Tài liệu: Lựa chọn quy trình tách chiết dna tổng số và bước đầu phân tích

Nghiên cứu quy trình tách chiết DNA và phân tích đa dạng di truyền dây thường xuân Hedera nepalensis K Koch tại Việt Nam qua chỉ thị GBSSI.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Thảo
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Đoàn Long
• Trường học: Đại Học Quốc Gia Hà Nội, Khoa Y Dược
• Chuyên ngành: Dược Học
• Đề tài: Lựa Chọn Quy Trình Tách Chiết DNA Tổng Số Và Bước Đầu Phân Tích Đa Dạng Di Truyền Nguồn Gen Dây Thường Xuân (Hedera Nepalensis K.Koch) Ở Việt Nam Dựa Trên Chỉ Thị GBSSI
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Khái niệm và tầm quan trọng của tách chiết DNA tổng

Tách chiết DNA tổng là một kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng trong nghiên cứu di truyền và phân tích đa dạng gene. Quá trình này nhằm tách chiết toàn bộ DNA từ các mô tế bào của sinh vật, đặc biệt là từ các mẫu thực vật. DNA tổng số được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về phân loại học sinh vật, phân tích di truyền và xác định đặc điểm gen. Tầm quan trọng của tách chiết DNA tổng nằm ở việc cung cấp vật liệu gen sạch sẽ, nồng độ cao để phục vụ cho các phân tích tiếp theo như phản ứng PCR, giải trình tự gen, và phân tích đa dạng di truyền. Đối với những nghiên cứu về các loài thực vật như Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis), việc lựa chọn quy trình tách chiết DNA phù hợp là yếu tố quyết định thành công của toàn bộ dự án nghiên cứu.

1.1. Định nghĩa tách chiết DNA tổng

Tách chiết DNA tổng là quá trình cô lập DNA từ tất cả các nguồn trong tế bào bao gồm DNA핵 (từ nhân) và DNA ty thể. Phương pháp này sử dụng các chất hoá học như CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) hoặc các kit thương mại để phá vỡ màng tế bào và tách DNA ra khỏi các protein, lipid và các tạp chất khác. Kết quả là dung dịch DNA thuần khiết, sạch sẽ có nồng độ thích hợp để sử dụng trong các phân tích tiếp theo.

1.2. Ứng dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử

DNA tổng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu: phân tích đa dạng di truyền, nghiên cứu gen GBSSI (Granule-Bound Starch Synthase), xác định trình tự gen ITS, và xây dựng cây phát sinh loài. Trong nghiên cứu về Hedera nepalensis, DNA tổng được dùng để phân tích độ đa dạng gen dựa trên chỉ thị GBSSI.

II. Các phương pháp tách chiết DNA tổng từ thực vật

Có nhiều phương pháp tách chiết DNA được áp dụng cho các mẫu thực vật, mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm khác nhau. Phương pháp CTAB (Mini CTAB hoặc CTAB cải tiến) là một trong những kỹ thuật truyền thống hiệu quả cao, được phát triển bởi Sanghai-Maroof et al. (1984) và sau đó cải tiến bởi Elias et al. (2004). Ngoài ra, còn có các kit Qiagen DNeasy Plant Mini Kit và Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit là những công cụ hiện đại giúp quá trình tách chiết trở nên đơn giản hơn. Lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào loại mẫu, số lượng mẫu, chi phí và yêu cầu về chất lượng DNA. Mỗi phương pháp đều có quy trình riêng, từ chuẩn bị mẫu đến thu nhận DNA cuối cùng.

2.1. Phương pháp CTAB truyền thống

Phương pháp CTAB sử dụng chất CTABBromide để tạo các phức hợp với DNA, giúp tách DNA ra khỏi các tạp chất. Quy trình bao gồm: cắt mẫu lá, nghiền trong nước đá, thêm dung dịch CTAB, giữ ở nhiệt độ cao, thêm chloroform, ly tâm, kết tủa DNA bằng isopropanol. Phương pháp này hiệu quả nhưng tốn thời gian và sử dụng nhiều hóa chất độc hại.

2.2. Phương pháp sử dụng kit thương mại

Kit Qiagen và Thermo Scientific cung cấp quy trình nhanh gọn với nguyên tắc hoạt động dựa trên màng silica. Mẫu được xử lý bằng các dung dịch chuyên biệt, DNA kết dính trên màng silica, rửa sạch và giải phóng DNA. Phương pháp này cho kết quả tốt, tiết kiệm thời gian và an toàn hơn so với CTAB truyền thống.

