Nghiên cứu: Ảnh hưởng của FBS lên sự phát triển tế bào sợi từ buồng trứng lợn

Khóa luận CN Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của huyết thanh bò đến khả năng phân lập, tăng sinh tế bào fibroblast từ mô buồng trứng lợn.

• Tác giả: Luu Khai Nhien
• Người hướng dẫn: PTS. Nguyễn Ngọc Tân
• Trường học: Nong Lam University — Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Effect Of Fetal Bovine Serum On Isolation And Proliferation Of Fibroblast Cells Derived From Porcine Ovarian Tissue
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2017-2021
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• AFFIRMATION AND COMMITMENT
• ABSTRACT
• TABLE OF CONTENTS
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• 1. CHAPTER 1
• 1.1. Problem statement
• 1.2. Objectives
• 1.3. Contents
• 1.3.1. Content 1: Effect of FBS concentration on fibroblast cells isolation
• 1.3.2. Content 2: Effect of FBS on fibroblast cells proliferative activity
• 2. CHAPTER 2: Animal cell culture
• 2.1. Animal cells
• 2.2. Ovary and ovarian tissue
• 2.3. Animal cell culturing
• 2.4. Cell culture medium
• 2.5. Overview of fibroblast cells
• 2.5.1. Origin and main features of fibroblast cells
• 2.5.2. Structure of fibroblast cells
• 2.6. Fetal Bovine Serum
• 2.6.1. FBS source and collection methods
• 2.6.2. Source of FBS
• 2.6.3. FBS collection methods
• 2.6.4. Composition of FBS
• 2.6.5. Effects of FBS on cell culture
• 2.6.6. Ethical stand on the use of FBS in cell culture medium and recent takes on artificial-based sera in cell culture
• 3. CHAPTER 3: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Time and location
• 3.2. Chemicals
• 3.3. Equipments
• 3.4. Sample collection and transportation
• 3.5. Ovarian tissue collection and primary culture method
• 3.5.1. Cells counting
• 3.6. Experimental design
• 3.6.1. Content 1: Effect of FBS concentration on fibroblast cells isolation
• 3.6.2. Content 2: Effect of FBS on fibroblast cells proliferative activity
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Content 1: Effect of FBS concentration on fibroblast cells isolation
• 4.2. Content 2: Effect of FBS on fibroblast cells proliferative activity
• 5. CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS
• 5.1. Conclusions
• 5.2. Suggestions
• REFERENCES

Tóm tắt

I. Khám phá vai trò của FBS lên tế bào sợi buồng trứng lợn

Trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào động vật, huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum - FBS) được xem là một thành phần gần như không thể thiếu, đóng vai trò then chốt trong việc hỗ trợ sự sống và tăng sinh tế bào. Đặc biệt, nghiên cứu về ảnh hưởng của FBS lên tế bào sợi buồng trứng lợn có ý nghĩa quan trọng, mở ra nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học sinh sản và y học tái tạo. Tế bào sợi (fibroblast) là loại tế bào chính trong mô liên kết, có khả năng sản xuất các thành phần của chất nền ngoại bào như collagen, fibronectin, và proteoglycan. Chúng đóng vai trò trung tâm trong quá trình sửa chữa mô và duy trì cấu trúc của các cơ quan. Tế bào sợi buồng trứng, một loại tế bào soma buồng trứng, có liên quan trực tiếp đến sự phát triển của nang noãn và quá trình sinh sản. Việc phân lập và nuôi cấy thành công loại tế bào này là bước đi nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh lý tế bào, bảo quản lạnh, và đặc biệt là kỹ thuật chuyển nhân tế bào soma (SCNT). FBS cung cấp một hỗn hợp phức tạp các yếu tố tăng trưởng, hormones, vitamin và protein cần thiết mà môi trường nuôi cấy tổng hợp khó có thể tái tạo hoàn chỉnh. Các thành phần này kích thích tế bào bám dính, phân chia và duy trì sự sống của tế bào (cell viability) trong điều kiện in vitro. Tuy nhiên, việc sử dụng FBS cũng đi kèm với nhiều thách thức, đòi hỏi các nhà khoa học phải tìm ra nồng độ FBS tối ưu để vừa đảm bảo hiệu quả nuôi cấy, vừa giảm thiểu chi phí và các biến số không mong muốn. Nghiên cứu của Lưu Khải Nhiên (2023) đã cung cấp những dữ liệu cụ thể về cách nồng độ FBS khác nhau tác động đến khả năng phân lập và tăng sinh của tế bào sợi buồng trứng lợn.

