Giới thiệu dự án

  • Context & industry statistics

    • Thị trường cytokine toàn cầu dự kiến đạt USD 14,9 tỷ vào năm 2027, tăng trưởng CAGR 7,5 % (Source: Grand View Research, 2023).
    • Trong đó, Interleukin‑2 (IL‑2) chiếm ≈ 15 % thị phần các cytokine dùng trong liệu pháp miễn dịch và làm lành vết thương.

  • Problem statement

    • IL‑2 protein tái tổ hợp hiện nay ở Việt Nam vẫn thiếu nguồn cung, quy trình sản xuất chưa tối ưu về solubility, yield, và chi phí.
    • Các nhà cung cấp nước ngoài (e.g., Proleukin®, Aldesleukin) có giá > USD 200 /mg và thời gian nhập khẩu kéo dài > 3 tháng.

  • Project objectives

    1. Xây dựng dòng E. coli DH5α mang plasmid pET‑28a‑IL‑2 (Kan^R, 6×His‑tag).
    2. Biểu hiện protein IL‑2 trong E. coli BL21 (DE3) (RIL) ở ba nhiệt độ (37 °C, 28 °C, 16 °C).
    3. Tinh sạch bằng Ni‑NTA (Ni‑Sepharose) và refolding đa‑bước.
    4. Đánh giá yield, purity, solubility, và chi phí; đưa ra lộ trình mở rộng lên 10 L fermenter.

  • Solution approach & justification

    • Cloning: Amplify gen IL‑2 (GenBank CAA25292.1) với SacI / HindIII sites, ligate vào pET‑28a bằng T4 DNA ligase (3:1 insert:vector).
    • Expression: Sử dụng T7 promoter, IPTG (0,4 mM) kích thích ở OD_600 = 0,6–0,8. Thử nghiệm ba nhiệt độ để tối ưu solubility.
    • Purification: Ni‑NTA chromatography với gradient imidazole 20 → 400 mM, tiếp theo refolding qua urea giảm dần (4 M → 0,5 M).
    • Validation: SDS‑PAGE, Coomassie Blue, Western blot (anti‑6×His), Bradford assay, và mass spectrometry để xác nhận khối lượng 20 kDa.

  • Expected outcomes & measurable metrics

Metric Target Measurement method
Yield ≥ 2 mg IL‑2 L⁻¹ (đạt 1,85 mg L⁻¹ thực tế) Bradford (OD_595)
Purity ≥ 95 % Densitometry SDS‑PAGE
Soluble fraction ≥ 30 % ở 16 °C Fractionation + SDS‑PAGE
Cost per mg ≤ USD 8 Tổng chi phí nguyên liệu / mg sản phẩm
Scalability 10 L bioreactor, giữ ≥ 80 % yield Pilot‑scale fermentation
  • Scope & limitations
    • Chỉ tập trung vào IL‑2 (human), không bao gồm các biến thể fusion.
    • Đánh giá in‑vitro tính năng sinh học (độ hoạt tính) sẽ được thực hiện trong nghiên cứu tiếp theo.

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Current solution Pros Cons
Proleukin® (FDA‑approved recombinant IL‑2) High purity, GMP‑certified Giá cao (> USD 200 /mg), nhập khẩu chậm
E. coli Origami (DE3) expression (Ngô 2020) Đạt 19,3 % tổng protein Thiếu tối ưu solubility, không có refolding
BL21 (DE3) + pelB signal (Lê 2013) Độ biểu hiện cao Protein chủ yếu ở dạng IB, không có quy trình tinh sạch chi tiết

**Gap## Giới thiệu dự án

  • Context & industry statistics

    • Thị trường cytokine toàn cầu dự kiến đạt USD 14,9 tỷ vào năm 2027, tăng trưởng CAGR 7,5 % (Source: Grand View Research, 2023).
    • Trong đó, Interleukin‑2 (IL‑2) chiếm ≈ 15 % thị phần các cytokine dùng trong liệu pháp miễn dịch và làm lành vết thương.

  • Problem statement

    • IL‑2 protein tái tổ hợp hiện nay ở Việt Nam vẫn thiếu nguồn cung, quy trình sản xuất chưa tối ưu về solubility, yield, và chi phí.
    • Các nhà cung cấp nước ngoài (e.g., Proleukin®, Aldesleukin) có giá > USD 200 /mg và thời gian nhập khẩu kéo dài > 3 tháng.

  • Project objectives

    1. Xây dựng dòng E. coli DH5α mang plasmid pET‑28a‑IL‑2 (Kan^R, 6×His‑tag).
    2. Biểu hiện protein IL‑2 trong E. coli BL21 (DE3) (RIL) ở ba nhiệt độ (37 °C, 28 °C, 16 °C).
    3. Tinh sạch bằng Ni‑NTA (Ni‑Sepharose) và refolding đa‑bước.
    4. Đánh giá yield, purity, solubility, và chi phí; đưa ra lộ trình mở rộng lên 10 L fermenter.

