Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện Vibrio spp. trong mẫu thực phẩm thủy sản

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện nhanh vi khuẩn Vibrio spp. trong thực phẩm thủy sản, góp phần kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm.

• Tác giả: Hồ Thị Kim Ngân
• Người hướng dẫn: Ths Nguyễn Văn Minh
• Trường học: Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Vi Sinh
• Đề tài: Ứng Dụng Kỹ Thuật Pcr Phát Hiện Vibrio Spp Trong Mẫu Thực Phẩm Thủy Sản Tại Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm Tphcm
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2007
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về Vibrio trong thủy sản

Vibrio là một chi vi khuẩn gram âm hiếu khí, sống tự do trong nước mặn và nước lợ, gây ngộ độc thực phẩm thường xuyên. Các loài Vibrio nguy hiểm như Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae là tác nhân chính gây ra các vụ ngộ độc liên quan đến sản phẩm thủy sản. Theo thống kê, ô nhiễm vi sinh vật chiếm tỉ lệ cao nhất (31,8%) trong các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm. Vibrio thường hiện diện trên tôm, cua, cọc, và các sản phẩm thủy sản khác, đặc biệt khi bảo quản không đúng cách. Việc phát hiện nhanh chóng và chính xác Vibrio trong mẫu thủy sản là cần thiết để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và kiểm soát chất lượng sản phẩm.

1.1. Đặc điểm sinh học của Vibrio

Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, có véc tơ cực và peritrichous. Chủng này sản sinh enterotoxin gây tiêu chảy. Vibrio cholerae là tác nhân gây bệnh tả với độc tố cholera gây tiêu chảy nặng. Cả hai loài đều phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37°C, mặn độ 0,5-3%. Trên môi trường TCBS, chúng tạo thành khuẩn lạc vàng hoặc xanh đặc trưng.

1.2. Ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

Ngộ độc do Vibrio gây ra triệu chứng tiêu chảy, nôn, đau bụng, sốt cao. Ở những người suy giảm miễn dịch, bệnh có thể tiến triển thành septicemia nguy hiểm. Năm 2007, Việt Nam có 248 vụ ngộ độc với 7.329 người mắc và 55 người tử vong. Phát hiện sớm Vibrio trong thủy sản giúp ngăn ngừa các vụ ngộ độc hàng loạt.

II. Kỹ thuật PCR Nguyên lý và ưu điểm

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp phân tích nhanh, độ nhạy cao, được áp dụng rộng rãi trong phát hiện Vibrio. PCR hoạt động dựa trên nguyên lý nhân bản đoạn DNA đặc hiệu qua các chu kỳ biến tính-kết dính-tổng hợp. So với phương pháp truyền thống cần 24-48 giờ, PCR phát hiện Vibrio chỉ mất 2-4 giờ. Phương pháp này sử dụng cặp primer đặc hiệu nhắm vào các gen đại diện của Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae. Kết quả được xác nhận qua điện di gel agarose, cho phép đánh giá nhanh chóng chất lượng mẫu thủy sản. PCR định tính Vibrio có độ đặc hiệu cao, không bị ảnh hưởng bởi các vi khuẩn nhiễm tạp.

2.1. Các bước thực hiện phản ứng PCR

Bước 1: Chuẩn bị mẫu - Mẫu thủy sản được cấy vào môi trường nước muối peptonated, nuôi cấy 8 giờ. Bước 2: Trích chiết DNA - Sử dụng phương pháp đun nóng hoặc kit trích chiết DNA. Bước 3: Thiết lập phản ứng - Trộn DNA mẫu, primer, Taq polymerase, dNTP, buffer. Bước 4: Chu trình PCR - Biến tính (94°C), kết dính primer (55-60°C), tổng hợp DNA (72°C) lặp 30-35 chu kỳ. Bước 5: Điện di và đọc kết quả - Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%.

2.2. Ưu nhược điểm của phương pháp PCR

Ưu điểm: Thời gian nhanh (2-4 giờ), độ nhạy cao (phát hiện tới 10²-10³ CFU/mL), độ đặc hiệu cao, không phụ thuộc vào khả năng nuôi cấy, phù hợp cho phát hiện nhanh Vibrio. Nhược điểm: Yêu cầu thiết bị máy PCR đắt tiền, nhân viên cần đào tạo chuyên môn, khó phân biệt vi khuẩn sống hay chết. Chi phí ban đầu cao nhưng hiệu quả về lâu dài rất tốt.

