CHƯƠNG 1. LOI MỞ DAU 1. Dat van dé Van đề sức khỏe và thâm mỹ được coi là một trong những van dé ma hau hết mọi người quan tâm và một trong số đó là vấn đề về rụng tóc. Rụng tóc là một hiện tượng rất bình thường trong đời sống, theo thống kê cho thấy trung bình một người rụng từ khoảng 50 đến 100 sợi tóc mỗi ngày.
Tuy nhiên, quá trình rụng tóc này có thể diễn ra trong vòng nhiều tháng khiến cho những người gặp phải cảm thấy tự ti, mặc cảm. Dé giải quyết tình trạng trên, hiện nay trên thị trường xuất hiện nhiều sản phẩm hướng đến van đề hỗ trợ làm giảm rụng tóc, trong đó có nhiều sản phẩm xuất phát có nguồn gốc sinh học. Các nghiên cứu đang được ứng dụng dựa trên một sỐ phân tử tín hiệu điều hòa chu kỳ tái tao nang tóc và quá trình mọc tóc, trong đó KGF đang được quan tâm. KGF là yếu tô tăng trưởng tế bào sừng, KGF biểu hiện ở lớp hạ bì và điều chỉnh sự tăng sinh và biệt hóa của biểu bì thông qua cơ chế cận tiết, kích thích quá trình lành vết thương va mọc tóc (Danilenko và ctv, 1995: Guo và ctv, 1996).
Tuy nhiên, việc sử dụng KGF van còn hạn chế đo giá thành và khả năng thu nhận từ tự nhiên tương đối thấp dé đáp ứng nhu cầu công nghiệp và thị trường rộng lớn. Vì vậy, việc nghiên cứu tong hợp protein này là cần thiết. Ngày nay, người ta thường ứng dung công nghệ DNA tái tổ hợp dé tạo protein tái tô hợp từ chủng Escherichia coli (E. coli) thay thế cho các hệ thống tế bào khác.
coli là hệ thống biéu hiện sinh vật nhân sơ thường được dùng dé sản xuất protein ngoại lai. Việc sử dung E. coli trong nghiên cứu giúp biểu hiện và sản xuất protein một cách đơn giản, nhanh chóng nhằm nâng cao hiệu suất kinh tế, giảm giá thành sản phẩm. Do do, dé đáp ứng được nhu cầu cấp thiết nay, dé tài “Tao dòng và biểu hiện gen mã hóa protein KGF (Keratinocyte Growth Factor)” được tiễn hành nghiên cứu.
Mục tiêu của đề tài Tạo dong được plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen mã hóa protein mục tiêu và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp. Nội dung thực hiện Tạo dong vi khuẩn #. coli DH5a mang vector biểu hiện pET28a-KGF. Biểu hiện protein KGF trong hệ thống tế bào vi khuẩn E.
Yếu tố tăng trưởng tế bào sừng (Keratinocyte Growth Factor) 2. Giới thiệu chung Yếu tố tăng trưởng tế bào sừng (Keratinocyte Growth Factor - KGF hay FGF7), là một trong những thành viên của họ các yếu tố tăng trưởng tế bào nguyên sợi (Fibroblast Growth Factor- FGF) được phát hiện và phân lập lần đầu tiên vào năm 1989, được sinh tông hợp bởi các tế bào có nguồn gốc từ trung mô bởi Rubin và cộng sự từ đòng tế bào nguyên bào sợi phối M426 trong phôi thai người. Vì cùng là một thành viên của họ các yếu tố tăng trưởng của tế bào nguyên sợi (FGF) cho nên KGF cũng có một vài vùng trình tự tương đồng so với các thành viên khác bao gồm FGF10 và FGF22. KGF của con người có 54% trình tự tương đồng với FGF10 của con người (Emoto va ctv, 1997; Igarashi và ctv, 1998) và 40% so với FGF22 cua con người (Nakatake va ctv, 2001) trong các khu vực được bao tồn của chúng, do đó cũng dan đến sự tương đồng trong một số ứng dụng hoạt tính sinh học.
