Giáo trình thực hành kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật IUH

Tài liệu Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật iuh tổng hợp lý thuyết và thực hành, phục vụ học tập ngành phục vụ đào tạo và nghiên c

• Tác giả: Nguyễn Thị Kim Anh
• Trường học: Nhà xuất bản Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
• Loại tài liệu: Giáo trình thực hành
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI MỞ ĐÀU
• 1. QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
• 2. GIỚI THIỆU CÁC THIẾT BỊ, MÔI TRƯỜNG TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
• 3. NỘI DUNG THỰC HÀNH
• 4. BÀI 1. CHUẨN BỊ DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT ĐẺ NUÔI CẤY TẾ BÀO
• 5. BÀI 2. THU TẾ BÀO ĐƠN TỪ MÔ ĐỘNG VẬT
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng Quan Kỹ Thuật Nuôi Cấy Tế Bào Động Vật IUH Là Gì

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học tế bào và kỹ thuật sinh học. Nó liên quan đến việc duy trì và phát triển tế bào động vật trong môi trường nhân tạo, bên ngoài cơ thể sống. Quá trình này cho phép các nhà khoa học nghiên cứu các chức năng tế bào, phát triển các liệu pháp y học, và sản xuất các sản phẩm sinh học. Tại Đại học Công nghiệp TP.HCM (IUH), kỹ thuật này được chú trọng giảng dạy và nghiên cứu, trang bị cho sinh viên kiến thức và kỹ năng cần thiết để làm việc trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử và các ngành công nghiệp liên quan.

Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật của IUH cung cấp hướng dẫn cụ thể, dễ thực hiện, giúp người học nắm vững các kỹ thuật cơ bản và nâng cao. Tài liệu này không chỉ phục vụ sinh viên chuyên ngành Sinh học, Công nghệ sinh học mà còn hữu ích cho học viên cao học và các nhà nghiên cứu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong công việc của họ. Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm, giới thiệu về thiết bị, môi trường nuôi cấy, và các bài thực hành chi tiết đều được trình bày rõ ràng, giúp người học tiếp cận dễ dàng và hiệu quả. Mục tiêu là giúp người học có thể thực hiện các kỹ thuật liên quan đến nuôi cấy tế bào động vật một cách thành thạo.

Quá trình nuôi cấy tế bào động vật đòi hỏi sự kiểm soát chặt chẽ các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH, và thành phần môi trường. Môi trường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của tế bào, bao gồm amino acid, vitamin, glucose, và các yếu tố tăng trưởng. Bên cạnh đó, việc đảm bảo vô trùng là vô cùng quan trọng để ngăn ngừa sự nhiễm bẩn của các vi sinh vật khác, ảnh hưởng đến sự phát triển và chức năng của tế bào động vật. Các kỹ thuật tiệt trùng, từ sử dụng nhiệt độ cao đến hóa chất và lọc, đều được áp dụng nghiêm ngặt trong quá trình nuôi cấy.

1.1. Ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào động vật

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có nhiều ứng dụng quan trọng, bao gồm nghiên cứu sinh học tế bào, phát triển dược phẩm sinh học, sản xuất vaccine, và nghiên cứu ung thư. Nó cũng được sử dụng trong sản xuất protein tái tổ hợp, thử nghiệm độc tính của các hợp chất, và nghiên cứu tế bào gốc. Các nhà khoa học sử dụng tế bào động vật để nghiên cứu các bệnh lý, tìm kiếm các phương pháp điều trị mới, và phát triển các liệu pháp y học tiên tiến. Ví dụ, nuôi cấy tế bào được sử dụng để tạo ra các mô hình bệnh tật trong ống nghiệm, giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh và thử nghiệm các loại thuốc mới. Các nghiên cứu về tế bào gốc cũng dựa trên kỹ thuật nuôi cấy tế bào để phát triển các liệu pháp thay thế tế bào bị tổn thương trong các bệnh thoái hóa và chấn thương.