1.1. Hiểu rõ về huyết thanh thai bò FBS và thành phần

Huyết thanh thai bò (FBS) là một sản phẩm phụ của ngành công nghiệp giết mổ, được thu thập từ máu của bào thai bò. Đây là một hỗn hợp sinh học phức tạp, chứa hàng trăm loại protein, yếu tố tăng trưởng, hormones và các chất dinh dưỡng vi lượng. Các thành phần quan trọng nhất bao gồm albumin (giúp duy trì áp suất thẩm thấu), transferrin (vận chuyển sắt), fibronectin (thúc đẩy sự bám dính của tế bào) và các yếu tố tăng trưởng như IGFs (Insulin-like Growth Factors) và PDGF (Platelet-derived Growth Factor). Nhờ hàm lượng immunoglobulin thấp, FBS ít gây ra phản ứng miễn dịch trong môi trường nuôi cấy tế bào, làm cho nó trở thành lựa chọn ưu tiên so với các loại huyết thanh khác. Sự phong phú về dưỡng chất này giúp FBS trở thành một chất bổ sung "vàng" trong hầu hết các quy trình cell culture.

1.2. Đặc điểm và chức năng của tế bào sợi fibroblast

Tế bào sợi (fibroblast) có nguồn gốc từ trung mô và là thành phần chính của mô liên kết. Chúng có hình dạng thoi, dẹt và có nhiều nhánh bào tương. Chức năng cốt lõi của fibroblast là tổng hợp và duy trì chất nền ngoại bào (ECM), bao gồm collagen, elastin và proteoglycan, tạo ra một khung cấu trúc cho các mô. Trong buồng trứng, tế bào sợi buồng trứng không chỉ cung cấp sự hỗ trợ cấu trúc mà còn tham gia vào quá trình tái cấu trúc mô trong chu kỳ sinh sản. Khi được nuôi cấy in vitro, chúng thể hiện đặc tính bám dính và phát triển thành một lớp đơn, một đặc điểm được tận dụng để làm lớp tế bào nuôi dưỡng (feeder layer) cho các loại tế bào khác, chẳng hạn như trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF).

II. Thách thức trong nuôi cấy và sự phụ thuộc vào huyết thanh

Mặc dù FBS là một thành phần quan trọng, việc sử dụng nó trong nuôi cấy tế bào không phải không có thách thức. Vấn đề lớn nhất là sự thay đổi chất lượng giữa các lô sản xuất (batch-to-batch variation). Do FBS là sản phẩm sinh học, thành phần chính xác của nó có thể khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc, thời điểm thu hoạch và quy trình xử lý. Sự không đồng nhất này có thể dẫn đến kết quả thí nghiệm thiếu nhất quán và khó tái lập. Hơn nữa, FBS tiềm ẩn nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn hoặc prion, đòi hỏi quy trình kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt. Vấn đề đạo đức liên quan đến phương pháp thu thập huyết thanh thai bò cũng là một chủ đề gây tranh cãi, thúc đẩy cộng đồng khoa học tìm kiếm các giải pháp thay thế. Các môi trường nuôi cấy không huyết thanh (serum-free media) đã được phát triển, nhưng chúng thường được thiết kế riêng cho một dòng tế bào cụ thể và có chi phí cao. Trong nhiều trường hợp, hiệu quả tăng sinh tế bào của chúng vẫn chưa thể vượt qua môi trường chứa FBS. Do đó, việc xác định nồng độ FBS tối thiểu nhưng vẫn đảm bảo hiệu quả tối đa là một bài toán quan trọng. Việc này không chỉ giúp giảm chi phí mà còn hạn chế sự biến thiên trong thực nghiệm, đồng thời giảm bớt các lo ngại về đạo đức. Nghiên cứu về ảnh hưởng của FBS lên tế bào sợi buồng trứng lợn chính là một nỗ lực để giải quyết thách thức này, tìm ra một quy trình chuẩn hóa và hiệu quả cho việc phân lập và nhân rộng tế bào.

2.1. Vấn đề về tính nhất quán và nguy cơ khi dùng FBS

Sự biến thiên giữa các lô FBS là một thách thức khoa học lớn. Theo Jochems et al. (2002) và van der Valk et al. (2010), sự khác biệt về thành phần yếu tố tăng trưởng và hormone giữa các lô có thể làm thay đổi đáng kể tốc độ tăng sinh tế bào, hình thái tế bào và thậm chí cả sự biệt hóa tế bào. Điều này làm ảnh hưởng trực tiếp đến tính lặp lại của các thí nghiệm. Bên cạnh đó, nguy cơ nhiễm tạp nhiễm sinh học luôn hiện hữu, mặc dù các nhà sản xuất đã áp dụng các biện pháp sàng lọc nghiêm ngặt. Những yếu tố này buộc các phòng thí nghiệm phải kiểm tra kỹ lưỡng mỗi lô FBS mới trước khi sử dụng, gây tốn kém thời gian và nguồn lực.