III. Tiêu chí đánh giá chất lượng DNA tách chiết

Chất lượng DNA tổng được tách chiết là yếu tố quan trọng quyết định thành công của các phân tích tiếp theo. Các tiêu chí đánh giá chất lượng bao gồm: nồng độ DNA, được đo bằng OD260 (mật độ quang học ở bước sóng 260nm); chỉ số OD260/280 cho biết mức độ nhiễm protein trong mẫu; tính nguyên vẹn của DNA được kiểm tra bằng điện di gel agarose. DNA chất lượng cao phải có nồng độ đủ cao (thường > 50 ng/μL), chỉ số OD260/280 trong khoảng 1.8-2.0, và không bị phân hủy. Khi sử dụng DNA trong phản ứng PCR để nhân dòng gen GBSSI hoặc các gen khác, DNA phải đáp ứng các tiêu chuẩn này để đảm bảo hiệu quả phản ứng. Việc đánh giá chất lượng DNA bằng các phương pháp hiện đại như quang phổ tử ngoại giúp xác định tính phù hợp của mẫu DNA.

3.1. Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA

Nồng độ DNA tổng được đo bằng quang phổ tử ngoại ở bước sóng 260nm. Chỉ số OD260/280 phản ánh mức độ nhiễm protein: giá trị lý tưởng từ 1.8-2.0 cho DNA thuần khiết. OD260/230 phản ánh nhiễm carbohydrate. Những mẫu DNA có OD260/280 < 1.8 không phù hợp cho các phân tích tiếp theo.

3.2. Kiểm tra tính nguyên vẹn DNA qua điện di

Điện di gel agarose là phương pháp chuẩn để kiểm tra tính nguyên vẹn của DNA. DNA nguyên vẹn tốt sẽ tạo thành một dải đơn trên gel. Nếu DNA bị phân hủy sẽ xuất hiện nhiều dải nhỏ hơn. Gel agarose 1,2% thường được sử dụng để đánh giá DNA tổng.

IV. Lựa chọn quy trình phù hợp cho nghiên cứu thực vật cụ thể

Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại thực vật, số lượng mẫu, mục đích nghiên cứu và tài nguyên khả dụng. Đối với nghiên cứu về Hedera nepalensis nhằm phân tích đa dạng di truyền dựa trên gen GBSSI, việc lựa chọn phương pháp tách chiết DNA chính xác là bước đầu tiên không thể thiếu. Nếu cần xử lý số lượng lớn mẫu và yêu cầu hiệu suất cao, các kit thương mại là lựa chọn tối ưu vì tiết kiệm thời gian và giảm biến động. Ngược lại, nếu dự án nghiên cứu có ngân sách hạn chế nhưng không quá bấp bênh về thời gian, phương pháp CTAB cải tiến có thể cho kết quả tương đương với chi phí thấp hơn. Cần tiến hành các thí nghiệm thử nghiệm trên một số mẫu để so sánh hiệu quả của các phương pháp trước khi áp dụng quy mô lớn, đảm bảo chất lượng DNA tách chiết phục vụ tốt cho các phân tích PCR và giải trình tự gen.

4.1. Yếu tố ảnh hưởng đến lựa chọn phương pháp

Các yếu tố quan trọng bao gồm: loại mô thực vật (lá, gốc, hạt), số lượng mẫu, chi phí, thời gian có sẵn, và độ phức tạp của phân tích tiếp theo. DNA tổng từ lá Hedera nepalensis cần phải đủ tinh sạch để sử dụng trong phản ứng PCR nhằm nhân dòng gen GBSSI. Mẫu lá khô là lựa chọn tốt vì dễ bảo quản và tách chiết hiệu quả.