1.2. Tầm quan trọng của phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào IUH

Phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào tại IUH đóng vai trò quan trọng trong việc đào tạo và nghiên cứu. Sinh viên được trang bị các kiến thức và kỹ năng thực hành cần thiết để làm việc trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử và các ngành công nghiệp liên quan. Các thiết bị hiện đại và quy trình chuẩn mực giúp sinh viên làm quen với các kỹ thuật tiên tiến và thực hiện các nghiên cứu chất lượng cao. IUH cũng chú trọng đến việc đảm bảo an toàn sinh học trong nuôi cấy tế bào, giúp sinh viên hiểu rõ các nguy cơ tiềm ẩn và thực hiện các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Điều này đảm bảo môi trường làm việc an toàn và hiệu quả cho tất cả các thành viên tham gia vào quá trình nuôi cấy tế bào.

II. Thách Thức Rủi Ro Nhiễm Bẩn Trong Nuôi Cấy Tế Bào IUH

Một trong những thách thức lớn nhất trong nuôi cấy tế bào động vật là nguy cơ nhiễm bẩn. Nhiễm bẩn có thể xảy ra từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm không khí, thiết bị, hóa chất, và thậm chí cả người thao tác. Các tác nhân gây nhiễm bẩn phổ biến bao gồm vi khuẩn, nấm, virus, và mycoplasma. Nhiễm bẩn có thể làm ảnh hưởng đến sự phát triển và chức năng của tế bào động vật, làm sai lệch kết quả nghiên cứu, và thậm chí làm hỏng toàn bộ lô nuôi cấy.

Để giảm thiểu nguy cơ nhiễm bẩn, cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình vô trùng. Điều này bao gồm sử dụng các thiết bị và hóa chất đã được tiệt trùng, làm việc trong tủ an toàn sinh học, và tuân thủ các quy tắc vệ sinh cá nhân. Tại IUH, sinh viên được đào tạo về các biện pháp phòng ngừa nhiễm bẩn và được yêu cầu tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình an toàn trong phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, ngay cả khi tuân thủ các quy trình nghiêm ngặt, nguy cơ nhiễm bẩn vẫn tồn tại và cần được theo dõi liên tục. Các kỹ thuật kiểm tra nhiễm bẩn, chẳng hạn như quan sát dưới kính hiển vi và sử dụng các xét nghiệm sinh hóa, được sử dụng để phát hiện sớm các dấu hiệu nhiễm bẩn và thực hiện các biện pháp khắc phục kịp thời.

2.1. Các nguồn nhiễm bẩn tiềm ẩn trong phòng thí nghiệm IUH

Nhiễm bẩn trong nuôi cấy tế bào có thể đến từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm không khí, nước, hóa chất, và thiết bị. Không khí trong phòng thí nghiệm có thể chứa các vi sinh vật, bụi bẩn, và các hạt lơ lửng khác có thể gây nhiễm bẩn. Nước sử dụng trong nuôi cấy tế bào cần phải được tinh khiết và tiệt trùng để loại bỏ các vi sinh vật và các chất ô nhiễm. Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào cần phải được bảo quản đúng cách và sử dụng trong thời gian quy định để tránh nhiễm bẩn. Thiết bị sử dụng trong nuôi cấy tế bào, chẳng hạn như pipet, bình nuôi cấy, và tủ an toàn sinh học, cần phải được tiệt trùng thường xuyên để ngăn ngừa sự lây lan của các vi sinh vật. Đặc biệt, sự cẩn thận của người thao tác cũng đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa nhiễm bẩn.

2.2. Hậu quả của nhiễm bẩn đối với kết quả nghiên cứu

Nhiễm bẩn có thể gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng đối với kết quả nghiên cứu. Nhiễm bẩn có thể làm ảnh hưởng đến sự phát triển và chức năng của tế bào động vật, dẫn đến sai lệch kết quả nghiên cứu. Các vi sinh vật gây nhiễm bẩn có thể cạnh tranh với tế bào động vật để giành lấy các chất dinh dưỡng, làm chậm sự phát triển của tế bào và thậm chí giết chết tế bào. Nhiễm bẩn cũng có thể làm thay đổi biểu hiện gen của tế bào động vật, làm sai lệch kết quả nghiên cứu về chức năng gen và các quá trình sinh học khác. Trong một số trường hợp, nhiễm bẩn có thể làm hỏng toàn bộ lô nuôi cấy, gây lãng phí thời gian, công sức, và nguồn lực.