2.2. Tầm quan trọng của một môi trường nuôi cấy tối ưu

Một môi trường nuôi cấy tối ưu là yếu tố quyết định đến sự thành công của một thí nghiệm cell culture. Môi trường này phải cung cấp đủ chất dinh dưỡng, duy trì độ pH ổn định và bảo vệ tế bào khỏi các tác nhân gây hại. Đối với tế bào sợi buồng trứng lợn, môi trường cần thúc đẩy sự bám dính của các mảnh mô (explants) trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp và hỗ trợ sự nhân lên nhanh chóng trong giai đoạn cấy chuyền (subculture). Việc xác định chính xác nồng độ FBS cần thiết ở mỗi giai đoạn giúp tạo ra một quy trình hiệu quả, tối đa hóa số lượng tế bào thu được trong thời gian ngắn nhất, một yêu cầu cốt lõi trong công nghệ sinh học sinh sản và các ứng dụng in vitro.

III. Phương pháp tối ưu nồng độ FBS cho nuôi cấy tế bào sơ cấp

Nuôi cấy sơ cấp là bước đầu tiên và quan trọng nhất trong việc phân lập tế bào từ mô. Giai đoạn này nhằm mục đích khuyến khích tế bào di chuyển ra khỏi mảnh mô và bắt đầu tăng sinh trên bề mặt đĩa nuôi cấy. Nghiên cứu của Lưu Khải Nhiên (2023) đã thiết kế một thí nghiệm chi tiết để xác định ảnh hưởng của nồng độ FBS trong giai đoạn này. Các mảnh mô buồng trứng lợn được nuôi cấy trong 8 ngày với các nồng độ FBS khác nhau. Thí nghiệm so sánh 5 phương pháp: không có FBS (đối chứng), 10% FBS trong suốt 8 ngày, 20% FBS trong suốt 8 ngày, và hai phương pháp kết hợp (10% trong 4 ngày đầu và 20% trong 4 ngày sau; 20% trong 4 ngày đầu và 10% trong 4 ngày sau). Kết quả cho thấy FBS có ảnh hưởng rõ rệt đến sự sống của tế bào. Trong môi trường không có FBS, gần như không có tế bào nào phát triển. Việc bổ sung 20% FBS liên tục (phương pháp E) mang lại mật độ tế bào cao nhất. Tuy nhiên, một phát hiện thú vị là không có sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê (P>0.05) giữa phương pháp sử dụng 20% FBS liên tục và phương pháp sử dụng 10% FBS trong 4 ngày đầu sau đó tăng lên 20% (phương pháp C). Lựa chọn phương pháp C (10%-20%) không chỉ mang lại hiệu quả tương đương mà còn giúp tiết kiệm lượng huyết thanh sử dụng, giảm chi phí và các biến số tiềm tàng. Điều này cho thấy trong giai đoạn đầu, tế bào chỉ cần một lượng vừa đủ các yếu tố tăng trưởng để bám dính và bắt đầu di chuyển, sau đó cần nồng độ cao hơn để thúc đẩy tăng sinh tế bào mạnh mẽ.

3.1. Thiết kế thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng FBS khi phân lập

Thí nghiệm được bố trí trên các đĩa 6 giếng, mỗi giếng chứa 8 mảnh mô (explants) từ buồng trứng lợn. Môi trường nuôi cấy cơ bản là DMEM có bổ sung kháng sinh. Năm nghiệm thức về nồng độ FBS được áp dụng: (A) 0%; (B) 10% trong 8 ngày; (C) 10% trong 4 ngày đầu, 20% trong 4 ngày sau; (D) 20% trong 4 ngày đầu, 10% trong 4 ngày sau; và (E) 20% trong 8 ngày. Môi trường được thay đổi vào ngày thứ 4. Sau 8 ngày, tế bào được thu hoạch và đếm để đánh giá mật độ. Thiết kế này cho phép đánh giá cả tác động của nồng độ ổn định và nồng độ thay đổi theo thời gian lên quá trình phân lập tế bào sợi.

