CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về nấm Cordyceps sinensis 1. Nguồn gốc và vòng đời phát triển Đầu thế kỉ XIV, học giả người Italia, Pier Andrea Saccarado đặt tên cho một loài nấm tìm thấy ở Tây Tạng, Trung Quốc là “Cordyceps sinensis”. Tên Cordyceps có nguồn gốc từ tiếng Latin bao gồm hai từ là “cord” và “ceps” có nghĩa tương ứng là “thân” và “đầu”.
Các từ Latin kết hợp với nhau mô tả chính xác quá trình xâm nhập của nấm Cordyceps. Cordyceps là loài nấm nội ký sinh trên ấu trùng và các cá thể trưởng thành của nhiều loài côn trùng khác nhau [1]. Năm 1878, các nhà khoa học đã phát hiện ra nấm này ký sinh trên ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi Thitarodes. Thường dễ gặp nhất ở sâu non loài T.
Ngoài ra, hơn 50 loài khác thuộc họ Hepialidae (Lepidoptera) cũng bị nấm thuộc chi Cordyceps ký sinh. Vào cuối mùa thu, các chất trên biểu bì của sâu non họ ngài đêm tương tác với các bào tử nấm và hình thành các sợi nấm, các sợi nấm đâm sâu vào ấu trùng. Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát triển mạnh và gây chết vật chủ, sau đó hình thành quả thể, phát triển và chui ra khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu vật chủ. Do đó nhiều người gọi là nấm “Đông trùng hạ thảo” bởi vì mùa đông nấm sống trong cơ thể côn trùng, mùa hè phát triển ra ngoài cơ thể giống như cây cỏ [2].
Tại Trung Quốc C. sinensis có tên gọi là “DongChongXiaCao”, tại Nhật Bản C. sinensis có tên gọi là “Tockukaso” đều có nghĩa là Đông trùng hạ thảo [3] (hình 1. Năm 2007 Sung và cộng sự đề nghị đổi tên C.
sinensis thành Ophiocordyceps sinensis [4]. Dẫu vậy, danh pháp C. sinensis vẫn thường được các nhà nấm học sử dụng trong các báo cáo khoa học như tên đồng danh của O. Hiện nay đã ghi nhận hơn 750 loài Cordyceps trên thế giới như C.
Tuy nhiên, cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất về 2 loài Đông trùng hạ thảo C. sinensis và Nhộng trùng hạ thảo C. (A) Vòng đời phát triển và (B) quả thể nấm C. sinensis [6] Năm 2010, một nhóm các nhà nấm học của Mỹ, Thái Lan và Hàn Quốc nghiên cứu và sắp xếp lại hệ thống của nhóm nấm Cordyceps.
Theo kết quả nghiên cứu này, toàn bộ các loài thuộc nhóm nấm Cordyceps được phân chia lại thuộc về 3 họ: họ Clavicipitaceae với các chi Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella; họ Cordycipitaceae với chi Cordyceps; họ Ophiocordycipitaceae với 2 chi Cordyceps và Elaphocordyceps [7] (hình 1. Phân loại Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Ophiocordycipitaceae Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps sinensis (tên đồng danh Ophiocordyceps sinensis) Phức hợp ký sinh của nấm và vật chủ thường được tìm thấy ở thảo nguyên với độ cao 3000 – 5000 m so với mực nước biển. Chúng phân bố chủ yếu ở Tây Tạng, Thanh Hải, Tứ Xuyên, Vân Nam, Cam Túc (Trung Quốc), Hymalaya và Ấn Độ… đặc biệt phong phú và đa dạng trong rừng ôn đới và nhiệt đới ẩm [8]. Thành phần hoạt chất có hoạt tính sinh học Năm 1964, y học cổ truyền Trung Quốc đã sử dụng C.
sinensis như một loại dược liệu dùng để điều trị các rối loạn về hô hấp, thận, gan, các bệnh về tim mạch, yếu sinh lý và cao huyết áp. Bên cạnh đó, nghiên cứu hiện đại cũng đã chứng minh C. sinensis có các hoạt tính như điều hòa miễn dịch, kháng oxy hóa, ức chế hình thành khối u, kháng khuẩn, kháng nấm và kháng di căn. Những tác dụng có lợi đó là do sự đa dạng về thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide, cordycepin, nucleoside, adenosine, hydroxyethyl - adenosine, acid cordycepic, sterol, acid amin, vitamin và nguyên tố vi lượng… (Bảng 1.