III. Cách Tiệt Trùng Quy Trình Chuẩn Bị Dụng Cụ Nuôi Cấy IUH

Để đảm bảo vô trùng trong nuôi cấy tế bào động vật, việc chuẩn bị dụng cụ đóng vai trò then chốt. Quy trình này bao gồm rửa sạch, sấy khô, gói, tiệt trùng và bảo quản. Mỗi bước đều phải được thực hiện cẩn thận để loại bỏ hoàn toàn các tác nhân gây nhiễm bẩn. Tại IUH, sinh viên được hướng dẫn chi tiết về các phương pháp tiệt trùng khác nhau, từ sử dụng nhiệt độ cao (autoclave, tủ sấy) đến hóa chất (cồn 70%) và chiếu xạ (tia UV). Việc lựa chọn phương pháp tiệt trùng phù hợp phụ thuộc vào loại vật liệu và đặc tính của dụng cụ.

Đối với các dụng cụ bằng kim loại và thủy tinh, tiệt trùng bằng nhiệt độ cao là phương pháp hiệu quả nhất. Autoclave sử dụng hơi nước bão hòa ở áp suất cao để tiêu diệt các vi sinh vật, bao gồm cả bào tử. Tủ sấy sử dụng nhiệt khô để tiệt trùng, nhưng cần thời gian lâu hơn và nhiệt độ cao hơn so với autoclave. Đối với các dụng cụ bằng nhựa không chịu nhiệt, tiệt trùng bằng hóa chất hoặc chiếu xạ là lựa chọn phù hợp. Cồn 70% có khả năng diệt khuẩn và nấm, nhưng không diệt được bào tử. Tia UV có hiệu quả trong việc tiệt trùng bề mặt, nhưng không xuyên thấu được các vật liệu dày.

3.1. Tiệt trùng bằng nhiệt độ cao Autoclave và tủ sấy

Autoclave là một thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào, được sử dụng để tiệt trùng các dụng cụ bằng kim loại, thủy tinh, và một số vật liệu nhựa chịu nhiệt. Quá trình tiệt trùng bằng autoclave sử dụng hơi nước bão hòa ở áp suất cao (thường là 121°C, 1 atm) trong một khoảng thời gian nhất định (thường là 15-20 phút) để tiêu diệt các vi sinh vật, bao gồm cả bào tử. Tủ sấy là một thiết bị khác được sử dụng để tiệt trùng các dụng cụ bằng kim loại và thủy tinh bằng nhiệt khô. Quá trình tiệt trùng bằng tủ sấy cần thời gian lâu hơn và nhiệt độ cao hơn so với autoclave (thường là 160°C trong 2 giờ hoặc 180°C trong 30 phút). Cả autoclave và tủ sấy đều là những phương pháp tiệt trùng hiệu quả và được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy tế bào.

3.2. Tiệt trùng bằng hóa chất Cồn 70 và Ethylene Oxide

Cồn 70% là một hóa chất được sử dụng phổ biến để tiệt trùng bề mặt và các dụng cụ nhỏ trong nuôi cấy tế bào. Cồn 70% có khả năng diệt khuẩn và nấm bằng cách làm biến tính protein của các vi sinh vật. Tuy nhiên, cồn 70% không diệt được bào tử, do đó không thích hợp để tiệt trùng các dụng cụ cần độ vô trùng tuyệt đối. Ethylene Oxide (EO) là một loại khí được sử dụng để tiệt trùng các dụng cụ và thiết bị không chịu nhiệt. EO có khả năng diệt tất cả các loại vi sinh vật, bao gồm cả bào tử, bằng cách phá hủy DNA của các vi sinh vật. EO có khả năng xuyên qua nhiều loại vật liệu, bao gồm giấy, vải, và nhựa, do đó thích hợp để tiệt trùng các dụng cụ có cấu trúc phức tạp.