3.2. Kết quả phân lập tế bào sợi từ mô buồng trứng lợn

Kết quả từ Bảng 4.1 của nghiên cứu cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0.05) giữa các nghiệm thức. Nhóm đối chứng (0% FBS) có mật độ tế bào rất thấp. Nhóm sử dụng 20% FBS liên tục (E) cho mật độ cao nhất (log giá trị là 5.57). Tuy nhiên, nhóm C (10%-20%) và D (20%-10%) không có sự khác biệt ý nghĩa so với nhóm E. Cụ thể, nhóm C cho mật độ tế bào cao (log giá trị 5.51). Dựa trên kết quả này, phương pháp bổ sung 10% FBS trong 4 ngày đầu và 20% trong 4 ngày sau được chọn là tối ưu cho nuôi cấy sơ cấp, vì nó cân bằng giữa hiệu quả và chi phí.

IV. Hướng dẫn xác định nồng độ FBS cho sự tăng sinh tế bào

Sau khi phân lập thành công, tế bào được cấy chuyền (subculture) để nhân lên số lượng lớn. Giai đoạn này đòi hỏi một môi trường nuôi cấy tối ưu để thúc đẩy quá trình tăng sinh tế bào nhanh chóng và hiệu quả. Nghiên cứu tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của FBS ở giai đoạn này bằng cách so sánh ba nồng độ: 10%, 15% và 20%. Tế bào sau nuôi cấy sơ cấp được gieo vào các đĩa 12 giếng và theo dõi trong 7 ngày. Mật độ tế bào được đếm vào các ngày 1, 3, 5 và 7 để xây dựng đường cong tăng trưởng. Kết quả cho thấy cả ba nồng độ đều hỗ trợ sự tăng trưởng của tế bào, nhưng với hiệu quả khác nhau. Nồng độ 20% FBS cho số lượng tế bào cao nhất ở ngày 3, 5 và 7, vượt trội đáng kể so với nồng độ 10%. Tuy nhiên, sự khác biệt giữa nồng độ 15% và 20% lại không có ý nghĩa thống kê (P>0.05). Đường cong tăng trưởng của tế bào ở cả ba nồng độ đều theo hình chữ S điển hình, bao gồm pha tiềm phát (lag phase) trong 24 giờ đầu, pha tăng trưởng lũy thừa (exponential phase) từ ngày 1 đến ngày 5, và pha suy vong (death phase) vào ngày 7. Thời gian nhân đôi quần thể (Population Doubling Time - PDT) cũng được tính toán, cho thấy nồng độ FBS càng cao thì PDT càng ngắn, nghĩa là tế bào phân chia càng nhanh. Với kết quả này, việc sử dụng 15% FBS được xem là lựa chọn tối ưu cho giai đoạn cấy chuyền, vì nó mang lại hiệu quả tăng sinh tế bào gần tương đương với 20% nhưng tiết kiệm chi phí hơn.

4.1. Phân tích đường cong tăng trưởng của tế bào sợi

Đường cong tăng trưởng là một công cụ trực quan để đánh giá sự sống của tế bào (cell viability) và tốc độ tăng sinh. Dữ liệu từ Hình 4.4 của nghiên cứu cho thấy rõ các pha tăng trưởng. Pha lũy thừa, kéo dài từ ngày 1 đến ngày 5, là giai đoạn quan trọng nhất, phản ánh sức khỏe và khả năng nhân lên của quần thể tế bào. Ở giai đoạn này, các nghiệm thức 15% và 20% FBS cho thấy độ dốc đường cong cao hơn rõ rệt so với 10%, chứng tỏ tốc độ phân chia nhanh hơn. Việc tế bào bước vào pha suy vong sau ngày 5 là do cạn kiệt chất dinh dưỡng và tích tụ các sản phẩm chuyển hóa độc hại trong một hệ thống nuôi cấy kín.

4.2. Thời gian nhân đôi quần thể PDT và ý nghĩa

Thời gian nhân đôi quần thể (PDT) là thời gian cần thiết để số lượng tế bào trong quần thể tăng lên gấp đôi. Đây là một chỉ số quan trọng để đánh giá hiệu quả của môi trường nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu chỉ ra PDT của các nhóm 10%, 15% và 20% FBS lần lượt là 68.64, 57.12 và 56.40 giờ. Có thể thấy, việc tăng nồng độ FBS từ 10% lên 15% đã rút ngắn đáng kể thời gian nhân đôi. Tuy nhiên, sự khác biệt về PDT giữa 15% và 20% là không lớn, củng cố thêm cho kết luận rằng 15% FBS là nồng độ hiệu quả và kinh tế cho giai đoạn cấy chuyền.

