ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đang là một vấn đề nhận đƣợc sự quan tâm ngày càng lớn của xã hội và các cơ quan quản lý. Trong những năm trở lại đây, việc sử dụng các chất cấm trong chăn nuôi gia súc, gia cầm đã gây nhiều bức xúc và là một vấn đề có nguy cơ tiềm tàng gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sức khỏe con ngƣời. Chính vì vậy, các cơ quan quản lý ngày càng đƣa ra các yêu cầu giám sát gắt gao hơn. Chất auramin O hay còn gọi là chất Vàng Ô đƣợc dùng phổ biến trong công nghiệp dệt may, sơn hay tạo màu trong ve quét tƣờng hoặc để nhuộm màu vi khuẩn (ví dụ nhƣ Mycobacterium) [23].
Ở Việt Nam, các cơ quan chức năng của Bộ NN&PTNN đã phát hiện đƣợc nhiều cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi trộn chất màu này vào trong thức ăn cho gà với mong muốn tạo màu vàng bắt mắt cho da và chân gà để dễ bán. Khi ngƣời tiêu dùng ăn thịt gà thì sẽ hấp thụ luôn lƣợng Auramin O còn tồn dƣ, dẫn tới nguy cơ bất lợi cho sức khỏe và có thể gây ung thƣ. Chính vì vậy, từ 11/2015 Bộ NN&PTNN đã ban hành thông tƣ bổ sung Auramin O vào danh mục các chất cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam [4]. Từ yêu cầu quản lý trên, về mặt chuyên môn cần có các phƣơng pháp phân tích đáng tin cậy với độ nhạy phù hợp để kiểm soát đƣợc lƣợng Auramin O có trong các mẫu thực phẩm cần giám sát.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế và những đặc tính ƣu việt của kỹ thuật LC-MS/MS trong phân tích, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp xác định Auramine O trong thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS” với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định Auramin O trong thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS. Áp dụng phƣơng pháp trên để xác định hàm lƣợng Auramine O trong một số mẫu thức ăn chăn nuôi trên thị trƣờng. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.
Tổng quan về Auramin O 1. Khái quát chung Auramin O (dạng muối hydrochlorid) thuộc phân nhóm dẫn xuất ketoimine của nhóm thuốc nhuộm diphenylmethan. Auramin đƣợc tổng hợp bằng cách nung nóng 4,4'- bis (dimethylaminodiphenyl) methan (Michler’s base; CAS N. 101–61–1) với một hỗn hợp gồm ure, acid sulfamic và lƣu huỳnh trong amoniac ở 175ºC.
Auramin sulfat hình thành trong phản ứng có thể sử dụng trực tiếp trong quá trình nhuộm hoặc có thể chuyển sang dạng auramin base hay dạng muối hydrochlorid [17], 26]. Sản xuất auramin diễn ra đầu tiên ở châu Âu nhƣng hiện nay nó chỉ đƣợc sản xuất chủ yếu ở Ấn Độ và Trung Quốc [11]. Thuốc nhuộm auramin O đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghiệp nhuộm da, nhuộm giấy, tạo màu sơn. Ngoài ra auramin O còn đƣợc dùng làm chất nhuộm màu huỳnh quang trong nhuộm nhanh vi khuẩn acid có trong đờm, mô nhiễm bệnh; kết hợp cùng thuốc nhuộm rhodamin trong phép nhuộm auramin-rhodamin để phát hiện các vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis [23].
Auramin O đã đƣợc sử dụng ở một số nƣớc nhƣ một loại màu thực phẩm. Auramin đã đƣợc phát hiện với một tỷ lệ nhỏ ở các mẫu thực phẩm từ Ấn Độ [28], bao gồm cả đậu Hà Lan tƣơi 22]. Những năm gần đây, Auramin O cũng đƣợc tìm thấy trong nhiều mẫu thực phẩm ở các quốc gia khác nhau nhƣ: Philippins , Việt Nam và Trung Quốc [19]. Cấu trúc, tính chất hóa lý Tính chất hóa lý [13],[18] - Tinh thể ánh kim, màu từ vàng nhạt đến vàng nâu.