Trong đó, nhóm hoạt chất polysaccharide được nghiên cứu nhiều bởi chúng có hoạt tính sinh học cao như kháng ung thư, kháng di căn, kháng oxy hóa, điều hòa hệ thống miễn dịch, giảm đường huyết, giảm cholesterol trong máu [10]. Các hoạt chất chính và dược tính của chúng trong C. sinensis Nhóm chất Hoạt tính Kháng ung thư; làm suy giảm các kích thích của tế bào thần kinh hệ thần kinh trung ương; ức chế phóng thích Nucleoside các chất dẫn truyền thần kinh khác nhau; chống co giật; kích thích sự phát triển của sợi thần kinh in vitro và trong hệ thống thần kinh trung ương người Kháng oxy hóa, kháng ung thư; tăng miễn dịch, hạ Polysaccharide đường huyết; kháng viêm và điều hòa miễn dịch. Gây độc tế bào, kháng virus và tác dụng kháng loạn Ergosterol nhịp tim; giảm globulin A trong bệnh lý thận, tiền chất của vitamin D Mannitol Lợi tiểu, kháng ho và kháng oxy hóa Peptide Kháng ung thư và tiềm năng miễn dịch Cordycepin Kháng phân bào, kháng ung thư 6 1.
Nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo nấm C. sinensis Hiện nay, C. sinensis khan hiếm do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng của con người, do đó đã có nhiều nỗ lực tìm ra phương pháp nuôi cấy nhân tạo C. sinensis thay thế nguồn nấm tự nhiên bởi vì loài nấm này rất khó thu nhận do kích thước nhỏ, thời điểm tăng trưởng chậm và tùy thuộc rất nhiều vào điều kiện khí hậu.
Nghiên cứu cho thấy nấm C. sinensis có thể phân lập từ tự nhiên, sau đó được nuôi cấy quy mô lớn bằng công nghệ lên men - những giá trị sinh học của sợi nấm nuôi cấy nhân tạo tương tự như những loài Cordyceps tìm thấy trong tự nhiên. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự tăng trưởng sợi nấm phụ thuộc vào chủng và điều kiện nuôi cấy, do đó, kiểm soát được những yếu tố nuôi cấy sẽ kiểm soát được chất lượng sản phẩm. Nguồn carbon là thành phần dinh dưỡng ảnh hưởng nhất đến quá trình sinh sống của nấm, cần cho nấm tổng hợp bộ khung tế bào, biến dưỡng và tạo năng lượng.
Các loài nấm khác nhau có nhu cầu sử dụng các nguồn carbon khác nhau. Trong khi đó, nguồn nitơ là một trong những thành phần chính có vai trò quan trọng trong điều hòa sinh học, chi phối sự phát triển của tế bào, hình thành các sản phẩm và enzyme tế bào. Nấm có thể sử dụng các nguồn nitơ khác nhau để sinh trưởng như ammonium, nitrate, peptide và các acid amin. Ngoài ra nấm cũng sử dụng một số khoáng chất và vitamin để tăng trưởng [11].
Hiện nay, hai phương pháp nuôi cấy nấm được sử dụng chủ yếu là nuôi cấy lỏng và nuôi cấy bán rắn: Phương pháp nuôi cấy lỏng: một số nghiên cứu đã được báo cáo trong vòng 10 năm qua nuôi cấy lỏng sợi nấm của C. sinensis là một trong những chiến lược hiệu quả để tăng tổng hợp các hợp chất sinh học mong muốn vì dễ dàng theo dõi các điều kiện nuôi cấy và tối ưu hóa các yếu tố lý hóa môi trường (Bảng 1. Phương pháp nuôi cấy chủ yếu sử dụng tại Trung Quốc là nuôi cấy lỏng, trong đó một lượng mô nhỏ Cordyceps được cấy vào môi trường lỏng vô trùng. Các sợi nấm Cordyceps được thu hoạch bằng cách lọc dịch nuôi cấy, sau đó sấy khô và nghiền thành bột mịn.
