Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài xáo tam phân paramignya trimera

Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học tập trung xây dựng chỉ thị phân tử và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài xáo tam phân Paramignya trimera.

• Tác giả: Phí Thị Cẩm Miện
• Người hướng dẫn: PGS. Chu Hoàng Hà
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Chỉ thị phân tử và nhân giống bảo tồn xáo tam phân Paramignya Trimera
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về chi Paramignya
• 1.2. Đặc điểm sinh học của chi Paramignya
• 1.3. Một số thành phần hóa học và hoạt tính sinh học chi Paramignya
• 1.4. Cây Xáo tam phân (P. trimera), phân loại, đặc điểm sinh học và hoạt chất sinh học
• 1.5. Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại Xáo tam phân
• 1.6. Đặc điểm thực vật học của cây Xáo tam phân tại Việt Nam
• 1.7. Nghiên cứu về hoạt tính sinh dược học của cây Xáo tam phân
• 1.8. Các phương pháp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật
• 1.9. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật
• 1.10. DNA barcode và ứng dụng của DNA barcode để nhận dạng và phân biệt loài
• 1.11. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác định quan hệ tiến hóa
• 1.12. Đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật
• 1.13. Các nghiên cứu về hệ thống học, DNA barcodes của các loài thuộc chi Paramignya và loài
• 1.14. Nhân giống loài Xáo tam phân
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh của các mẫu thu thập
• 2.3. Vật liệu cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro mẫu Xáo tam phân
• 2.4. Các chỉ thị phân tử DNA
• 2.5. Nội dung nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu và xây dựng bản đồ phân bố
• 2.6.2. Phương pháp mô tả hình thái
• 2.6.3. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số
• 2.6.4. PCR nhân các vùng microsatellite bằng các chỉ thị SSR
• 2.6.5. PCR nhân các vùng chỉ thị phân tử
• 2.6.6. Giải trình tự và đăng ký trình tự
• 2.6.7. Phương pháp phân tích dữ liệu trình tự
• 2.6.8. Phương pháp nhân giống in vitro cây Xáo tam phân
• 2.6.9. Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân
• 2.6.10. Ảnh hưởng của nền môi trường tới khả năng sinh trưởng Xáo tam phân trong điều kiện in vitro
• 2.6.11. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân
• 2.6.12. Ảnh hưởng của nhóm cytokinins và auxin tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân
• 2.6.13. Ảnh hưởng của nhóm auxin tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân
• 2.6.14. Phương pháp bố trí và xử lý thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Khảo sát sự phân bố và đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya tại Khánh Hòa và Lâm Đồng
• 3.2. Khảo sát thành phần loài và sự phân bố của các mẫu nghiên cứu
• 3.3. Đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya
• 3.4. Tách chiết DNA tổng số, nhận dạng loài thông qua chỉ thị barcode
• 3.5. Xác định đa dạng di truyền của các mẫu Xáo tam phân dựa vào chỉ thị SSR
• 3.6. Nghiên cứu chỉ thị DNA và nhận dạng loài
• 3.6.1. PCR và xác định trình tự các vùng chỉ thị DNA
• 3.6.2. Nhận dạng loài dựa vào công cụ MEGABLAST
• 3.6.3. Xây dựng chỉ thị DNA để nhận dạng Xáo tam phân P.
• 3.6.4. Khảo sát dữ liệu DNA mã vạch của các loài thuộc chi Paramignya
• 3.6.5. Xây dựng cơ sở dữ liệu các trình tự thuộc chi Paramignya
• 3.6.6. So sánh các trình tự để nhận dạng và phân biệt Xáo tam phân
• 3.6.7. Xây dựng cây tiến hóa giữa các loài
• 3.6.8. Xây dựng chỉ thị phân tử để nhận dạng Xáo tam phân
• 3.6.9. Đánh giá chỉ thị phân tử dựa vào phân tích khoảng cách mã vạch
• 3.7. Nhân giống in vitro Xáo tam phân
• 3.7.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân
• 3.7.2. Nghiên cứu xác định môi trường nền phù hợp với nhân nhanh in vitro Xáo tam phân
• 3.7.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân
• 3.7.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinins tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Luận án tiến sĩ

Luận án tiến sĩ này tập trung vào việc nghiên cứu chỉ thị phân tử và nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya Trimera). Nghiên cứu được thực hiện bởi tác giả Phí Thị Cẩm Miện dưới sự hướng dẫn của PGS. Chu Hoàng Hà. Luận án đã đưa ra các kết quả trung thực và chưa từng được công bố trước đây, góp phần quan trọng vào việc bảo tồn và phát triển loài cây dược liệu này.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của luận án là xây dựng chỉ thị phân tử để nhận dạng chính xác loài Xáo tam phân và phát triển quy trình nhân giống in vitro nhằm bảo tồn loài này. Cụ thể, nghiên cứu hướng đến việc đánh giá sự phân bố, xác định mối quan hệ di truyền, và xây dựng cơ sở dữ liệu DNA cho loài Paramignya Trimera.