4.2. Quy trình tối ưu cho Hedera nepalensis

Đối với nghiên cứu đa dạng di truyền của H.nepalensis, khuyến nghị sử dụng kit Qiagen hoặc CTAB cải tiến để đảm bảo chất lượng DNA cao, phục vụ tối ưu cho nhân dòng gen GBSSI và ITS qua PCR. Quy trình chuẩn hoá giúp đảm bảo tính nhất quán giữa các mẫu trong phân tích cây phát sinh loài.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, địa hình núi chiếm phần lớn giúp hình thành thảm thực vật đa dạng và phong phú. Từ xa xưa, y học cổ truyền Việt Nam đã biết sử dụng các nguồn dược liệu như là một công cụ để chữa bệnh, chăm sóc sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc sống. Do vậy, nguồn cây dược liệu quý là tài sản vô giá dùng để sản xuất thành các sản phẩm thuốc, dược liệu có giá trị kinh tế cao [7]. Chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), được ghi nhận tổng cộng có 16 loài với đặc điểm hình thái chung dạng dây leo.

Loài Dây Thường Xuân có tên khoa học là Hedera nepalensis K.Koch được báo cáo xuất hiện tại một số vùng núi cao Việt Nam, chứa hai hợp chất chính có tác dụng chống ung thư là hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A [36].nepalensis đã được nghiên cứu về tác dụng dược lý, cụ thể có khả năng chống lại một số bệnh như: đái tháo đường, oxy hóa, nhiễm khuẩn, ung thư,. Với tiềm năng như vậy, song đến nay các nghiên cứu về H.nepalensis tương đối ít. Chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân ở Việt Nam nào được tiến hành, trong khi nhu cầu phát triển thuốc có nguồn gốc dược liệu trên thế giới và ở Việt Nam nói chung đang ngày một tăng cao. Công tác thu thập, bảo tồn, đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen cây trồng là bước nghiên cứu quan trọng quyết định tới thành công trong chọn tạo giống.

Những hiểu biết đầy đủ về sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của nguồn gen Dây Thường Xuân thực sự cần thiết trong công tác bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý. Sự nghèo nàn trong mô tả đánh giá nguồn gen là cản trở chính trong công tác chọn tạo giống. Hiện nay, những tiến bộ di truyền phân tử hỗ trợ đắc lực cho công tác đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn gen dược liệu, nhiều phương pháp phân tích đã được sử dụng trong các nghiên cứu đa dạng di truyền như: giải trình tự, RFLP, RAPD để phân tích minisatellites và phân tích đa hình hệ gen ty thể, hệ gen nhân,…[12]. Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-bound starch synthase, GBSSI) là chỉ thị DNA đã được sử dụng thành công để xây dựng cây phát sinh chủng loại của họ Araliaceae ở châu Á [39].

Nhưng chỉ thị GBSSI có phải là chỉ thị tốt để đánh giá đa dạng di truyền loài Dây Thường Xuân Việt Nam là một câu hỏi chưa có lời giải. Để có thêm thông tin di truyền của loài này, bước đầu tiên và cũng rất quan 1 trọng là tách chiết được DNA tổng số từ tế bào một cách hiệu quả. Có nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu thực vật được công bố nhưng chưa có nghiên cứu nào đánh giá được phương pháp nào là hiệu quả nhất đối với mẫu lá khô Dây Thường Xuân. Vì vậy, vấn đề đặt ra hiện nay là cần nghiên cứu được quy trình tách chiết DNA tổng số cho sản phẩm có chất lượng tốt làm nguyên liệu cho phản ứng PCR, cung cấp những thông tin và hiện trạng di truyền của loài này góp phần vào chiến lược bảo tồn, khai thác bền vững nguồn dược liệu.

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị GBSSI” với 2 mục tiêu như sau: 1. Xác định được quy trình tách chiết DNA tổng số có hiệu quả từ mẫu lá khô của loài Dây Thường Xuân. Dựa vào giải trình tự gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI để bước đầu xác định được tính đa dạng di truyền của nguồn gen Dây Thường Xuân thu nhập tại các tỉnh vùng núi phía Bắc Việt Nam nhằm phục vụ cho việc khai thác, quản lý bền vững nguồn cây dược liệu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Đa dạng di truyền 1. Khái niệm Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là sự giàu có về nguyên liệu di truyền trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường. Do vậy, đa dạng sinh học bao gồm 3 cấp độ: đa dạng gen, đa dạng loài và đa dạng hệ sinh thái. Đa dạng di truyền là đa dạng ở cấp độ phân tử, đề cập đến sự biến đổi các đặc điểm di truyền giữa các cá thể trong loài và cả trong quần thể.