IV. Chọn Môi Trường Tối Ưu Hóa Nuôi Cấy Tế Bào Động Vật IUH

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp là yếu tố then chốt để đảm bảo sự phát triển và chức năng của tế bào động vật. Môi trường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của tế bào, bao gồm amino acid, vitamin, glucose, muối vô cơ, và các yếu tố tăng trưởng. Có hai loại môi trường nuôi cấy chính: môi trường tự nhiên và môi trường tổng hợp. Môi trường tự nhiên là các dịch sinh học tự nhiên như huyết thanh, huyết tương, và dịch chiết mô. Môi trường tổng hợp gồm môi trường cơ bản và các chất bổ sung như các yếu tố tăng trưởng, huyết thanh, và hormone.

Tại IUH, sinh viên được học về các loại môi trường nuôi cấy khác nhau và được hướng dẫn cách lựa chọn môi trường phù hợp cho từng loại tế bào động vật. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm loại tế bào động vật, mục đích của nghiên cứu, và các yêu cầu cụ thể của thí nghiệm. Huyết thanh thai bò (FBS) là một thành phần phổ biến trong môi trường nuôi cấy, cung cấp các yếu tố tăng trưởng và các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của tế bào. Tuy nhiên, FBS cũng có thể chứa các chất không mong muốn và có thể gây ra các phản ứng dị ứng.

4.1. Môi trường tự nhiên Ưu điểm và nhược điểm

Môi trường tự nhiên là các dịch sinh học tự nhiên như huyết thanh, huyết tương, và dịch chiết mô. Ưu điểm của môi trường tự nhiên là cung cấp một môi trường giàu dinh dưỡng và các yếu tố tăng trưởng cho tế bào động vật. Nhược điểm của môi trường tự nhiên là thành phần không xác định rõ ràng, có thể gây ra sự biến đổi trong kết quả thí nghiệm và có thể chứa các chất không mong muốn, chẳng hạn như virus và các chất gây dị ứng. Do đó, môi trường tự nhiên thường được sử dụng trong các nghiên cứu cơ bản hoặc trong các trường hợp không thể sử dụng môi trường tổng hợp.

4.2. Môi trường tổng hợp Các loại môi trường và ứng dụng

Môi trường tổng hợp là các môi trường được điều chế từ các thành phần hóa học tinh khiết. Ưu điểm của môi trường tổng hợp là thành phần được xác định rõ ràng, giúp kiểm soát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào động vật. Có nhiều loại môi trường tổng hợp khác nhau, mỗi loại được thiết kế để đáp ứng các nhu cầu dinh dưỡng cụ thể của từng loại tế bào động vật. Các loại môi trường tổng hợp phổ biến bao gồm Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, và Minimum Essential Medium (MEM). Môi trường tổng hợp thường được sử dụng trong các nghiên cứu khoa học và sản xuất các sản phẩm sinh học.

V. Ứng Dụng Nghiên Cứu và Phát Triển Dược Phẩm tại IUH

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vai trò quan trọng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm. Các nhà khoa học sử dụng tế bào động vật để thử nghiệm các loại thuốc mới, đánh giá độc tính của các hợp chất, và phát triển các liệu pháp y học tiên tiến. Tại IUH, kỹ thuật này được ứng dụng trong nhiều dự án nghiên cứu, từ phát triển các loại thuốc điều trị ung thư đến sản xuất vaccine và các sản phẩm sinh học khác.

Việc sử dụng tế bào động vật trong nghiên cứu dược phẩm giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng của thuốc, xác định các mục tiêu điều trị, và dự đoán hiệu quả điều trị. Tế bào động vật cũng được sử dụng để tạo ra các mô hình bệnh tật trong ống nghiệm, giúp các nhà khoa học thử nghiệm các loại thuốc mới một cách nhanh chóng và hiệu quả. Ngoài ra, nuôi cấy tế bào còn được sử dụng để sản xuất các protein điều trị, chẳng hạn như insulin và các kháng thể đơn dòng.