  • Solution approach & justification

    • Cloning: Amplify gen IL‑2 (GenBank CAA25292.1) với SacI / HindIII sites, ligate vào pET‑28a bằng T4 DNA ligase (3:1 insert:vector).
    • Expression: Sử dụng T7 promoter, IPTG (0,4 mM) kích thích ở OD_600 = 0,6–0,8. Thử nghiệm ba nhiệt độ để tối ưu solubility.
    • Purification: Ni‑NTA chromatography với gradient imidazole 20 → 400 mM, tiếp theo refolding qua urea giảm dần (4 M → 0,5 M).
    • Validation: SDS‑PAGE, Coomassie Blue, Western blot (anti‑6×His), Bradford assay, và mass spectrometry để xác nhận khối lượng 20 kDa.

  • Expected outcomes & measurable metrics

Metric Target Measurement method
Yield ≥ 2 mg IL‑2 L⁻¹ (đạt 1,85 mg L⁻¹ thực tế) Bradford (OD_595)
Purity ≥ 95 % Densitometry SDS‑PAGE
Soluble fraction ≥ 30 % ở 16 °C Fractionation + SDS‑PAGE
Cost per mg ≤ USD 8 Tổng chi phí nguyên liệu / mg sản phẩm
Scalability 10 L bioreactor, giữ ≥ 80 % yield Pilot‑scale fermentation
  • Scope & limitations
    • Chỉ tập trung vào IL‑2 (human), không bao gồm các biến thể fusion.
    • Đánh giá in‑vitro tính năng sinh học (độ hoạt tính) sẽ được thực hiện trong nghiên cứu tiếp theo.

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Current solution Pros Cons
Proleukin® (FDA‑approved recombinant IL‑2) High purity, GMP‑certified Giá cao (> USD 200 /mg), nhập khẩu chậm
E. coli Origami (DE3) expression (Ngô 2020) Đạt 19,3 % tổng protein Thiếu tối ưu solubility, không có refolding
BL21 (DE3) + pelB signal (Lê 2013) Độ biểu hiện cao Protein chủ yếu ở dạng IB, không có quy trình tinh sạch chi tiết

Gap analysis

  • Solubility: Các nghiên cứu trước chưa tối ưu nhiệt độ thấp (≤ 20 °C) để tăng lượng protein hòa tan.
  • Purification: Thường dùng một bước elution 250 mM imidazole → purity < 90 %.
  • Cost: Không có phân tích chi phí quy mô.

Thiết kế hệ thống

Architecture diagram

Technology stack

Component Version / vendor
Vector pET‑28a (+Kan, 6×His) – 5 369 bp
Host strains E. coli DH5α (NEB C2987) ; BL21 (DE3) RIL (Novagen Cat#6940)
Polymerase Phusion High‑Fidelity DNA Polymerase (NEB M0530S)
Ligase T4 DNA Ligase (NEB M0202)
Enzymes SacI (NEB R0135) ; HindIII (NEB R0104)
Antibiotics Kanamycin 50 µg·mL⁻¹
Inducer IPTG (Isopropyl β‑D‑1‑thiogalactopyranoside) – 0,4 mM
Chromatography resin Ni‑NTA (Qiagen Ni‑Sepharose 6 Fast Flow)
Sonicator Misonix 3000 (30 s on/30 s off, total 10 min)
Spectrophotometer NanoDrop OneC (Thermo Fisher)
Software SnapGene v5.3, ImageJ v1.53e, Python 3.11 (Biopython 1.81)
Bioreactor Sartorius Biostat B + 10 L capacity (pH 7.0, 30 °C)

Database design (nếu cần)

  • PlasmidDB (SQLite) lưu trữ sequence, annotation, restriction sites, version.
CREATE TABLE PlasmidDB (
    id INTEGER PRIMARY KEY,
    name TEXT NOT NULL,
    sequence TEXT NOT NULL,
    backbone TEXT,
    insert_len INTEGER,
    antibiotic TEXT,
    tag TEXT,
    created_at TEXT
);

API design (tự động hoá quy trình)

# file: api/il2_workflow.py
import subprocess
from pathlib import Path

def run_command(cmd: str, cwd: Path):
    """Execute shell command and return stdout."""
    result = subprocess.run(cmd, shell=True, cwd=cwd, capture_output=True, text=True)
    if result.returncode != 0:
        raise RuntimeError(f"Command failed: {cmd}\\n{result.stderr}")
    return result.stdout

def ligate(insert: str, vector: str, molar_ratio: float = 3.0):
    """Perform T4 ligation via CLI (NEB ligation kit)."""
    cmd = f"ligate -i {insert} -v {vector} -r {molar_ratio}"
    return run_command(cmd, cwd=Path("/home/ds01/project"))

Methodology

Development methodology

  • Agile (Scrum) 2‑week sprint cycles.
  • Milestones (Gantt style)
Milestone Duration Deliverable
M1 – Plasmid construction 2 weeks Verified pET‑28a‑IL‑2 (Sanger)
M2 – Expression screening 3 weeks Optimum temperature (16 °C) & IPTG conc.
M3 – Purification protocol 2 weeks Purity ≥ 95 % (SDS‑PAGE)
M4 – Scale‑up pilot 4 weeks 5 L fermentation, yield ≥ 1,8 mg L⁻¹
**M5 – Cost analysisa