4 - Điểm nóng chảy: 267ºC - Độ hòa tan: Hơi tan trong nƣớc (10 mg/ml) và ethanol (20 mg/ml); tan trong ethylen glycol, methyl ether (60 mg/ml). Cấu trúc: Auramin O có chứa nhân anthraquinon, một nhân thơm có đa vòng nhƣ công thức cấu tạo dƣới đây: Hình 1. Công thức cấu tạo của auramin O Công thức phân tử : C17H21N3.HCl Tên đầy đủ: 4,4'-Carbonimidoylbis [N, N-dimethylbenzenamine] hydrochlorid Tên gọi khác: Auramin O, basic yellow 2, vàng ô. Độc tính Năm 1933, Muller đã báo cáo 2 ca lâm sàng ung thƣ bàng quang ở công nhân làm việc trong ngành công nghiệp sản xuất auramin O [29].
Những năm sau đó, các nghiên cứu thuần tập đã chỉ ra rằng có một tỷ lệ tƣơng đối cao các công nhân làm việc trong nhà máy sản xuất auramin bị ung thƣ bàng quang, tuyến tiền liệt hoặc dạ dày [8]. Các nhà khoa học đã tiến hành nhiều nghiên cứu thử nghiệm tác hại của auramin trên động vật. Kết quả cho thấy, auramin O làm tổn thƣơng ADN trên gan, thận, tuỷ xƣơng của chuột nhắt và chuột cống với liều LD50 là 135 mg/kg [21], gây chết hoặc làm xuất hiện các khối u lympho trên chuột [7]. Trên thỏ, auramin gây chết và làm tăng sinh các tế bào biểu mô đƣờng tiết niệu gợi ý cho ung thƣ bàng quang [7].
Tổ chức nghiên cứu ung thƣ thế giới IARC đã xếp auramin O vào nhóm 2B là nhóm các chất hoặc hỗn hợp có thể gây ung thƣ cho ngƣời [16]. Các quy định về hàm lượng của Auramin O Ở châu Âu, việc sản xuất auramin và auramin hydrochlorid phải tuân theo quy định của chỉ thị 2004/37/EC áp dụng cho các hoạt động mà ngƣời lao động phải tiếp xúc với chất gây ung thƣ hoặc các chất gây đột biến gen [9]. Chỉ thị 2004/93/EC ngày 21 tháng 9 năm 2004 xếp auramin và muối của nó vào nhóm không đƣợc có mặt trong các thành phần của mỹ phẩm [10]. Giá trị giới hạn quốc tế của Auramin năm 2007 [12] Quốc gia Giá trị giới hạn – Giá trị giới hạn-Thời Ghi chú 8 tiếng (mg/m3) gian ngắn (mg/m3) Australia 0,08 aerosol có thể 0,32 aerosol có thể hít Hƣớng dẫn hít phải phải nồng độ kĩ thuật (dựa trên tính khả thi) Thụy Sĩ 0,08 Ở Việt Nam, auramin và các dẫn xuất đã bị cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm.
Theo quy định của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, giới hạn phát hiện mà phƣơng pháp thử cần phải đạt để phân tích auramin O trong thức ăn chăn nuôi là 1 mg/kg [6]. Tổng quan phƣơng pháp xác định Auramin O 1. Các phương pháp đã được thực hiện để xác định Auramin O Nghiên cứu xác định Auramin O bắt đầu vào những năm 1970 và tiếp tục trong những năm 1980 bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng TLC. Các nghiên cứu đƣợc tiến hành từ những năm 1990 đến nay sử dụng phƣơng pháp HPLC và khối phổ có tính nhạy và chọn lọc hơn.