Ngoài ra, một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng yếu tổ tăng trưởng tế bào sừng có nhiều chức năng đa dạng khác nhau như là kích thích sự hình thành và phân chia, tăng sinh và biệt hóa các dòng tế bào biểu mô và tế bảo sừng, v. Bên cạnh đó KGF đã được chứng minh có sự biểu hiện ở lớp hạ bì giúp điều chỉnh sự tăng sinh và biệt hóa của biểu bì thông qua cơ chế cận tiết, kích thích quá trình lành vết thương và mọc tóc (Danilenko va ctv, 1995; Guo va ctv, 1996). Hiện nay, đã có một vai nghiên cứu đã tìm ra sự có mặt của KGF, chúng bao gồm các nguyên bao sợi từ phối, da, tuyến vú, da day, bàng quang và tuyến tiền liệt ở người trưởng thành (Rubin va ctv, 1995), cũng như các tế bào nội mô vi mạch (Smola và ctv, 1993) và tế bào cơ trơn (Koji và cộng sự ., 1994; Winkles và ctv, 1997). Do khả năng tiềm ân trong nhiều ứng dụng với các lĩnh vực khác nhau mà đã có một vài nghiên cứu trước đây được đề ra nhằm mục đích thu được nhiều protein KGF tái tổ hợp với giá thành rẻ, vì vậy sự biểu hiện của protein này được nghiên cứu trên nhiều hệ thống tế bào khác nhau như nam men P.
Cau trúc protein Các gen liên quan dén họ nha FGF được bao tồn cao trong cấu trúc tông thé của chúng, bao gồm ba exon mã hóa sản phẩm dịch mã chính và các intron can thiệp nằm ở cùng vị tri so với các chuỗi mã hóa protein (Ornitz và Itoh, 2001). Gen KGF phù hợp với cấu trúc này, với các intron giữa ba exon mã hóa được định vi sau các nucleotide 731 va 835 trong trình tự cDNA (Kelley và ctv, 1992). Ca gen KGF của người và chuột đều chứa một đoạn intron nằmở vị trí 5’ vùng chưa được dịch mã. Doan intron trong gen người dài khoảng 650 bp và nằm giữa nucleotide 179 và 180 (Finch va ctv, 1995), trong khi đó đoạn intron trong gen chuột dai 585 bp và nằm ở vi trí tương tự (Fasciana va ctv, 1996).
Vị trí của gen KGF ở người là nhiễm sắc thé 15q13-q22 (Zimonjic va ctv, 1997). Ngoài ra, KGF đã được tinh chế thành một polypeptide don phân với khối lượng phân tử rõ ràng là 26-28 kDa (Rubin và ctv, 1989). Sự không đồng về trọng lượng phân tử có lẽ là do sự khác biệt trong quá trình glycosyl hóa hoặc sự phân giải một phan protein. KGF cDNA đã mã hóa protein 194 axit amin, bao gồm một peptide tín hiệu cổ điển và một vị tri glycosyl hóa liên kết với N (asparagine) tiềm năng (Finch va ctv, 1989).
Khi được biểu hiện ở vi khuẩn, một loại protein có hoạt tính sinh học thu được với kích thước phân tử là khoảng 21 kDa và hoạt tính đặc hiệu lớn hơn khoảng 10 lần so với hoạt tính của protein tự nhiên được phân lập từ môi trường điều hòa của các tế bào nguyên bào sợi (Ron và ctv, 1993). Một lời giải thích cho sự khác biệt về kích thước nay là do protein tái tổ hop được biểu hiện ở vi khuẩn không có quá trình glycosyl hóa, cho thấy rang sự biến đổi sau dịch mã này theo một cách nào đó có thé cản trở sự ôn định của KGF hoặc sự tương tác với thụ thể của nó (Ron ctv, 1993). Phân tích các đột biến cắt ngắn đầu cuối amino (N) của KGF tái tô hợp với 23 amino acid đầu tiên bắt đầu từ C32 nhằm kiểm tra hoạt tính sinh học của protein KGF khi có đột biến xảy ra. Trong đó, các cầu nối disulfide được thể hiện bằng các nét nối giữ hai amino acid, các vùng đánh dấu màu (đỏ, xanh và vàng) là vùng được gây đột biến và các gốc được tô bóng S153-M163 bao gồm các vi trí có khả năng liên kết với protein FGFR2b thứ cấp giả định.Trình tự amino acid của KGF tái tổ hợp ở người.