Mỗi loài có chứa những gen riêng biệt thể hiện đặc tính riêng của nó như một cách để các quần thể có thể thích nghi được với môi trường sống thay đổi. Với các áp lực như: chọn lọc nhân tạo, môi trường sống khắc nhiệt,… một số cá thể trong một quần thể sẽ có cơ hội cao hơn trong việc sở hữu những biến dị alen phù hợp với môi trường giúp duy trì nòi giống có alen đó trong cơ thể. Quần thể đó sẽ tiếp tục có thêm nhiều thế hệ nhờ sự thành công của những cá thể này. Vì vậy, đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên sự khác biệt của các cá thể trong quần thể.

Đa dạng sinh học dù trong phạm vi một loài hay giữa các loài và các hệ sinh thái với nhau thì cũng đều xuất phát từ đa dạng di truyền. Và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất về sự khác biệt giữa các loài. Tuy nhiên, đa dạng di truyền vẫn chưa được quan tâm đúng mức mặc dù các loại đa dạng này chính là nền tảng cho sự đa dạng của sinh giới [4]. Phân loại học sinh vật Phân loại học sinh vật là sự sắp xếp các sinh vật theo các đơn vị phân loại (taxon) phù hợp dựa trên những đặc điểm giống nhau của chúng.

Đồng thời, hệ thống phân loại có thể giúp dự đoán được vị trí của sinh vật trong hệ thống phân loại, giúp ta hiểu rõ được quá trình tiến hóa của sinh vật. Một ý nghĩa thực tiễn quan trọng khác là nhờ có hệ thống phân loại với hệ thống danh pháp khoa học đặt cho sinh vật đã giúp tránh được nhầm lẫn vì nhiều sinh vật mang tên dân gian, được gọi tên khác nhau ở các vùng đất khác nhau [11]. 3 Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học.

Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan, nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích một hoặc nhiều tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp. Điều này thật sự gặp nhiều khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên ngoài. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại. Việc ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại học là một phương pháp mới: giúp xác định các loài dựa trên trình tự DNA nucleotit của một đoạn gen đặc trưng được coi như dấu hiệu đặc trưng cho loài.

Phương pháp này đặc biệt có ích trong trường hợp giải quyết các vấn đề về loài đồng hình hay nghiên cứu các biến dị. Các dữ liệu về trình tự DNA nucleotit của các loài được tạo thành hệ thống dữ liệu mã vạch DNA. Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen nhân, hệ gen của các bào quan như ty thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen như protein, enzym. Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tượng và mục đích nghiên cứu khác nhau.

Các kỹ thuật thường được sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzym), giải trình tự DNA, đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism), đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình chiều dài các đoạn DNA được nhân bản (Amplified Fragment Length Polymorphism),…[12] đã giúp giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật. Thêm vào đó các kỹ thuật này cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể, loài hay các nhóm loài. Thực trạng đa dạng sinh học tại Việt Nam Việt Nam xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học, được biết đến như một trung tâm đa dạng sinh học của thế giới với các hệ sinh thái tự nhiên phong phú và 4 đa dạng. Trong đó, đã xác định được khoảng 49.200 loài sinh vật bao gồm: khoảng 7.500 chủng vi sinh vật; 20.000 loài thực vật trên cạn và dưới nước; 10.500 loài động vật trên cạn; 2.000 loài động vật không xương sống và cá sống ở nước ngọt; khoảng trên 11.000 loài sinh vật biển.

Đặc biệt, một bộ phận lớn của các giống thực vật, động vật này có các đặc tính quý chỉ có ở nước ta, nên tiềm năng phát triển và đem lại giá trị kinh tế rất cao [6]. Với số lượng 500 loài nguồn gen dược liệu, sở hữu nhiều loài dược liệu quý, hiếm và là nơi có nguồn đa dạng sinh học phong phú, nhưng những sản phẩm từ dược liệu quý của nước ta chưa trở thành hàng hóa có giá trị cao và chưa được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng. Điển hình trong số đó là chi Hedera, phân bố trên thế giới trên 16 loài nhưng chỉ có 2 loài H.helix (Thường Xuân) được chứng minh là có tác dụng dược lý trong phòng và điều trị bệnh. Mặc dù có những tiềm năng dược lý song hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về H.nepalensis, đặc biệt là các nghiên cứu đánh giá tiềm năng đa dạng sinh học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen ở Việt Nam.