5.1. Thử nghiệm thuốc và đánh giá độc tính trên tế bào IUH

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được sử dụng để thử nghiệm các loại thuốc mới và đánh giá độc tính của các hợp chất. Các nhà khoa học sử dụng tế bào động vật để đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên sự phát triển, chức năng, và sự sống của tế bào. Các xét nghiệm độc tính tế bào, chẳng hạn như xét nghiệm MTT, được sử dụng để đánh giá khả năng thuốc gây hại cho tế bào. Kết quả thử nghiệm thuốc và đánh giá độc tính trên tế bào giúp các nhà khoa học lựa chọn các loại thuốc tiềm năng và loại bỏ các loại thuốc có độc tính cao.

5.2. Sản xuất vaccine và protein điều trị sử dụng tế bào động vật

Nuôi cấy tế bào được sử dụng để sản xuất vaccine và protein điều trị. Các nhà khoa học sử dụng tế bào động vật để sản xuất các virus đã làm suy yếu hoặc bất hoạt, được sử dụng để tạo ra vaccine. Tế bào động vật cũng được sử dụng để sản xuất các protein điều trị, chẳng hạn như insulin và các kháng thể đơn dòng. Quá trình sản xuất vaccine và protein điều trị bằng tế bào động vật đòi hỏi sự kiểm soát chặt chẽ các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH, và thành phần môi trường nuôi cấy, để đảm bảo sản phẩm có chất lượng cao và an toàn cho người sử dụng.

VI. Tương Lai Phát Triển Kỹ Thuật Nuôi Cấy Tế Bào IUH

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đang không ngừng phát triển và mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và ứng dụng. Các nhà khoa học đang nghiên cứu các phương pháp mới để tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, tăng hiệu quả sản xuất, và phát triển các mô hình tế bào phức tạp hơn. Tại IUH, các nhà nghiên cứu đang nỗ lực phát triển các kỹ thuật nuôi cấy tế bào tiên tiến để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngành công nghiệp dược phẩm và y sinh học.

Các nghiên cứu về tế bào gốc và kỹ thuật nuôi cấy ba chiều (3D) đang mở ra những hướng đi mới trong điều trị bệnh và tái tạo mô. Nuôi cấy 3D cho phép các nhà khoa học tạo ra các mô hình tế bào phức tạp hơn, gần giống với cấu trúc và chức năng của các mô trong cơ thể. Các mô hình tế bào 3D có thể được sử dụng để nghiên cứu bệnh tật, thử nghiệm thuốc, và phát triển các liệu pháp thay thế mô bị tổn thương.

6.1. Nuôi cấy ba chiều 3D Mô hình hóa tế bào phức tạp

Nuôi cấy ba chiều (3D) là một kỹ thuật tiên tiến cho phép các nhà khoa học tạo ra các mô hình tế bào phức tạp hơn, gần giống với cấu trúc và chức năng của các mô trong cơ thể. Trong nuôi cấy 3D, tế bào được nuôi cấy trong một môi trường cho phép chúng tương tác với nhau và tạo thành các cấu trúc phức tạp hơn so với nuôi cấy hai chiều (2D). Các mô hình tế bào 3D có thể được sử dụng để nghiên cứu bệnh tật, thử nghiệm thuốc, và phát triển các liệu pháp thay thế mô bị tổn thương.