V. Ứng dụng kết quả về FBS trong công nghệ sinh học sinh sản

Việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào sợi buồng trứng lợn có ý nghĩa ứng dụng to lớn, đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ sinh học sinh sản. Tế bào sợi sau khi được nhân lên với số lượng lớn có thể được sử dụng làm nguồn tế bào cho (donor cell) cho kỹ thuật chuyển nhân tế bào soma (Somatic Cell Nuclear Transfer - SCNT), hay còn gọi là nhân bản vô tính. Chất lượng và số lượng tế bào cho có ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ thành công của quá trình tạo phôi và phát triển của phôi sau này. Một quần thể tế bào khỏe mạnh, đồng nhất và đang trong pha tăng trưởng mạnh mẽ sẽ cung cấp vật liệu di truyền tốt nhất cho SCNT. Bên cạnh đó, các tế bào này còn có thể được sử dụng làm lớp tế bào nuôi dưỡng (feeder layer) trong các hệ thống đồng nuôi cấy tế bào (co-culture). Chẳng hạn, chúng có thể hỗ trợ sự phát triển của phôi trong giai đoạn đầu của thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) bằng cách tiết ra các yếu tố tăng trưởng và cytokine cần thiết, tạo ra một vi môi trường tương tự như trong cơ thể mẹ. Ngoài ra, việc thiết lập được một ngân hàng tế bào đông lạnh từ tế bào sợi buồng trứng lợn cũng rất quan trọng cho công tác bảo tồn nguồn gen của các giống lợn quý hiếm. Quy trình nuôi cấy hiệu quả, được chuẩn hóa dựa trên ảnh hưởng của FBS, là tiền đề để thu được đủ số lượng tế bào chất lượng cao cho tất cả các ứng dụng này.

5.1. Nền tảng cho chuyển nhân tế bào soma SCNT

Chuyển nhân tế bào soma (SCNT) là một kỹ thuật đột phá, nhưng hiệu quả của nó phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng tế bào cho. Tế bào cho cần phải ở một giai đoạn nhất định của chu kỳ tế bào (thường là pha G0/G1) để có thể tái lập trình một cách hiệu quả trong tế bào chất của noãn. Một quy trình nuôi cấy tế bào tối ưu, sử dụng nồng độ FBS phù hợp, giúp tạo ra một quần thể tế bào sợi đồng bộ và khỏe mạnh. Điều này làm tăng khả năng phát triển thành công của phôi nhân bản, một bước tiến quan trọng trong chăn nuôi và y học tái tạo.

5.2. Tiềm năng trong thụ tinh trong ống nghiệm IVF

Trong các quy trình thụ tinh trong ống nghiệm (IVF), việc nuôi cấy phôi trong môi trường in vitro là một giai đoạn đầy thách thức. Sử dụng một lớp tế bào sợi buồng trứng làm lớp nuôi dưỡng có thể cải thiện đáng kể tỷ lệ phát triển của phôi. Lớp tế bào này mô phỏng môi trường tử cung, cung cấp các tín hiệu hóa học và vật lý cần thiết cho phôi bám dính và phát triển. Việc có thể sản xuất hàng loạt lớp tế bào nuôi dưỡng chất lượng cao từ quy trình đã được tối ưu hóa sẽ góp phần nâng cao hiệu quả của các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY — HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES PORCINE OVARIAN TISSUE Major : BIOTECHNOLOGY Student : LUU KHAI NHIEN Student’s ID : 17126101 Year : 2017 — 2021 Thu Duc City, 03/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY — HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES UNDERGRADUATE THESIS EFFECT OF FETAL BOVINE SERUM ON ISOLATION AND PROLIFERATION OF FIBROBLAST CELLS DERIVED FROM PORCINE OVARIAN TISSUE Advisor Student NGUYEN NGOC TAN, PhD. | LUU KHAI NHIÊN Thu Duc City, 03/2023 ACKNOWLEDGEMENT First of all, I want to thank Nong Lam University, along with teachers in the Faculty of Biological Sciences and Research Institute for Biotechnology and Environment for providing me the necessary knowledge and facilities to complete this bachelor degree. I am profoundly grateful to my advisor, Dr. Nguyen Ngoc Tan, who I disappointed so frequently, for the continuous support and encouragement throughout my time conducting this thesis.

Without his guidance, I would not have been who I am today. I look forward for a chance to work with him again in the future. I am thankful to Ut Hao slaughterhouse for providing the samples needed for this thesis. Many thanks to my friends and lab mates for assisting me with various tasks.

I could not have finished my work without your support, encouragement and mutual learning. Finally, I want to express my deepest regards to my family. If not for their support, financially and emotionally, I could not gain what I have today. And for my girlfriend, who has been with me since the beginning, I am grateful for all your love and faith in me.