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Luận án có ý nghĩa khoa học lớn khi cung cấp dữ liệu trình tự nucleotide của các đoạn gen ITS, matK, và rbcL, đăng ký vào ngân hàng GenBank. Về mặt thực tiễn, nghiên cứu giúp quy hoạch và phát triển nguồn gen Xáo tam phân, đồng thời xây dựng quy trình nhân giống in vitro hiệu quả.

II. Chỉ thị phân tử

Chỉ thị phân tử là công cụ quan trọng trong việc nhận dạng và phân biệt loài Xáo tam phân với các loài khác trong chi Paramignya. Nghiên cứu sử dụng các chỉ thị DNA như SSR, ITS, matK, và rbcL để xác định đa dạng di truyền và mối quan hệ tiến hóa giữa các loài.

2.1. Ứng dụng chỉ thị phân tử

Các chỉ thị phân tử được sử dụng để xây dựng cây tiến hóa và nhận dạng loài Xáo tam phân thông qua phân tích trình tự DNA. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự khác biệt rõ rệt về trình tự nucleotide giữa Paramignya Trimera và các loài họ hàng.

2.2. Kết quả phân tích DNA

Nghiên cứu đã xác định được các vùng trình tự đặc trưng cho Xáo tam phân, giúp phân biệt loài này với các loài khác trong chi Paramignya. Điều này tạo cơ sở khoa học cho việc bảo tồn và nhân giống loài cây dược liệu quý hiếm này.

III. Nhân giống bảo tồn

Nhân giống bảo tồn là một phần quan trọng của luận án, nhằm duy trì và phát triển nguồn gen Xáo tam phân. Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro, từ việc tạo mô sẹo đến hình thành cây con hoàn chỉnh.

3.1. Quy trình nhân giống in vitro

Quy trình nhân giống in vitro bao gồm các bước khử trùng mẫu, tạo mô sẹo, và kích thích sự phát triển của chồi và rễ. Nghiên cứu đã xác định được môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp để tối ưu hóa quá trình nhân giống.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu về nhân giống bảo tồn không chỉ giúp bảo tồn loài Xáo tam phân mà còn mở ra cơ hội phát triển vùng dược liệu tập trung, đáp ứng nhu cầu sử dụng trong y học và dược phẩm.

IV. Xáo tam phân Paramignya Trimera

Xáo tam phân (Paramignya Trimera) là loài cây dược liệu quý, có giá trị cao trong y học cổ truyền và hiện đại. Nghiên cứu đã khảo sát sự phân bố, đặc điểm hình thái, và hoạt tính sinh học của loài này, đồng thời đánh giá đa dạng di truyền quần thể.

4.1. Đặc điểm sinh học

Xáo tam phân là cây thân gỗ nhỏ, phân bố chủ yếu ở các vùng núi đá tại Khánh Hòa và Lâm Đồng. Loài này có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là khả năng ức chế tế bào ung thư và bảo vệ gan.

4.2. Bảo tồn thực vật

Do nhu cầu sử dụng cao, Xáo tam phân đang đối mặt với nguy cơ cạn kiệt ngoài tự nhiên. Nghiên cứu này góp phần quan trọng vào việc bảo tồn và phát triển bền vững loài cây dược liệu này.

V. Kỹ thuật sinh học

Kỹ thuật sinh học được áp dụng rộng rãi trong luận án, từ việc tách chiết DNA, PCR, đến giải trình tự và phân tích dữ liệu. Các kỹ thuật này giúp xác định chính xác loài Xáo tam phân và phát triển quy trình nhân giống hiệu quả.

5.1. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp như tách chiết DNA tổng số, PCR nhân các vùng chỉ thị phân tử, và giải trình tự DNA. Các kỹ thuật này giúp xác định đa dạng di truyền và mối quan hệ tiến hóa giữa các loài trong chi Paramignya.

5.2. Ứng dụng công nghệ sinh học

Các kỹ thuật sinh học hiện đại đã góp phần quan trọng vào việc bảo tồn và phát triển loài Xáo tam phân, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực dược liệu và bảo tồn thực vật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu tổng quát.

Mục tiêu cụ thể. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài. Đối tượng nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Giới thiệu chung về chi Paramignya. Đặc điểm sinh học của chi Paramignya. Một số thành phần hóa học và hoạtt tính sinh học chi Paramignya.