Một số phương pháp xác định và định lượng Auramin O trong các nền mẫu khác nhau Nền Xử lý mẫu Phƣơng pháp LOD, LOQ, TLTK mẫu R(%) Mô Chiết bằng hexan HPLC (-) [27] tôm và ethanol, lắc lỏng lỏng với acid acetic và nhựa trao đổi anion lỏng, chiết với ethyl acetact, rửa ethyl acetat với amoniac 5% Thuốc Hòa tan thuốc TLC (-) [1] nhuộm nhuộm, tách rửa sinh bằng n-butanol- học acid acetic- nƣớc(4:1:5) hay n- butanol-ethanol- nƣớc(9:1:1) Đậu Chiết bằng ethanol, HPLC-DAD LOD: 0,25 [21] tƣơng siêu âm, lọc - Cột hypesil C18 µg/ml - Pha động: R : 95% Kênh A: methanol 7 Kênh B: acetic- amonium 0,5% - Bƣớc sóng 436 nm Cá Đối tƣợng: đồng HPLC- DAD R: 95-116% [15] thời auramin O và - Bƣớc song 440 LOD: 0,25 chrysoidin II nm µg/g -Cột YMC hydrosphere-C18 - Pha động: Kênh A: MeOH Kênh B: H3PO4 0,03% Thực Chiết lỏng lỏng với HPLC – FDA LOD: 0,05 [26] phẩm các dmhc phân cực -Cột ODS µg/g và không phân cực LOQ: 0,125 đóng -Pha động: Làm sạch bằng qua µg/g hộp Kênh A: AA cột Oasis HLB R: 70,2-102,8 20mM(chỉnh PH 4,5 = acid acetic) % Kênh B: ACN Sản Đối tƣợng: Basic HPLC- detector R: 88 – 93% [25] phầm orange II, acid UV LOD: 0,05 từ đậu orange II và - chiết bằng ACN mg/kg auramin O : H2O (7:3) 8 Do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kỹ thuật LC-MS và LC-MS/MS đã đƣợc ứng dụng để nghiên cứu phân tích Auramin O trong các nền mẫu thực phẩm khác nhau (Bảng 1. Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phân tích auramin O Nền Đối tƣợng Xử lý mẫu Phƣơng pháp LOD, TLT mẫu LOQ, R K Thực Đồng thời Chiết lỏng LC-ESI-MS (-) [26] phẩm rhodamin B, lỏng với các -cột ODS đóng auramin O dmhc phân hộp và cực và -Pha động: pararosanilin không phân Kênh A: AA cực 20mM(chỉnh PH Làm sạch 4,5 = acid acetic) bằng qua cột Kênh B: ACN Oasis HLB Thực Chrysoidin Chiết bằng UPLC-MS LOD: [30] phẩm và Auramin methanol 1,28 O Làm sạch µg/kg qua cột SPE LOQ: C18 4,27 µg/kg R: 80,1 - 95,3% 9 Thịt gà 5 đối tƣợng Chiết bằng LC-MS/MS LOQ: 40 [20] và các Chrysoidine MeOH:AA -cột aligent ODS ng/g sản G, Basic 50mM(1:1) C18 R: 79,8- phẩm Yellow 2, Qua cột -pha động: 95,2 % từ đậu Acid Orange WAX I, Acid Kênh A: AA orange II, 50mM(0,1% AF) Acid Yellow Kênh B: ACN 36 Bột ớt Chyrsoidin, Chiết bằng HPLC-MS LOD: 2 [16] Auramin O, ACN :AF - Cột C18 µg/kg Astrazone 2% LOQ: 5 - Pha động : orange G Qua cột SPE µg/kg MCX Kênh A : ACN R: 71,3 - Kênh B : AF 0,1 % 92,5% 1. Phương pháp LC-MS/MS Sắc kí lỏng khối phổ là một kỹ thuật mới nhƣng đã đƣợc ứng dụng để phân tích rộng rãi do có nhiều ƣu điểm : - Có độ nhạy cao, đặc biệt là sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) rất phù hợp để phân tích các mẫu có hàm lƣợng độc tố ở mức thấp - Có khả năng tách các chất dựa theo m/z , do đó cùng với khả năng tách các chất nhờ HPLC thì phƣơng pháp này có khả năng phân tích đồng thời nhiều chất trong cùng một lần chạy - Có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lƣợng và cấu tạo của chất nên rất đặc trƣng cho từng chất - Có khả năng phân tích đƣợc những chất không thể phân tích bằng sắc kí khí, nhƣ các chất kém bay hơi, các chất không bền nhiệt 10 Về cơ bản, sắc kí lỏng khối phổ là phƣơng pháp sắc kí lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ 1. Khi tiến hành chạy sắc kí, các chất phân tích đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh.
Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tƣơng tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [1],[2].