AFFIRMATION AND COMMITMENT My name is Luu Khai Nhien, student’s ID: 17126101, class) DHI7SHA (Phone number: 0703280301, Email: [e-mail]) majoring in Biotechnology, Faculty of Biological Sciences, Nong Lam University — Ho Chi Minh City. This undergraduate thesis is mine and conducted by myself. All data and information in this thesis are completely honest and objective. I take full responsibility in front of the committee for these commitments.

Thu Duc City, March 17", 2023 Student’s signature Luu Khai Nhien 1 ABSTRACT The aim of this study was to investigate the effect of fetal bovine serum (FBS) supplemented in culture medium for fibroblast cells derived from porcine ovarian tissue. Tissue explants were submitted to primary culture in medium with different FBS concentrations for 8 days with a medium change at day 4. Results showed that between the two treatments of supplementing 10 and 20% FBS throughout 8 days, a significant difference (5.05) of cells harvested was found. No differences in harvested cell numbers were observed between supplementing 10 — 20% and 20 — 10% at first 4 days - later 4 days (5.

Three levels of FBS concentration (10, 15, and 20%) were evaluated for the subculture medium through a growth curve and population doubling trme (PDT). There were significant differences between supplementations of 10 and 20% FBS on day 3 (4.45, respectively), and day 7 (4. No differences were recorded between the 15 and 20% treatments. The PDT of 10, 15, and 20% treatments were 68.

The growth curve with the exponential phase spanning from day 1 to day 5 was determined. In conclusion, supplementation of 10% — 20% FBS in first 4 days — later 4 days of primary culture medium and subculture in medium with 15% FBS enhanced the total number of fibroblast cells isolated and proliferated derived from porcine ovarian tissue. Keywords: FBS, fibroblast cells, porcine ovary tissue, primary culture, subculture. 1H TABLE OF CONTENTS AFFIRMATION AND COMMITMENT ssunuswssssssnasueonanswnevesunsuasecnuuesvessusnesxexmmesoaroannsuns 1 STB CRAG D sssesesscaees sees esac esa SSE GSS OSC TS WSR 11 TVABLE-OE COMNITEIN TS bac: sss5558xsãcus283su2S8cboexbltsbz3inlsead qui dgÿssssapl3ns8duugoig12räi4sg0ngagaxuiSesaSSE 1V LIST OF ABBREVIATIONS G06 n0 ong tà GHE4G040689808681n18Mg: mene VI LIST OF TABLES ennscnusmcne ous eee mene Eo Em vill LIST OF BIG UIR ES cueeeessaiesssgisieosnbielunisrtnesrdurggotggtrgEogburgrzlgrkgrdegnjdktigbszrgigrdl30di0i003/81999-0080048 1x (0)57.

1 Delle PEG DIGG S(EGTIIGTEspsesenuieeebeoidsebdtseielegESHGU.GK-ENGGA41G-0EKGSHHD4GS. 1 12s OD SB VES se csmccecccanansancnas senses es pn enesinaenina serena stra sen oa tape ces ER IR ER ER ORATOR 1 {Fs 86) 0106) 0c) ee eeee 1 CHAPTER 2. denial Cell eu tt 6 sssssistsetiitogElSiEGEIEEEGIGIESEIEDISIISEEGSEBSIGGIIGGESSENGI.HASERSEUSEERiSS0MSĐE 2 20L: LuilA (M4 HH AI LLOẾILĐtGo. syssi50eknk6xx4g gà hot 3Egd 2E tui đu at asnpcast sve sib kas Ta ain hie ER Nae 2 2a1<2:; OVALY Bild, 6VaTIäf t§S UẾ see cerrse sue cssreseemesnswasoemaureseuseansseaseuunescarccmemen mame 2 2.

Animal cell culturing. Overview ot fibroblast GEÌÏS 2x ccssunesesen reassure seneiaum marchers ase cen une se 53083002 5 2. Origin and main features of fibroblast ceÏÏS.--- -- 2-5222 <++x*+z£+zeseeszesresree 5 2:2: Struchire of fibroblast Cells ssossssssssssiosisi129G. Isolation and culture of fibroblast €eÏÏS.3, PCtAl BOVINE SCHILD csscassxssreescennoe mm aneesanenena umes onexneeeussmasnesns suemenaneesmranenncmommmnenaneats 7 2.