6.2. Tự động hóa và tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào IUH

Tự động hóa và tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào là một xu hướng quan trọng trong lĩnh vực này. Các hệ thống tự động hóa có thể giúp giảm thiểu sai sót của con người, tăng hiệu quả sản xuất, và giảm chi phí. Các kỹ thuật tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào có thể giúp tăng năng suất và chất lượng sản phẩm. Tại IUH, các nhà nghiên cứu đang nỗ lực phát triển các hệ thống tự động hóa và các kỹ thuật tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngành công nghiệp dược phẩm và y sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

NGUYEN THJ KIM ANH (Chu bien) - ThS. LE TRAM NGHiA THU THUC • HANH KY THUAT • NUOI CAY TE BAO DONG • VAT • NHA XUAT BAN D�I HQC CONG NGHitP THANH PHO HO CHI MINH Giảo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật LỜI MỞ ĐÀU Tài liệu học tập này cung cấp những bài thực hành với các hướng dẫn cụ thể, dễ thực hiện giúp người học có thể thực hiện các kỹ thuật liên quan đến nuôi cấy tế bào động vật. Tài liệu được biên soạn nhằm phục vụ cho việc giảng dạy và học tập của sinh viên đại học chuyên ngành Sinh học, Công nghệ sinh học và các chuyên ngành liên quan. Học viên cao học hoặc những người nghiên cứu khoa học có sử dụng các kỹ thuật liên quan đến nuôi cấy tế bào động vật có thể tham khảo tài liệu này như một hướng dẫn kỹ thuật.

Nhóm tác giả 3 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tể bào động vật 4 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật MỤC LỤC Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm công nghệ tế bào động vật. 7 Giới thiệu các thiết bị, môi trường trong nuôi cấy tế bào động vật. 9 Nội dung thực hành. Chuẩn bị dụng cụ, môi trường và hóa chất để nuôi cấy tế bào.

14 Bài 2 Thu tế bào đon từ mô động vật. Nuôi cấy sơ cấp nguyên bào sợi. Nuôi cấy thứ cấp tế bào động vật. 26 Bài 5 Đông lạnh và giải đông tế bào.

28 Bài 6 Tạo dòng tế bào. Các phương pháp kiểm tra độc tính trên tế bào động vật. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật. 39 Tài liệu tham khảo.

43 5 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ DMEM Dulberco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide ETDA Ethylenediaminetetraacetic acid FBS Fetal Bovine Serum MEM Minium Essential Media MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, PBS Phosphate Buffer Saline RPMĨ Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium ưv Ultraviolet 6 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Khi làm việc ở phòng thí nghiệm, sinh viên phải thực hiện nghiêm túc các quy tắc sau để đảm bảo hiệu quả và an toàn: I. NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM Điều 1: Sinh viên phải tham dự đầy đủ các buổi thực hành, chuẩn bị bài trước khi bước vào phòng thực hành. Điều 2: Sinh viên vào phòng thí nghiệm đúng giờ và phải có sự cho phép của giáo viên phụ trách mới được rời phòng. Điều 3: Sinh viên không nói chuyện, không làm việc riêng, không hút thuốc, không ăn, uống trong phòng thí nghiệm.

Điểu 4: Sinh viên cần làm theo sự chỉ dẫn của giáo viên phụ trách khi sử dụng các dụng cụ đắt tiền, dễ vỡ, các hóa chất dễ cháy, nổ. Điều 5: Sinh viên cần sử dụng hóa chất tiết kiệm, cẩn thận để không làm đồ hóa chất, vỡ dụng cụ. Khi dụng cụ bị vỡ, sinh viên cần báo cáo với giáo viên phụ trách và bồi thường những hóa chất, dụng cụ đã làm đổ, vỡ. Điểu 6: Sinh viên không tự ý di chuyển hóa chất khỏi nơi qui định Điểu 7: Sinh viên cần lau sạch nắp và cổ chai hóa chất trước khi mở nắp.

Điều 8: Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải sạch và rửa ngay sau khi dùng xong. Không sử dụng dụng cụ lấy hóa chất này để lấy loại hóa chất khác nếu dụng cụ chưa được rửa. Điều 9: Sinh viên khi thực hiện thí nghiệm cần cẩn thận, nghiêm túc và báo cáo kết quả trung thực. Điều 10: Sinh viên rửa sạch, làm khô dụng cụ và vệ sinh vị trí làm việc.

