Đặt vấn đề Interleukin-2 (IL-2) là một cytokine với tac dụng điều hòa va tăng cường khả năng miễn dịch, là nhân tố nhân dòng và tăng cường hoạt tính gây độc tế bào của tế bào lympho T hoạt hóa, tế bảo giết tự nhiên (NK), tăng cường khả năng thực bào của bạch cầu đơn nhân, kích thích sự tổng hợp kháng thé của tế bào B và tổng hợp các cytokine thứ cấp khác như TNF (Tumor Necrosis Factor), INF-y v. Vì thé IL-2 được nghiên cứu để sử dụng dé điều trị một số loại ung thư, bao gồm ung thư biểu mô tế bào thận và khối u ác tính. Ngoài ra, các nghiên cứu đã chi ra rang điều trị bang IL-2 có thé cải thiện khả năng chữa lành của da, điều này có liên quan đến IL-2 trong quá trình chữa lành vết thương. Hơn nữa, các bệnh liên quan đến việc chữa lành vết thương bị suy giảm, chẳng hạn như bệnh tiêu đường và bệnh lupus ban đỏ hệ thống, có liên quan đến sự thiếu hụt IL-2 hoặc khiếm khuyết tín hiệu thụ thể IL-2 (Doersch và ctv, 2017).
Nhờ các chức năng trên IL-2 được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, làm lành vết thương và mỹ phẩm. Ngày nay, nhu cầu chăm sóc sức khỏe và sắc đẹp của con người ngày cảng cao. Do đó, nhu cầu thị trường của các sản phẩm này trở nên rat lớn và bùng nồ trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ở Việt Nam, IL-2 dang còn hạn chế về việc sản xuất và chưa được ứng dụng nhiều vào trong đời sống.
Vì vậy, với những đặc điểm đó cho thấy việc sản xuất protein IL-2 tái tổ hợp đã và đang được quan tâm trong nghiên cứu, phát triển. Hiện nay có rất nhiều chủng Z. coli dùng dé biểu hiện protein tái tổ hợp đã được phát triển và thương mai hóa vì những ưu điểm của nó như tốc độ tăng trưởng mạnh, chi phí thấp, kỹ thuật đơn giản, dé mở rộng quy mô va khả năng biểu hiện protein di loại cao giúp nâng cao hiệu suất kinh tế, giảm giá thành sản phẩm. Hầu hết protein IL-2 được sản xuất bang công nghệ protein tái tổ hợp.
Vì thế, chúng tôi tiễn hành nghiên cứu đề tài “Tạo dòng và biểu hiện gen mã hoá protein tái tô hợp IL-2 (Interleukin 2)” nhằm tạo protein IL-2 ứng dụng trong các lĩnh vực y học, làm lành vết thương và mỹ phẩm. Mục tiêu đề tài Tạo dòng đoạn gen mã hóa protein tái tổ hợp IL-2 vào vector pET28a và biểu hiện protein này trong tế bao Escherichia coli BL21 (DE3) (RIL). Nội dung thực hiện Tạo dòng vi khuẩn E. coli DH5a mang vector biéu hién pET28a-IL-2.
Biểu hiện protein mang gen mã hoa IL-2 trong tế bao E. Tinh sach tinh sach cua protein IL-2. TÔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về interleukin 2 2.
Giới thiệu chung Interleukin (IL) là một loại cytokine đầu tiên được cho là chỉ biểu hiện bởi bạch cầu nhưng sau đó đã được phát hiện là được sản xuất bởi nhiều tế bào cơ thé khác. Chúng đóng vai trò thiết yêu trong việc kích hoạt và biệt hóa các tế bào miễn dịch, cũng như tăng sinh, trưởng thành, di cư và bám dính. Do đó, chức năng chính cua interleukin là điều chỉnh sự tăng trưởng, biệt hóa và kích hoạt trong các phản ứng viêm và miễn dịch (Akdis M và ctv, 2011). Interleukin bao gồm một nhóm lớn các protein có thé tạo ra nhiều phản ứng trong tế bào va mô bang cách liên kết với các thụ thể có ái lực cao trên bề mặt tế bào.