FBS source and collection methods .cceccesccescesceeseeseeeceeseeeceeseeeeeseeeseeseesenes Z 2 Sclel2 SOULCE OL FBS eerrecenineee eresreeemeseysrunnenes cunrreaee memes Serneers EERIE 7 23.2, FBS COUSCHOT MEHOUS cocecscccerevncnmsesesnencerenausnuenamererenemnmaauceemammmmnaNe 8 1V 2:0: CÔTHIDO Hồ Dễ sex snnsE105 3x gang 194810 0633800011093458459488380G893S5005100936E0184E055/2048000518090GGE. Effects of FBS on cell cuÏfure. Ethical stand on the use of FBS in cell culture medium and recent takes on ariiitial-baséd Séfa wii Cell Gul GURUS: sung nhanh cxaemase A055) S81308554GEH4GSSELSGIRASkDSSGEAGS0S3838/8E28B43888 9 CHAPTER 3. MATERIALS AND METHOIDS.

Time and Ïocafiom. g4 ng TH HH 000000 xem 11 Sid. lVTHI[ETHÌN sgszusgtgszts9g250208333859308503:G2H80936:0:00008903381300S93058004GJSSEDH30GSSIEEZXĐESEERSS.01E 11 3:3; CHGITGHÍBIsiissssessssatnis t2 6nsssdbtesessdiftssaleSlitpesildtsaszatSkg2cisgi ura saunieveutdtenetin resus 11 3. Equipmientiatid 4G HHD©5csssesssnseoertdsibid d4 E8i0ĐS0000đ590G3SBCSSSESHEGGEB.GSEáaTƒGH:TiiGtTGGG GY ngiionnaadinstoitiatiostoStEiBCSSGSGINHSSIG-SSSAIGBE(SEBIGSIQDISGGESGEISHSRESEH300180501088 11 3.

Sample collection and transpOrfafIOII. Ovarian tissue collection and primary culture method. 13 3:51: Cells CO Uniti TTTGHTOeseesseeeeneeetitbriEGELIEIGUHISĐGSEERGUSGSTGES.6; EXPeni Di Gi tal. Q6STDÍ-seesesesesetteoiaseiitiaituggr4G0SSEU53003H0BSIĐRGINGSEBGSSR0.

Content 1: Effect of FBS concentration on fibroblast cells isolation. Content 2: Effect of FBS on fibroblast cells proliferative activity. RESULTS AND DISCUSSION.-cSccceeiirrerrrrrree 18 A alles, SSUES scecsssrnsssear eres anneseanscre nee ete ar etceteracae 18 4. Content 1: Effect of FBS concentration on fibroblast cells isolation.

Content 2: Effect of FBS on fibroblast cells proliferative actIVIty. CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS.---cS-cccceccerey 25 Sl. CONCHISIONS emcee cesensrnemheaeay nearer emo 25 Sa: SUB SESTIONS sssesessssrssbsrsssEiHES339555G046053G1888V4Đt48X.3832D98S4DESSHGEEEEBSSSRSSHRSSHSHSIESSS012838313ES5000182/039/0480 25 REPEREIN CESS nay gang g0L60054013092188510E08303S0053300800013U10 0ESENGHHNEESSGESSETECSH.G0100139/0H0/3890080000188 26 VI LIST OF ABBREVIATIONS ABAM Antibiotic — Antimycotic CHO Chinese Hamster Ovary DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium D-PBS Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ECM Extracellular Matrix EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EtOH Ethanol FBS Fetal Bovine Serum IGF Insulin-Like Growth Factors ITS Insulin, Transferrin, And Selenite MEM Minimum Essential Medium MMP Matrix Metalloproteinase PDT Population Doubling Time SCNT Somatic Cell Nuclear Transfer vil LIST OE TABLES ‘Table 3. Experuniental đesiari 167 COMTEHE 1 wssscsccssncoranernevasnsssnnsecnuvasvepsewswexensensoacsenass 16 Table 4.

Effect of different FBS concentrations in culture medium after 8 days of OU) (UN Sterne ee ee er oe 19 Table 4. Effect of different FBS concentrations in culture medium on fibroblast cells [0 00) 00 tcl e:t) (0) ee ee eee eee ee eee ee ee en eee ee eee ee 21 vill LIST OE EIGURES HIơuFE:2. Pig TEproductive SY SteM. osevnscnsuneswasannenasucerany enavesuommanaveraurennesenmaurxommeraremmsuend Figure 2.

History of fbroblast disCOVeLy. Collection of the ovary with fallopian tube attached. Petri dishes with different rinsing solutIOns.-- 5-5555 5<>+s<+ss+sss+ 12 Figure 3. Excision of the ovary to obtain ovarian fISSU€.

Culture plate with explants left to adhesion. Culture plate with added medium. Rinsing with D-PBS after the removal of old culture medium. 500 uwL addition of 0.

Cell pellet after centr1fUg1ng. Dilute cells to 5x10 cells/mL with DMEM. Fibroblast cells subculture in 12-well pÏafe.0025 m? Neubauer improved bright-line hemocytometet. Ovarian tissue explants and outgrowth on Day 4 of explant seeding.