Quét, lau phòng thí nghiệm trước khi ra về. Điều 11: Thực hiện nghiêm túc các qui định về phòng cháy và chữa cháy. Điều 12: Kiểm tra hệ thống điện, nước trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm, phải tắt quạt, tắt đèn, khóa các vòi nước và ngắt cầu dao điện. QUY TẮC LÀM VIỆC VỚI HÓA CHÁT Độc, DẺ CHÁY, DẺ NỔ 1.

Khi sử dụng các hóa chất thì cần đọc thông tin trên nhãn chai. Chú ý các ký hiệu cảnh báo dễ cháy, nổ, độc hại. Thực hiện nghiêm túc các yêu cầu trong phòng chống độc, phòng chống cháy nổ khi làm việc với các hóa chất. Khi pha hóa chất, hóa chất phải chứa trong các dụng cụ chứa có nắp, ghi nhãn tên hóa chất, nồng độ, tên người pha, ngày pha.

cần bê cả phần đáy chai khi cầm chai hóa chất lên. 7 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tể bào động vật 4. Đeo mặt nạ, kính bảo vệ mắt khi sử dụng axit đậm đặc và các dung môi dễ bay hơi. Các thao tác khi sử dụng các hóa chất này phải được thực hiện trong tủ hút và chỉ tắt tủ hút khi chất độc đã hết.

Khi pha loãng axit H2SO4 thì phải chọn bình chứa chịu nhiệt và rót cẩn thận axit qua phễu vào bình đã chứa nước trong tủ hút. Lưu ý khi muốn pha axit hay bazơ thì phải đổ acid/bazơ vào nước và tránh làm ngược lại. Không hút acid/bazơ bằng miệng cũng như khi trong lọ còn ít hóa chất thì không hút bằng pipet. Không được đun nóng trực tiếp trên ngọn lửa khi sử dụng các chất dễ cháy như aceton, benzen, eter, cacbondisunfua, etylacetate.

mà nên đun trên bếp cách thủy. QUY TẤC LÀM VIỆC VỚI CÁC DÒNG TÉ BÀO 1. Việc thao tác trên các dòng tế bào nên được tiến hành trong tủ an toàn sinh học cấp 2. Khi làm việc trên các dòng tế bào thì phải đeo một số đồ bảo hộ cơ bản như khẩu trang, găng tay để tránh bị nhiễm mycoplasma.

Đối với các dòng tế bào, đặc biệt là các dòng tế bào chuyển gen, không được thải bỏ trực tiếp ra nguồn nước thải mà phải hấp tiệt trùng trước. 8 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tể bào động vật GIỚI THIỆU CÁC THIẾT BỊ, MÔI TRƯỜNG TRONG NUÔI CẤY TẾ BAO Động Vật 1.ỉ Tủ an toàn sinh học Tủ an toàn sinh học là một thiết bị cần có trong phòng nuôi cấy tế bào động vật và tủ thường được dùng là tủ an toàn sinh học cấp 2 (Class II). Thiết bị này bảo vệ người thao tác khỏi các tác nhân lây nhiễm, bảo vệ mẫu vật thao tác, bảo vệ môi trường bên trong tủ trước các tác nhân lây nhiễm sinh học.2 Tủ nuôi tế bào (Tủ ấm co2) Tủ ấm CO2 là một trong những thiết bị cần phải có của phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào động vật và người. Thiết bị này tạo môi trường nuôi cấy phù hợp cho tế bào sinh trưởng và giữ cho môi trường nuôi cấy tránh khỏi các vi sinh vật tạp nhiễm.

Tủ được duy trì nhiệt độ ổn định ở 37°c, 85-90% RH (độ ẩm tương đối), 5% CO2. Tủ an toàn sinh học cấp II (bên trái) và tủ ấm CO2 (bên phải).3 Kinh hiển vi đảo ngược Kính hiển vi đảo ngược/soi ngược là kính có hệ thống bàn để vật kính, các vật kính ở dưới và hướng lên trên, còn bàn đặt mẫu, nguồn cung cấp ánh sáng và tụ quang ở bên trên. 9 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Hình 2. Kính hiển vi đảo ngược.