III. Quy trình phát hiện Vibrio bằng PCR trong thựcphẩm thủy sản

Quy trình phát hiện Vibrio bằng kỹ thuật PCR bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, trích chiết DNA, thiết lập phản ứng PCR, và xác nhận kết quả. Chuẩn bị mẫu thủy sản theo tiêu chuẩn ISO: lấy 25g mẫu, trộn với 225mL nước muối peptonated (1/10 mẫu), nuôi cấy 8 giờ ở 37°C. Trích chiết DNA từ dịch nuôi cấy sử dụng phương pháp đun nóng hoặc kit thương mại. Phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 25μL, chứa 10-50ng DNA mẫu, 1 unit Taq polymerase, buffer PCR, 200μM dNTP, 0,2-0,5μM primer. Chu kỳ nhiệt độ: biến tính 94°C/30s, kết dính 55-60°C/30s, tổng hợp 72°C/1 phút, lặp 30-35 chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% màng ethidium bromide để xác nhận.

3.1. Chuẩn bị và xử lý mẫu

Mẫu thủy sản được lấy theo tiêu chuẩn vệ sinh pháp lý, bảo quản ở 4°C. Chuẩn bị mẫu tăng sinh: Lấy 25g mẫu, thêm 225mL môi trường nước muối peptonated (pH 7,0), trộn đều trong 2 phút. Nuôi cấy ở 37°C/8 giờ cho phát hiện Vibrio. Kiểm soát chất lượng: Sử dụng chủng chuẩn dương (Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802, Vibrio cholerae O1) và âm (Staphylococcus aureus, Escherichia coli).

3.2. Xác nhận kết quả bằng điện di

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong buffer TAE. Kết quả dương tính: Xuất hiện băng DNA có độ dài đặc hiệu (Vibrio parahaemolyticus 430bp, Vibrio cholerae 569bp). Kết quả âm tính: Không xuất hiện băng hoặc có nhiễm. Nhuộm ethidium bromide, quan sát dưới UV 312nm. Độ nhạy phát hiện: Có thể phát hiện từ 10² CFU/mL trở lên, vượt trội so với phương pháp truyền thống.

IV. Ứng dụng thực tế và triển vọng phát triển

Kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Vibrio đã được áp dụng thành công tại các trung tâm phân tích thí nghiệm, cơ sở kiểm soát chất lượng thủy sản ở thành phố Hồ Chí Minh và các địa phương. Phương pháp này giúp kiểm soát chất lượng sản phẩm thủy sản, từ chối những sản phẩm nhiễm Vibrio bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Tỉ lệ phát hiện bằng PCR cao hơn phương pháp truyền thống từ 10-20%, nhất là đối với các mẫu có tải lượng vi khuẩn thấp. Trong tương lai, kỹ thuật PCR real-time sẽ cho phép định lượng tải lượng Vibrio, cung cấp thông tin chi tiết hơn. Integrating multiplex PCR giúp phát hiện đồng thời nhiều loài Vibrio nguy hiểm. Ứng dụng PCR trên các điểm kiểm dịch cảng biển và chợ hải sản sẽ nâng cao hiệu quả kiểm soát ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam.

4.1. Ứng dụng tại các cơ sở sản xuất thủy sản

Nhà máy chế biến thủy sản sử dụng PCR phát hiện Vibrio trong kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào, từng giai đoạn sản xuất, và sản phẩm cuối cùng. Thời gian phát hiện nhanh (2-4 giờ) cho phép quyết định nhanh chóng có tiêu thụ hay loại bỏ sản phẩm. Các trung tâm phân tích thí nghiệm cung cấp dịch vụ xét nghiệm Vibrio bằng PCR cho các cơ sở sản xuất, xuất khẩu thủy sản. Tiết kiệm thời gian và chi phí so với phương pháp truyền thống 24-48 giờ.