Ovarian tissue explants and outgrowth on Day 8 of explant seeding. Subculture of fibroblast cells at different FBS concentration. Growth curve of fibroblast cells derived from porcine ovarian tissue. Problem statement Isolation and proliferation of fibroblast cells are the first and crucial steps in generating materials for many experiments on cell physiology, cryopreservation, and somatic cell nuclear transfer (SCNT).

In many established protocols for fibroblast cells culture, fetal bovine serum (FBS) is considered an indispensable ingredient in the culture medium (Reuisi ef a/, 2009; Hu et ai, 2012; Phelan and May, 2015; Mestre- Citrinovitz et al, 2016; Bryja et al, 2020). Since its discovery, FBS had been proven to possess many important factors for the in vitro growth and proliferation of cells derived from animals (Carrel and Ebeling, 1922; Treadwell and Ross, 1963). Fibroblast cells are mostly found in connective tissue with the ability to grow vigorously (Tran Thi Khanh Hoa, 2018). Fibroblast cells are also responsible for the formation of collagens, proteoglycans, fibronectin, and other proteins in the extracellular matrix (Lu ef a/, 2011).

When cultured in vitro, fibroblast cells express monolayer properties, which is utilized as feeder layers for co-culture procedures with different types of cell (Glass ef al, 1979; Kuzan and Wright, 1981; Kuzan and Wright, 1982; Allen and Wright, 1984; Yeoman ef a/, 2005). Chinese hamster ovary (CHO) cell line is used as a model for research, utilizing cells isolated from ovarian tissue (Omasa ef al, 2010). Hence, the evaluation of FBS when supplemented at various concentrations to the capability of isolation and proliferation of cells derived from porcine ovarian tissue is needed. Objectives To assess the optimal concentration of fetal bovine serum supplemented in primary or secondary culture medium to maximize the quantity of fibroblast cells collected after culturing and proliferating.

Contents Content 1: Effect of FBS concentration on fibroblast cells isolation Content 2: Effect of FBS on fibroblast cells proliferative activity CHAPTER 2. Animal cell culture 2. Animal cells Animal cells are found in mammals, including humans, and are a type of eukaryotic cell. These cells are distinct for their absence of a cell wall and their possession of organelles such as mitochondria and lysosomes.

In animals, there are four main types of tissue: epithelial, connective, muscular, and nervous. Epithelial tissue covers the body's surface and lines internal organs, consisting of tightly packed cells that create a barrier between the internal and external environment. Connective tissue offers support and connects different parts of the body, comprised of various cells including fibroblast cells and extracellular matrix elements such as collagen and proteoglycans. Muscular tissue is responsible for movement, divided into three categories: skeletal, smooth, and cardiac muscle.

The skeletal muscle controls voluntary movement, the smooth muscle controls involuntary movement, and the cardiac muscle powers blood circulation. Nervous tissue transmits and processes signals in the body, made up of neurons and glial cells. Neurons transmit signals and glial cells provide support and protection for neurons. Ovary and ovarian tissue The ovary is a part of the female reproduction system in mammals, responsible for the production of ova and secretion of endocrines.

In pigs, the ovaries are located in the lower abdomen area along with oviducts and uterine horns (Figure 2. On the surface, the ovary is covered by the germinal epithelium while the tunica albuginea and stroma (ovarian cortex and medulla) make up the internal structure. The ovarian cortex contains ovarian follicles, fibroblast cells, collagen, and elastic fibers. Nerves, blood, and lymphatic vessels reside in the ovarian medulla.

In mice, tissue from Chinese hamster ovary (CHO) is used in cell culture to produce a reliable model for research and production purposes (Omasa ef a/, 2010). Since fibroblast cells can originate from the ovarian cortex, this organ is suitable for the primary cultivation of fibroblast cells. In other notes, pig ovaries are considered waste in the meat industry, thus the recovery of the said organ is undeniably easy and cheap. Rectum Vagina Ovary Vulva 7 Firmnberia vid ~Ovi ụ duct Urethral Orilice \ Uterine Horm Figure 2.

Pig reproductive system.com/pig- anatomy-and-terminology. Animal cell culturing Cell culture involves the growth of cells, either taken from animal tissue or whole animals, by providing them with essential nutrients and growth factors. Cell culture enables individual cells to behave as standalone units, similar to microorganisms like bacteria or fungi. These cells can divide via mitosis, leading to a growing population until limited by factors such as nutrient depletion.

Cell cultures usually consist of cells of a single type, which can be either genetically identical, forming a homogeneous population, or show some genetic variation, forming a heterogeneous population (Butler, 2004).