(Finch và Rubin, 2004) Cấu trúc thứ cấp của KGF có 10 sợi gấp nếp theo kiểu B và được xác định rõ tạo thành năm tam phản song song sợi kép. Ngoài ra, sợi gấp nếp j4 là sợi trung tâm trong bộ 3 tắm phản song song (B1, B4, B6). Bộ ba như này không có trong FGF1 cũng như FGF2, vì B1 của KGF khá dai so với hai loại protein trên. B6 nằm trong vòng lặp giữa các gốc 164 và 175 được xác định chỉ bởi một liên kết hydro duy nhất giữa hai sợi (điều này tương ứng với cặp 10/11 được xác định tương tự trong FGF10).Cấu trúc 3D của KGF dựa trên sự biến đổi chuỗi amino acid hình 2.
Con đường tín hiệu Hiện nay, tương đối ít nghiên cứu kiểm tra cụ thê tín hiệu KGF nhưng có một vài nghiên cứu cho thấy sự ảnh hưởng của protein qua các đường dẫn truyền tín hiệu qua trung gian FGF. Vì là một trong những thành viên của họ các yếu tố tăng trưởng (FGF) nên đữ liệu hiện cho thấy tín hiệu KGF cũng liên quan đến các đường dẫn chung cho các FGF khác (Finch va Rubin, 2004). Tín hiệu FGF được bat đầu khi liên kết ái lực cao của phối tử FGF và thụ thể cùng nguồn gốc của nó gây ra sự giảm thiểu thụ thê, kích hoạt hoạt động tyrosine kinase nội tại của nó và quá trình tự phosphoryl hóa các miền tế bao chất của thụ thé (Powers và ctv, 2000). Phosphoryl hóa FRS2a và FRS2a của FGFR được kích hoạt liên kết với bộ điều hợp chứa miền SH2 Grb2.
Grb2 sau đó sẽ liên kết với SOS, GABI va Cbl thông qua miền SH3 của nó đề kích hoạt Ras/Raf/MAPK, bao gồm ERK MAPK, p38 MAPK va JNK MAPK. Các FGFR được kích hoạt cũng kích hoat phosphatidylinositol (PI)-3 kinase va STAT. FGFR tuyén dung va phosphoryl hoa PLCy. Trong số các thành viên của nhóm đồng bộ FGF, SEF và XFLRT3 là các protein xuyên màng và có thê tương tác trực tiếp với FGER.
SEF hoạt động như một bộ điều chỉnh tiêu cực bằng cách ảnh hưởng đến quá trình phosphoryl hóa của tầng MAPK ERK. XFLRT3 tạo thành một phức hợp với các thụ thể FGF và tăng cường tín hiệu FGF/FGER. Spry hoạt động ở mức Grb2 và/hoặc mức Raf để làm giảm tín hiệu FGF/FGER. MKP3 điều chỉnh tiêu cực tín hiệu FGF/FGFR bằng cách khử phospho hóa ERK được kích hoạt.
Ig-like | FGFRs (C' Ig-like Il Extracellular Ig-like III b/c : Membrane ụ Intracellular IR | `| gum Kinase domain © FGFs || HSPGs @ phosphorylation Hình 2.Con đường tín tiệu FGF/FGER cô dién (Xie và ctv, 2020). Hoạt tính sinh học và ứng dụng Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu ra đời nhằm xác định lại vai trò của KGF trong đó có cả các nghiên cứu in vitro và in vivo. Kết hợp kết qua của những nghiên cứu này đã xác nhận sự đa dạng về hoạt tính sinh học của KGE lên các tế bao biểu mô, bao gồm tăng sinh, di cư, biệt hóa, bảo vệ tế bào và ức chế quá trình chết theo chương trình, cũng như là những giả thiết cung cấp cơ sở cho thấy rằng KGF đóng vai trò quan trọng là một yếu tô cân bằng nội môi có chức năng chính là duy trì tính toàn vẹn của các mô biểu mô.