Một IL cụ thé là IL-2 gần đây đã được biết đến như là một chất điều biến tiềm năng của quá trình chữa lành vết thương và cũng được sử dụng trong các nghiên cứu trên động vật để nghiên cứu các khía cạnh liên quan đến y học lâm sàng (Akdis M và ctv, 2011). cDNA của nó được nhân bản vào năm 1983 ở người (Taniguchi T và ctv, 1983). IL-2, ban đầu được gọi là yếu tố tăng trưởng tế bào T, đại điện cho một yếu tố trong một loạt các lymphokine được giải phóng trong quá trình một phản ứng miễn dịch. Interleukin-2 có tác dụng tăng sản xuất và hoạt động của một số bộ phận trong hệ thống miễn dịch của cơ thể (Robb RJ, 1984).
IL-2 có một loạt các hành động, bao gồm khả năng tăng cường hoạt động phân giải tế bào của tế bào T và tế bảo giết người tự nhiên (NK), tăng cường sản xuất globulin miễn dich bằng các tế bào B được kích hoạt, duy trì sự tăng sinh cân bằng nội môi của các tế bào T điều hòa (tế bào Treg), tao ra các tế bao bạch huyết bam sinh. Protein này thường được cơ thé sản xuất với số lượng nhỏ. Khi nồng độ IL-2 tăng lên, hệ thống miễn dịch sẽ khởi động (đặc biệt là tế bào T và tế bào giết người tự nhiên) để tấn công các tế bào ung thư. Đặc điểm gen mã hóa và cấu trúc phân tử protein IL-2 Về mặt cấu trúc, IL-2 là một cytokine loại I chuỗi ngắn với bốn bó xoắn ốc a (xoắn A-D) cấu hình “lên-lên-xuống-xuống” (up-up-down-down) điển hình của họ các cytokine này và có một đuôi tế bào chất ngắn không liên quan đến việc huy động các phân tử truyền tín hiệu tế bào chất.
Trong cấu hình này, các vòng xoắn được sắp xếp theo kiểu tương tác với các chuỗi thu thể của nó (Wang X và ctv 2005; Stauber DJ va ctv, 2006). Có ba thành phan thụ thé IL-2, IL-2Ra (CD25), IL-2RB (CD122) và IL-2Ry (CD132, còn được gọi là yC), tạo thành ba lớp thụ thé IL-2. Thụ thé có ái lực thấp chỉ chứa IL-2Ra, thụ thé có ái lực trung bình chứa IL-2RB và yC, va thụ thể có ái lực cao chứa cả ba chuỗi ( Arenas-Ramirez N và ctv, 2015; Mitra S và ctv, 2018). Tiểu đơn vị IL-2Rơ có bề mặt tiếp xúc lớn nhất trong cả ba tiêu đơn vị, có sự tương tác ở mức độ cao va ái lực lớn với IL-2 trên bề mặt tế bao do đó thụ thé trimer IL-2RaPyc có ái lực với IL-2 cao hơn khoảng 10 — 100 lần so với thụ thé dimer IL-2RByc (Huynh Nhật Lễ, 2021).
Các tiểu đơn vị thụ thé IL-2 (IL-2R) chủ yếu được tìm thấy trên các tế bào miễn dịch nhưng cũng có mặt trên bề mặt của các nhóm tế bảo da khác nhau, bao gồm tế bào sừng và nguyên bào sợi (Karen M Doersch và ctv, 2016). iam PhứchợpthụthỂ ¡| Phứchợpthụthểcó ` Z“ NM: coe lực cao ái lực trung bình x) > & > € > (Trimeric) (Dimeric) =N 'ẤT i } IL-2 gan với thụ thé. 11-2 gan với thy thé D Xoay hình anh IL-2RB ( Hình 2. Cấu trúc của IL-2 receptor và các phức hop tin hiệu của IL-2R (Coombs S,2019).
Cấu trúc không gian của IL-2 (wikipedia. IL-2 là một glycoprotein được tiết từ các tế bào T có trọng lượng phân tử 15-18 kDa, tùy thuộc vào nguồn gốc loài và sự glycosyl hóa. Cấu trúc IL-2 là 1 chuỗi polypetid duy nhất chứa bốn cấu trúc xoắn alpha. IL-2 thúc day sự tăng sinh, biệt hóa và tồn tại của các tế bào lympho T cũng như hoạt động của các tế bào tiêu diét tự nhiên (Natural killer cell — tế bao NK) trong hệ thống miễn dich bam sinh.