Cây Xáo tam phân (P. trimera), phân loại, đặc điểm sinh học và hoạt chất sinh học. Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại Xáo tam phân. Đặc điểm thực vật học của cây Xáo tam phân tại Việt Nam.

Nghiên cứu về hoạt tính sinh dược học của cây Xáo tam phân. Các phương pháp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật. DNA barcode và ứng dụng của DNA barcode để nhận dạng và phân biệt loài.

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác định quan hệ tiến hóa. Đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật. Các nghiên cứu về hệ thống học, DNA barcodes của các loài thuộc chi Paramignya và loài P. Nhân giống loài Xáo tam phân.

Nhân giống Xáo tam phân trong tự nhiên .49 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh của các mẫu thu thập.

Vật liệu cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro mẫu Xáo tam phân. Các chỉ thị phân tử DNA. Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp điều tra, thu thập mẫu và xây dựng bản đồ phân bố. Phương pháp mô tả hình thái. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số. PCR nhân các vùng microsatellite bằng các chỉ thị SSR.

PCR nhân các vùng chỉ thị phân tử. Giải trình tự và đăng ký trình tự. Phương pháp phân tích dữ liệu trình tự. Phương pháp nhân giống in vitro cây Xáo tam phân.

Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân. Ảnh hưởng của nền môi trường tới khả năng sinh trưởng Xáo tam phân trong điều kiện in vitro. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân. Ảnh hưởng của nhóm cytokinins và auxin tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân.

Ảnh hưởng của nhóm auxin tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân. Phương pháp bố trí và xử lý thí nghiệm .69 v CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Khảo sát sự phân bố và đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya tại Khánh Hòa và Lâm Đồng.

Khảo sát thành phần loài và sự phân bố của các mẫu nghiên cứu. Đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya. Tách chiết DNA tổng số, nhận dạng loài thông qua chỉ thị barcode. Xác định đa dạng di truyền của các mẫu Xáo tam phân dựa vào chỉ thị SSR.

Nghiên cứu chỉ thị DNA và nhận dạng loài. PCR và xác định trình tự các vùng chỉ thị DNA. Nhận dạng loài dựa vào công cụ MEGABLAST. Xây dựng chỉ thị DNA để nhận dạng Xáo tam phân P.

Khảo sát dữ liệu DNA mã vạch của các loài thuộc chi Paramignya. Xây dựng cơ sở dữ liệu các trình tự thuộc chi Paramignya. So sánh các trình tự để nhận dạng và phân biệt Xáo tam phân. Xây dựng cây tiến hóa giữa các loài.

Xây dựng chỉ thị phân tử để nhận dạng Xáo tam phân. Đánh giá chỉ thị phân tử dựa vào phân tích khoảng cách mã vạch. Nhân giống in vitro Xáo tam phân. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân.

Nghiên cứu xác định môi trường nền phù hợp với nhân nhanh in vitro Xáo tam phân. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinins tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân .131 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.132 TÀI LIỆU THAM KHẢO .141 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABDG : Automatic Barcode Gap Discovery AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism BAP : 6-benzylaminopurine hoặc benzyladenine BI : Bayesia interference CSDL : Cơ sở dữ liệu CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide CV : Coefficient of Variation DNA : Deoxyribonucleic acid IAA : Acid indoleacetic IBA : 3-Indolebutyric acid ITS : Internal transcribed spacer ITS : Internal transcribed spacer KC : Knudson C medium LSD : Least significant differential LSD0.05 : Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 0.05 matK : Maturase K MS : Murashige & Skoog medium MSA : Multiple sequence alignment NCBI : National Center for Biotechnology Information P. trimera : Paramignya trimera PCR : Polemerase Chain Reaction RAPD : Random Amplified Polymorphic rbcL : Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SSR : Simple sequence Repeat STS : Silver thiosulfate TDZ : Thidiazuron WPM : Woody Plant Medium-Lloyd G, Mc Cown B, 1980 α - NAA : Axit α-naphtyl axetic 2.4-Dichlorophenoxyacetic vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.

Tổng hợp các chỉ thị phân tử sử dụng đối với genome lục lạp. Bảng mẫu sử dụng tách chiết DNA, phân tích quan hệ phát sinh. Trình tự mồi SSR sử dụng. Trình tự mồi ITS, matK và rbcL.

Tổng hợp vị trí thu thập các mẫu tại Khánh Hòa và Lâm Đồng. Số allen và hệ số PIC của 31 cặp mồi SSR. Tổng hợp thông tin về DNA barcode của các loài thuộc chi Paramignya trong hệ thống BOLD. Tổng hợp các dữ liệu trình tự của các loài thuộc chi Paramignya.

