuẩn Burkholderia khác và thuộc một chi mới là Ralstonia. Dựa trên các nghiên cứu phân loại mới này, B. solanacearum đã đƣợc đổi 4 tên lại là R. solanacearum(Yabuuchi et al.
Sau Hội nghị Quốc tế lần thứ 2 về vi khuẩn n m 1997, đa số các tác giả gọi vi khuẩn là Ralstonia solanacearum. Hiện nay phân loại chính thức của vi khuẩn héo xanh là: Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Phylum): Proteobacteria Lớp (Class): Beta Proteobacteria Bộ (Order): Burkholderiales Họ (Family): Ralstoniaceae Chi (Genus): Ralstonia Loài: Ralstonia solanacearum (Smith, 1896) (Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010). Ngoài ra, vi khuẩn còn có các tên đồng nghĩa khác là Pseudomonas ricini (Archibald) (Robbs, 1954); Pseudomonas batatae (Cheng và Faan, 1962, Yabuuchi et al., 1995; Yabuuchi et al., 1996; Tahat và Sijam, 2010). Ngoài gây hại trên cây lạc (Arachis hypogaea L.
solanacearum còn gây hại trên 450 loài cây thuộc 54 họ thực vật khác nhau. solanacearum gây bệnh trên một số cây khác nhƣ Ageratum conyzoides, Amaranthus spp., Artemisia pallens, Artemisia sp., Beta vulgaris var. cicla, Capsicum annuum, Casuarina cunninghamiana, Casuarina equisetifolia, Casuarina glauca, Cereus peruvianus, Coleus forskohlii, Coleus sp., Colocasia esculenta, Commelina communis, Cucumis melo, Cucumis sativus, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo, Curcuma longa, Cynara cardunculus var. scolymus, Emilia sonchifolia sp., Galinsoga parviflora sp., Heliconia caribaea, Hevea brasiliensis, Hibiscus sabdariffa, Ipomoea batatas, Justicia adhatoda, Maranta arundinacea, Musa sp., Musa x paradisiaca, Nicotiana tabacum, Olea europaea subsp.
europaea, Pelargonium sp., Platostoma chinensis, Plectranthus barbatus, Pogostemon cablin, Polygonum capitatum, Portulaca oleracea, Ricinus communis, Siraitia grosvenorii, Solanum cinereum, Solanum lycopersicum, Solanum melongena, Solanum nigrum, Solanum tuberosum, Talinum fruticosum, Tectona grandis, Urtica dioica, Washingtonia filifera, Zingiber officinale,. Tuy nhiên, loài vi khuẩn R. solanacearum rất dễ bị biến dị và phân hoá hình thành nhiều nòi và biovar khác hẳn 5 nhau về tính chuyên hoá ký chủ, tính gây bệnh và tính độc, phân bố khác nhau ở các vùng địa lý sinh thái. Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Ly và Phan Bích Thu (1993) đã xác định vi khuẩn R.
solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh. Theo Nguyễn Xuân Hồng và cs. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây trồng khác. Đỗ Tấn Dũng (1995) cho rằng bệnh HXVK phát sinh, phát triển và gây hại nghiêm trọng trên cây cà chua, khoai tây, lạc.
Đoàn Thị Thanh và cs. (1995) cho biết vi khuẩn R. solanacearum không những gây hại trên cây khoai tây mà còn ký sinh và gây hại trên cây cà chua, thuốc lá, lạc, cây cà. Tác giả còn cho rằng đây là loài vi khuẩn đa thực, có phạm vi ký chủ rộng, gây hại chủ yếu trên các cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae), họ đậu (Leguminaseae).
N m 1977, Lê Lƣơng Tề (1997a) đã xác định vi khuẩn R. solanacearum là nguyên nhân gây bệnh héo xanh lạc và một số cây trồng khác nhƣ cà chua, khoai tây, thuốc lá, cây cà, vừng, ớt và đay. Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh thái của vi khuẩn Ralstonia solanacearum a. Đặc điểm hình thái, cấu tạo Vi khuẩn R.
Ralstonia solanacearum (Smith 1896) Yabuuchi et al. Tế bào loài R. solanacearum có hình oval ngắn, gram âm, tròn ở hai đầu, thƣờng ở dạng đơn, ghép đôi hoặc ghép 4, ít khi kết thành chuỗi. Tuy có sự dao động đáng kể nhƣng kích thƣớc của chúng khoảng 0,5-0,7 x 1,5-2,0 mm trong kích thƣớc.
Nó là rất nhạy cảm với khô hạn và bị ức chế trong môi trƣờng có nồng độ natri clorua (NaCl) thấp (2%). Đối với hầu hết các chủng, nhiệt độ t ng trƣởng tối ƣu là 24-370C ; Tuy nhiên một số chủng có nhiệt độ thấp hơn tối ƣu 20-22,50C. Champoiseau và Timur M. Momol của Đại học Florida).
Hầu nhƣ chúng luôn chuyển động, có một đến vài tiên mao ở một cực của tế bào, bề mặt khuẩn lạc thƣờng nhẵn, đôi khi gồ ghề, chảy hoặc không chảy, màu trắng đục hoặc phớt hồng, hoặc trắng. Cả chủng có tính độc cao và tính độc thấp đều có các lông nhỏ ở rìa [Mehan V. solanacearum có cấu tạo đơn bào. Cấu trúc của tế bào vi khuẩn gồm có: vỏ tế bào chiếm 15% đến 30% trọng lƣợng khô của tế bào có tác dụng bảo vệ và giữ cho vi khuẩn có hình dạng xác định.
Tế bào gồm chất nguyên sinh, chất này chứa bào tƣơng, chất nhân (nucleus) và các hạt tròn nhỏ khác nhau trong có chứa chất dinh dƣỡng dự trữ.Bào tƣơng giàu RNA còn nhân giàu DNA. Bằng kính hiển vi điện tử có thể phân biệt đƣợc các cấu trúc đại phân tử với đƣờng kính khoảng 200 Ao 6 (Angstron), các cấu trúc này là tổng thể của RNA-Protein, là những ribosome. Các phân tử ribosome chứa nhiều men cần cho sự tổng hợp protein. Trong tế bào vi khuẩn không thể hiện rõ nhân nhƣ trong tế bào của các cây trồng bậc cao và động vật, nhƣng trong bào tƣơng thƣờng có thể phân biệt đƣợc “những nhiễm sắc thể” mà thƣờng đƣợc xem nhƣ tƣơng ứng với nhân.
Tế bào chất nằm trong màng bào tƣơng, ngoài màng bào tƣơng lại có một lớp vỏ tế bào rắn hơn bao bọc, nhờ đó tế bào có hình dạng nhất định. Thức n vào tế bào qua màng nửa thẩm thấu và những chất trao đổi hình thành trong bào tƣơng cũng qua màng đó mà bị thải ra ngoài (Kinaly và cs., 1983; Izrainxki, 1988; Mehan et al. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R. solanacearum Vi khuẩn R.
solanacearum là vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào tử và nhuộm gram âm. Vi khuẩn này có khả n ng tổng hợp poly-B hydroxybutyrate nhƣ là nguồn các bon dự trữ. solanacearum không hóa lỏng gelatin, không thủy phân tinh bột, không có khả n ng tạo indol và không sử dụng arginin.