Đặc điểm hoạt động của IL-2 IL-2 kích hoạt ba con đường truyền tín hiệu chính, bao gồm con đường JAK-STAT, con đường RAS—MAP kinase và con đường PI3-kinase/AKT. Về mặt động học, IL-2 tương tác đầu tiên với IL-2Ra, dẫn đến thay đổi về hình dang trong IL-2, sau đó cho phép nó tương tác hiệu quả với IL-2RB, với yC (Tiehui Wang va ctv, 2018). Tín hiệu IL-2R thông qua Janus tyrosine kinase (JAK) và bộ chuyén đổi tin hiệu va bộ kích hoạt các con đường phiên ma (STAT) chủ yếu (Hình 2. Sau khi IL-2 liên kết với thụ thé của nó, đường như JAK1 được đưa vào IL-2R8, trong khi IL-Ry cần JAK3.
Việc JAK1 được chọn dường như phụ thuộc vào việc JAK3 được chon(Lan và ctv, 2008). Các JAK này sau đó phosphoryl hóa các miền của IL-2R, tiếp tục được chon và phosphoryl hóa STAT, chủ yếu là STAT5a và STATSb, ngoài ra còn có STAT1 và STAT3. Các STAT được phosphoryl hóa giảm dần và dimer này đi vào nhân nơi nó có thể kích hoạt nhiều loại gen tùy thuộc vào loại tế bào và các tín hiệu khác có mặt (Wang, Kirken và ctv, 1999). Ngoài STAT, các phân tử tín hiệu khác, protein từ miền tương đồng src (SH) và collagen (SHC), cũng được đưa vào đuôi tế bào chất IL-2RB sau quá trình phosphoryl hóa bởi JAK.
Sau đó, các protein SHC tiếp tục kích hoạt các con đường phosphatidylinositol-3-kinase (Pi3K) và protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK) (Lan và ctv, 2008). Trong cả con đường MAPK và con đường Pi3K, quá trình phosphoryl hóa SHC làm cho SHC liên kết với một phức hợp gồm nhiều protein, bao gồm Ras (Hình 2. Phức hợp này góp phần kích hoạt fibrosarcoma (RAF) tăng tốc nhanh chóng, kích hoạt protein kinase hoạt hóa bằng nguyên phân (MEK); MEK tiếp tục kích hoạt MAPK, còn được gọi là kinase tín hiệu điều hòa ngoại bào (ERK). Các ERK hoạt động như các yêu tố phiên mã cho nhiều chất trung gian của sự tăng sinh tế bào.
Trong lộ trình Pi3K, kích hoạt Ras sẽ kích hoạt Pi3K, tiếp tục kích hoạt Akt, kích hoạt mTOR (Wang va ctv, 1999; Orton và ctv, 2005). Ngoài ra, nhiều bước của cả hai tang này được điều chỉnh bởi cả cơ chế phản hồi từ bên trong quá trình và các sự kiện báo hiệu trong các quá trình khác. Các con đường MAPK và Pi3K đều liên quan đến sự tăng sinh tế bào và có khả năng góp phan vào việc mở rộng các tế bào T hỗ trợ dé đáp ứng với IL-2 (Doersch va ctv, 2017). Do đó, tín hiệu IL-2 rất phức tạp, phụ thuộc vào từng loại tế bào, được điều chỉnh rộng rãi và có khả năng góp phần mở rộng tế bào ở một số loại tế bào khác.
Chức năng sinh học IL-2 có vai trò thiết yếu trong các chức năng chính của hệ thống miễn dich, khả năng chịu đựng và miễn dịch, chủ yếu thông qua các tác động trực tiếp lên các tế bảo T. Trong tuyến ức, nơi các tế bào T trưởng thành, IL-2 ngăn ngừa các bệnh tự miễn bằng cách thúc 6 đây sự biệt hóa của một số tế bào T chưa trưởng thành thành các tế bào T điều tiết, ngăn chặn các tế bào T khác có khả năng tấn công các tế bào khỏe mạnh bình thường trong cơ thê. IL-2 cũng thúc day quá trình biệt hóa tế bào T thành tế bao T hỗ trợ và vào tế bào T nhớ khi tế bào T ban đầu cũng được kích thích bởi một kháng nguyên, do đó giúp cơ thể chống lại nhiễm trùng (Liao và ctv, 2011).