Kính hiển vi đảo ngược thường được sử dụng trong các thao tác trên các tế bào tinh trùng hay trứng, để quan sát, theo dõi các tế bào đang trong bình/đĩa nuôi cấy hay các loại sinh vật dưới đáy của bình nuôi.4 Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) Nồi hấp tiệt trùng là thiết bị rất phổ biến dùng để tiệt trùng nhiều loại vật dụng khác nhau như các thiết bị, các dụng cụ sử dụng trong y tế hay các dụng cụ trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 121 °C, latm, trong thời gian từ 15 - 20 phút. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp tiệt trùng có thể tiêu diệt hết các vi sinh vật, bào tử của nó trên vật dụng cần tiệt trùng.5 Máy ly tâm Máy ly tâm được sử dụng trong quy trình nuôi cấy tế bào để ly tâm dịch huyền phù tế bào nhằm tăng nồng độ tế bào (cell concentration) trong quy trình xác định nồng độ tế bào, loại enzyme sử dụng trong phân tách tế bào (ví dụ như trypsin) hay loại bỏ môi trường nuôi cấy trong quy trình nuôi cấy các tế bào dạng lơ lửng/huyền phù.6 Micropipette Micropipette (pippetman) là một dụng cụ được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm để đo chính xác một lượng thể tích nhỏ. Micropipette thường được gắn cùng với các đầu tip tương ứng đã được tiệt trùng để hút các dung dịch, hóa chất hoặc các dịch huyền phù tế bào. 10 Giáo trình thực hành Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Mỗi micropipette đều có một giới hạn sử dụng trên và dưới riêng biệt nên tùy theo thể tích dung dịch cần hút mà lựa chọn một loại micropipette phù hợp.

Có một số loại micropipette như 0,5-lOgl, 0,2-2pl, 20-200pl, ỈOO-lOOOpl, 1000 ul-5000ul.7 Buồng đếm Neubauer và Mảy đếm tế bào tự động Buồng đếm và máy đếm tế bào tự động được sử dụng để đếm số lượng tế bào trong dịch huyền phù tế bào nhằm điều chỉnh số tế bào thích hợp cho nuôi cấy cũng như cho biết tỉ lệ tế bào sống và chết trong dịch huyền phù. Phương pháp sử dụng buồng đếm này là phương pháp đếm số lượng tế bào đcm giản nhất theo cách trực tiếp. Phương pháp này rẻ và có thể cho phép xác định khả năng sống của tế bào bằng việc nhuộm tế bào với các loại thuốc nhuộm. Máy đếm tế bào tự động là một lựa chọn rất hữu hiệu nhằm thay thế việc đếm tế bào dựa trên buồng đếm hồng cầu thủ công vì khả năng lặp lại, độ chính xác cao và giảm thời gian thao tác; nó cũng làm giảm đáng kể các sai số do người sử dụng và sai số do nồng độ tế bào tạo ra.8 Tủ lạnh âm sâu Tủ lạnh âm sâu là thiết bị làm lạnh được sử dụng trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu nhằm bảo quản giống, mẫu sinh phẩm, tế bào ở các dải nhiệt độ -40°C, -86°c, -140°C.

trong những khoảng thời gian khác nhau. Hệ thống tủ lạnh âm sâu có sự kết hợp nhiều hơn 2 hệ thống lạnh. Khi sử dụng tủ âm sâu để bảo quản tế bào động vật thì sẽ sử dụng thêm các chất bảo quản đông lạnh như DMSO hoặc Glycerol để giúp tế bào không bị hư hỏng hay chết trong thời gian lưu trữ, bảo quản để có thể nuôi cấy được sau khi rã đông tế bào.9 Bình đựng ni tơ lỏng Bình đựng ni tơ lỏng được sử dụng để bảo quản tế bào ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C) trong một thời gian dài. Ngoài ra, bình ni tơ lỏng còn được sử dụng trong trường hợp vận chuyển mẫu.