4.2. Triển vọng phát triển kỹ thuật trong tương lai

PCR real-time (qPCR) sẽ cho phép định lượng tải lượng Vibrio trong mẫu, cung cấp đánh giá rủi ro chi tiết hơn. Multiplex PCR phát hiện đồng thời nhiều loài Vibrio nguy hiểm, tối ưu hóa hiệu quả xét nghiệm. Chip điện tích sinh học (microfluidics) có thể thực hiện PCR nhanh chóng trên điểm mẫu. Ứng dụng trí tuệ nhân tạo trong phân tích kết quả điện di tự động. Mục tiêu cuối cùng là thiết lập hệ thống phát hiện nhanh Vibrio portable tại các điểm kiểm dịch cảng biển, chợ hải sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hồ Thị Kim Ngân 3 Khóa luận tốt nghiệp GVHD Nguyễn Văn Minh 1. KHÁI NIỆM VỀ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM [4] Ngộ độc thực phẩm thường được hiểu là các triệu chứng gây ra bởi độc tố tiết ra từ các vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm. Nhiễm bệnh do vi sinh vật trong thực phẩm là trường hợp nhiễm bệnh do ăn phải thức ăn có chứa vi sinh vật gậy bệnh. Tuy nhiên hiện nay, khái niệm ngộ độc thực phẩm còn bao gồm trường hợp thức ăn có chứa vi sinh vật gây bệnh hiện diện ở nồng độ rất thấp trong nguyên liệu hay nhiễm vào thực phẩm trong quá trình chế biến hay bảo quản, các vi sinh vật hay độc tố của chúng có thể tăng lên nhanh chóng đến mức gây ngộ độc.

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra đồng thời ở nhiều người, tạo ra những triệu chứng chung sau khi tiêu thụ thực phẩm. Các triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là: buổn nôn, ói mửa, tiêu chảy, chóng mặt, sốt… Các triệu chứng này thay đổi ở các vụ ngộ độc khác nhau tùy thuộc vào tác nhân vi sinh vật và do độc tố của vi sinh vật tiết ra và mức độ tác động sẽ khác nhau tùy thuộc vào thể trạng của từng người. CÁC TÁC NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM [16] 1. Tác nhân sinh học Tác nhân sinh học ô nhiễm vào thực phẩm gây ngộ độc bao gồm vi khuẩn, virus, nấm mốc và ký sinh vật.

Vi khuẩn Là nguyên nhân hay gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm cấp tính có nhiều người mắc và gây ảnh hưởng không nhỏ tới sức khỏe. Điển hình như: – Salmonella typhimurium, Salmonella cholera đã được biết đến từ lâu trong các vụ ngộ độc liên quan đến sữa, thịt và trứng gia cầm – Staphylococcus aureus (tụ cầu khuẩn) nhiễm vào thức ăn từ các vết nhiễm trùng trên da, mũi, họng, phát triển nhanh chóng trong thức ăn và sinh độc tố gây ngộ độc. Hồ Thị Kim Ngân 4 Khóa luận tốt nghiệp GVHD Nguyễn Văn Minh – Clostridium botulinum gây ngộ độc (còn gọi là ngộ độc thịt) mang tính cấp tính rất nặng, làm phá hủy thần kinh trung ương, giảm trương lực cơ, gây nhìn mờ, khó thở, khó nuốt và tỷ lệ tử vong rất cao. – Escherichia coli (E coli) nhiễm vào thức ăn gây tiêu chảy là hiện tượng ngộ độc phổ biến ở trẻ em.

Echerichia coli được phân thành 4 loại: • E coli xâm nhập đường ruột (Enteroinvasive Echerichia coli – EIEC) gây triệu chứng lâm sàng giống như hội chứng lỵ. • E coli sinh độc tố đường ruột (Enterotoxigenic Escherichia coli – ETEC) thường gây tiêu chảy giống như bệnh tả ở những người đi du lịch. • E coli gây chảy máu đường ruột (Enterohaemorrhagic Escherichia coli- EHEC) có biểu hiện đi ngoài ra máu.Coli 0157: H7 thuộc (EHEC), hiện nay đang là nguyên nhân gây ngộ độc chính ở một số nước đã phát triển • E coli gây các bệnh đường ruột (Enteropathogenic Escherichia coli – EPEC) và thường dẫn đến hội chứng tiêu chảy ở trẻ nhỏ. – Listeria có liên quan đến sẩy thai, thai chết lưu hoặc nhiễm Toxoplasma liên quan đến quái thai, mù bẩm sinh.

Virus Virus nhiễm trong thực phẩm có thể gây viêm gan, bại liệt hoặc tiêu chảy. Các loại virus này thưởng thải trù theo phân. Tiêu chảy do thực phẩm nhiễm virus Rota là một trong các nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và suy dinh dưỡng ở trẻ dưới 5 tuổi. Các triệu chứng ngộ độc do ăn phải thực phẩm nhiễm virus thường xảy ra sau 1- 4 ngày với các biểu hiện sốt, đau bụng, nôn, đi ngoài nhiều lần trong ngày.