Tổng hợp các vùng trình tự ITS, matK và rbcL của các trình tự. Khoảng cách trong loài và giữa loài của các dữ liệu trình tự. Ảnh hưởng của dung dịch nano bạc tới khả năng tạo mẫu sạch Xáo tam phân. Ảnh hưởng của dung dịch Johnson tới khả năng tạo mẫu sạch Xáo tam phân.

Ảnh hưởng sự kết hợp của dung dịch Johnson và nano bạc tới khả năng khử trùng tạo mẫu sạch Xáo tam phân. Ảnh hưởng của môi trường nền tới sự sinh trưởng, nhân nhanh Xáo tam phân. Ảnh hưởng của TDZ, IBA và 2.4 D tới khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa TDZ, IBA và 2.4D tới sự phát sinh mô sẹo IBA Xáo tam phân.

Ảnh hưởng của BA tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân. Ảnh hưởng của TDZ tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân. Ảnh hưởng của nhóm sự kết hợp giữa BA và TDZ tới khả năng phát sinh chồi Xáo tam phân. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và α-NAA tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân.

Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA và IBA tới sự phát sinh chồi Xáo tam phân. Ảnh hưởng của IBA và α-NAA tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân in vitro. Ảnh hưởng của một số loại giá thể tới khả năng sống của cây con in vitro .125 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc các hợp chất coumarin từ chi Paramignya.

Hình ảnh cây Xáo tam phân trồng tại khu thí nghiệm Khoa CNSH, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Hình ảnh lá Xáo tam phân tại Khánh Hòa, Việt Nam. Hình ảnh thân, rễ Xáo tam phân tại Khánh Hòa, Việt Nam. Hình ảnh cụm hoa cây Xáo tam phân tại xã Ninh Vân, Khánh Hòa.

Cấu tạo hình thái lá, hoa Xáo tam phân. Hình ảnh quả cây Xáo tam phân thu được tại Khánh Hòa, Việt Nam. Các phương pháp xây dựng cây tiến hóa. Sơ đồ xây dựng chỉ thị DNA đặc thù.

Sơ đồ xây dựng CSDL DNA barcode. Quy trình xác định chỉ thị phân tử DNA barcode. Bản đồ địa bàn nghiên cứu vị trí thu thập mẫu và tình trạng phân bố các loài P. trimera và một số loài khác thuộc chi Paramignya.

Bản đồ địa bàn nghiên cứu gồm vị trí điểm lấy mẫu và phân bố của các loài Xáo tam phân Paramignya trimera. Bản đồ địa bàn nghiên cứu gồm vị trí điểm lấy mẫu và phân bố của các loài. Đặc điểm hình thái của Paramignya trimera (Oliv. Đa dạng về hình thái lá của cây Xáo tam phân P.

Đặc điểm lá và cành của P. andamanica King thu thập tại Khánh Hòa, Việt Nam. Đặc điểm hình thái của P. Đặc điểm hình thái thân, lá của P.

Đặc điểm lá của P. rectispinosa thu thập tại Cát Tiên, Lâm Đồng. DNA tổng số của các mẫu P.trimera và 4 loài thuộc chi Paramignya. Kết quả phân tích đa hình các mẫu Paramignya bằng chỉ thị SSR của một số cặp mồi điển hình.

Mối quan hệ di truyền của các loài thuộc chi Paramignya. Ma trận khoảng cách giữa các mẫu phân tích. Kết quả nhân vùng ITS, matK và rbcL ở các mẫu Paramignya. Kết quả Megablast sử dụng trình tự truy vấn ITS của P.

Cây quan hệ tiến hóa của P. trimera với các loài họ hàng. Kết quả Megablast sử dụng trình tự truy vấn matK của P. Cây quan hệ tiến hóa của P.

trimera với các loài họ hàng phân tích bằng trình tự matK. Kết quả Megablast với trình tự truy vấn rbcL của P. Cây quan hệ tiến hóa của P. trimera với các loài họ hàng phân tích bằng trình tự rbcL.

Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự ITS sử dụng thuật toán ML của chương trình MegaX. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự ITS sử dụng chương trình BEAST. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự matK sử dụng thuật toán ML của chương trình MegaX. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự matK sử dụng chương trình BEAST.

Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự rbcL sử dụng chương trình MegaX. Mối quan hệ tiến hóa giữa các loài thuộc chi Paramignya dựa vào phân tích trình tự rbcL sử dụng chương trình BEAST. Phân tích các vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P. trimera trong chuỗi trình tự ITS.

Phân tích các vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P. trimera trong chuỗi trình tự matK. Phân tích các vùng/vị trí nucleotide khác biệt đặc trưng cho P. trimera trong chuỗi trình tự rbcL.

Biểu đồ khoảng cách Histogram và ranked pairwise giữa các trình tự bằng chương trình ABGD. Hình ảnh mẫu Xáo tam phân sau khử trùng.