Sau khi sấy khô, bột có thể sử dụng trực tiếp, hoặc tiếp tục xử lý bằng nước nóng hay một số dung môi khác, các cao chiết ở dạng lỏng hoặc được sấy khô. Phương pháp này tạo ra sản phẩm chất lượng tốt, quy mô lớn và dễ kiểm soát các thông số tăng trưởng, tạo ra sản phẩm đồng nhất có chất lượng ít biến đổi [13]. Nghiên cứu nuôi cấy lỏng sợi nấm của C. sinensis Giống Thành phần Nhiệt pH Phương Thời Sinh EPS Tham môi trường độ pháp gian khối (g/L) khảo o ( C) (ngày) (g/L) C.
Saccharose 20, 20 4,0 Bể 16 20,9 4,1 Kim sinensis bột bắp 25, khuấy và CaCl2 0,78, 150 rpm Yun MgSO4. Saccharose 2 25 - Bể 5 54,0 28,4 Cha và sinensis %, cao nấm khuấy cộng 16 men 0,9 %, 150 rpm sự K2HPO4 0,3 %, (2007) CaCl2 0,4 % (w/v) C. Glucose 40, 22 - 4,4 Bể 7 23,2 3,4 Leung sinensis peptone 5, cao 25 khuấy và Cs- nấm men 5, 150 rpm cộng HK1 KH2PO4 1, sự MgSO4.7H2O (2007) 0,5 (g/L), NH4Cl 10 mmol/l C. Saccharose 26 7,0 Bể 4 12,3 24,5 Wu, sinensis 20, cao nấm khuấy Chen men 2, 130 rpm và Hao KH2PO4 4 (2009) (g/L) C.
Glucose 30, - Bể 25,0 2,8 Yin và sinensis peptone 15, - khuấy cộng KH2PO4 3, sự MgSO4.7H2O (2013) 1,5, khoai tây 200 (g/L) Phương pháp nuôi cấy bán rắn: gần đây quả thể nấm C. sinensis đã được nuôi cấy thành công bởi các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ. Nấm được đưa vào môi trường bán rắn đã khử trùng, thường là hạt ngũ cốc hoặc hỗn hợp ngũ cốc, ấu trùng 8 côn trùng (phần còn lại của con tằm), với độ ẩm tương đối 45 – 50 %. Mặc dù nuôi cấy nấm C.
sinensis trên môi trường bán rắn giải quyết được những vấn đề thường gặp so với nuôi cấy trên môi trường lỏng như sự thất thoát một số hợp chất sinh học vào môi trường nuôi cấy, tuy nhiên, thời điểm phát triển của sợi nấm C. sinensis trên môi trường bán rắn là rất chậm và hiệu quả kinh tế kém [14]. Nuôi cấy lỏng thuận lợi hơn cho sợi nấm phát triển mạnh vì nuôi cấy trong không gian nhỏ gọn, thời điểm ngắn hơn và giảm tỷ lệ nhiễm [5]. Vì vậy, nuôi cấy nhân tạo sợi nấm C.
sinensis trong môi trường lỏng là phương pháp có tiềm năng để nhân sinh khối nấm dược liệu này. Tổng quan về polysaccharide ngoại bào – exopolysaccharide của nấm C. Giới thiệu chung về polysaccharide Polysaccharide là những cấu trúc carbohydrate cao phân tử, được tạo thành từ những đơn vị đường đơn lặp đi lặp lại, liên kết với nhau bằng các cầu nối glucoside. Những cấu trúc này thường có dạng mạch thẳng hoặc mạch nhánh.
Chúng được tổng hợp ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình sống của sinh vật [15]. Polysaccharide thường có màu nâu, không mùi, đa số tan tốt trong nước nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ như methanol, benzen, pyridin, chloroform và hexan. Các polysaccharide có độ hòa tan khác nhau, một số dễ hòa tan trong nước lạnh, số khác hòa tan tốt trong nước nóng, tuy nhiên có những polysaccharide không hòa tan trong nước. Polysaccharide của vi sinh vật được chia thành 3 nhóm chính dựa vào vị trí của chúng trong tế bào: polysaccharide nội bào cung cấp nguồn carbon và năng lượng cho tế bào; polysaccharide vách tế bào chứa peptidoglycan, acid teichoic và lipopolysaccharide.
EPS là những polysaccharide được tổng hợp trong tế bào rồi tiết ra môi trường xung quanh, được công bố đầu tiên vào năm 1861 bởi Pasteur, mô tả như là các chất chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp chủ yếu từ cuối giai đoạn tăng trưởng đến ổn định của vi sinh vật.