Nấm mốc Phát triển trong thực phẩm có khả năng sinh độc tố vi nấm nguy hiểm và tác động ảnh hưởng của những độc tố này khác nhau, ung thư gan do aflatoxin, suy thận do ochratoxin, ung thư buồng trứng do funonisin. Độc tố vi nấm có thể tác động trên nhiều tổ chức cơ thể khác nhau. Bệnh do fumonisin đã phá hủy tổ chức não ở ngựa, Hồ Thị Kim Ngân 5 Khóa luận tốt nghiệp GVHD Nguyễn Văn Minh có dịch ở phổi lợn, ung thu gan ở chuột cống và ung thư họng ở người. Aflatoxin gây ung thư gan ở tất cả các loại động vật và người.

Ký sinh vật Như Amip Entamoeba histolytica có trong thực phẩm cũng có thể dẫn đến ngộ độc cấp tính với triệu chứng đi ngoài ra máu, cơ thể mệt mỏi nhưng thường chuyển sang thể mạn tính gây các biến chứng nguy hiểm như sa niêm mạc trực tràng, viêm phúc mạc do thủng ruột, nếu không điều trị kịp thời có thể bị tử vong. Tác nhân hóa học Thực phẩm bị nhiễm các chất hóa học có thể gây ngộ độc cấp tính và mãn tính ở nhiều thể loại khác nhau. Ung thư, bệnh thần kinh, suy nhược cơ thể thường xảy ra do thực phẩm ô nhiễm aflatoxin, ochratoxin, các kim loại nặng, phụ gia thực phẩm, thuốc bảo vệ thực vật, động vật và chất kích thích sinh trưởng. Một lượng lớn nitrosamin được tạo thành khi chế biến thịt, cá ở nhiệt độ quá cao cũng được biết là tác nhân gây ung thư.

Sự tiếp xúc một số chất hóa học tuy ở liều lượng thấp nhưng với thời gian dài cũng có thể gây ra các bệnh nguy hiểm như ung thư và tổn thương hệ thần kinh. Tuy không phổ biến nhưng các chất hóa học nhiễm trong thực phẩm đã gây ra các vụ ngộ độc nghiêm trọng, trong một số trường hợp đã gây tử vong hoặc hủy hoại sức khỏe không thể hồi phục được. Thuốc bảo vệ thực vật nhiễm vào thực phẩm là tác nhân thường gặp trong các vụ ngộ độc gây rối loạn thần kinh trung ương, nhức đầu, mất ngủ, giảm trí nhớ, mức độ nặng hơn có thể tổn thương thần kinh ngoại biên dẫn đến liệt. Kim loại nặng nhiễm vào thực phẩm với lượng lớn thường gây ngộ độc cấp tính và tỷ lệ tử vong rất cao.

Ngộ độc asen (còn gọi là thạch tín) gây nôn, ói, mửa, đau bụng, tiêu chảy, khát nước dữ dội, mạch đập yếu, bí đái và tử vong nhanh chóng. Khi ngộ độc thủy ngân, người bệnh thường cảm thấy vị kim loại rất tanh trong cổ họng, đau bụng, nôn, có những chấm đen trên lợi, tăng huyết áp và chết do suy thận. Gạo bị nhiễm cadmium ở Nhật Bản đã làm cho hàng trăm người chết sau những cơn đau đớn khủng khiếp khắp người do xương trong cơ thể tự gẫy. Ngộ độc chì nặng thường gây Hồ Thị Kim Ngân 6 Khóa luận tốt nghiệp GVHD Nguyễn Văn Minh đau bụng dữ dội, nôn ra chì clorua màu trắng, tiêu chảy kèm theo phân đen của chì sunfua, tê tay chân, co giật và dẫn đến tử vong.

Trong cơ thể chì tác động mạnh đến hệ thần kinh ngoại biên và trung ương. Trẻ em là đối tượng nhạy cảm nhất và dễ bị các bệnh về não do nhiễm độc chì, thể hiện rõ nhất là chậm phát triển về trí tuệ. Chì còn gây hủy hoại thận, chức năng của hệ thống sinh sản, có thể dẫn đến sảy thai và vô sinh. Một số loại phụ gia thực phẩm như màu auramin, đỏ Scarlet, Sudan III, Rhodamin, đã được thử nghiệm trên động vật xác định khả năng gây ung thư, gây đột biến gen và đã bị loại ra khỏi danh mục các chất cho phép dùng trong chế biến thực phẩm.

Gần đây, các chất phụ gia như chất tạo ngọt, phẩm màu, hương liệu, chất chống oxy hóa và các hóa chất khác được sử dụng trong công nghệ thực phẩm nhằm duy trì chất lượng, tăng độ bền vững của sản phẩm , tạo mùi vị, hình dáng, màu sắc hay độ kiềm, độ acid của thực phẩm đã được tiêu chuẩn hóa ở cấp quốc gia cũng như quốc tế. Các độc tố có sẵn trong thực phẩm gây ngộ độc Nhiều thực phẩm có chứa sẵn các độc tố tự nhiên như chất độc solamin trong mầm khoai tây, cyanogen glucosit có trong sắn, đậu lima hoặc mytilotoxin ở một số loài nhuyễn thể. Độc tố bufetenin tạo thành trong da cóc rất nguy hiểm. Tetrodotoxin có trong gan, thận, cơ quan sinh sản (buồng trứng và túi tinh), mắt, mang và da cá nóc tác động vào hệ thần kinh gây rối loạn hoạt động chân tay, hô hấp.

Ngộ độc do độc tố cá nóc thoạt đầu có cảm giác ngứa ngáy, đau bụng dữ dội, đờ đẫn, cứng mồm, sùi bọt mép, nôn mửa, trường hợp nặng có thể cấm khẩu, co giật, liệt hô hấp và tử vong. Các loài nấm độc amanita, entoloma đã từng thông báo là một trong các nguyên nhân gây ngộ độc nguy hiểm. Một số nấm độc lại gần giống với nấm ăn được thường dùng như nấm Lactarius terminousus, Panus stipticus, Clitocybe olearia rất dễ nhầm lẫn. Các chất gây dị ứng, biến đổi gen: sulphit chỉ một lượng nhỏ bé có thể gây dị ứng biểu hiện là đi lỏng, phát ban ngứa, sốt nhẹ, một số người lại rất nhạy cảm với Hồ Thị Kim Ngân 7 Khóa luận tốt nghiệp GVHD Nguyễn Văn Minh sản phẩm tự nhiên như lạc hoặc các thành phần có trong thực phẩm như gluten trong bột mỳ.

Tìm hiểu về các thực phẩm gây dị ứng, tổ chức IFIC (International Food Information Council Foundation) đã nêu 8 thực phẩm gây dị ứng thường gặp nhất: sữa, trứng, lạc, quả có vỏ hạch, đậu, bột mì, tôm cá và nhuyễn thể. Nhộng tằm tuy không phổ biến lắm nhưng cũng là loại thức ăn gây dị ứng ở một số người. TỔNG QUAN VỀ VIBRIO SPP 1. Đặc điểm [4],[13] Vibrio là những trực khuẩn gram âm, hai đầu không đểu nhau tạo thành hình giống dấu phẩy, di động được nhờ tiêm mao ở một đầu, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng oxidase dương, lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S.

Vibrio là một trong những vi sinh vật phổ biến ở vùng mặt nước biển. Chúng xuất hiện ở môi trường biển, nước ngọt và trong quần thể sinh vật biển khác. Một số loài gây bệnh cho cá, tôm, động vật có xương sống và không xương sống, đặc biệt là con người. Trong đó, ba loài được biết đến là tác nhân gây bệnh tiêu chảy cho người Vibrio parahaemolyticus, Vibio cholerae, Vibrio vulnificus.

Theo khóa phân loại Bergey’s, Vibrio thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio 1. Vibrio cholerae [4],[8] Vibrio cholerae (còn gọi là Kommabacillus) là một loài vi trùng gram âm gây bệnh tả ở người. Vibrio cholerae và các loài khác thuộc chi Vibrio thuộc về lớp gamma của ngành Proteobacteria. Vibrio cholerae được nhà giải phẫu học người Ý Filippo Pacini xác định gây ra bệnh tả vào năm 1854, tuy vậy khám phá của ông Hồ Thị Kim Ngân 8 Khóa luận tốt nghiệp GVHD Nguyễn Văn Minh không được công nhận rộng rãi đến khi Robert Koch phân lập chúng lần đầu tiên vào năm 1883.