mở đầu ATG của các gen có ưu điểm như đơn giản, tỷ lệ đa hình cao, chỉ phí thấp, liên quan trực tiếp tới vùng mã hóa nên gần đây chỉ thị này đã được phát triển rộng rãi trên một số cây trồng ăn quả quan trọng như nhãn (Chen và ctv, 2010), nho (Guo và ctv, 2012),. Năm 2014, Rathore và ctv đã thực hiện nghiên cứu đánh giá sự ôn định di truyền của cây Cleome gynandra vi nhân giống bằng chỉ thị SCoT. Nghiên cứu được thực hiện với 24 primer và 7 cây vi nhân giống được chọn ngẫu nhiên. Trong tổng số 24 primer được sang lọc, có 15 primer tạo các dai băng sáng va rõ.
Tat cả 15 primer tạo ra tông cộng 65 băng, với trung bình là 4,3, dao động từ 2 - 7 băng trên mỗi primer. Không có tính đa hình nào được phát hiện ở cây tái sinh và cây mẹ. Kiểu dải đơn hình ở cây vi nhân giống và cây me thu được từ phân tích SCoT đã xác nhận tính ổn định di truyền của cây trồng in vitro và chứng minh độ tin cậy của hệ thống vi nhân giống. Năm 2019, Kamiñska và ctv đã tiến hành nghiên cứu đánh giá sự ồn định di truyền của cây con Taraxacum pieninicum sau khi bảo quản tăng trưởng chậm trong thời gian dài bằng cách sử dụng chỉ thị ISSR và SCoT.
Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt nào được quan sát khi sử dụng 16 primer ISSR và 12 primer SCoT giữa cây con tái sinh sau khi bảo quản và cây được trồng từ hạt trong đất. Hơn nữa, các chỉ thị SCoT có hiệu quả nhất trong việc sàng lọc bộ gen của 7: pieninicum và rat hữu ích đối với các loài vi nhân giống và có nguy cơ tuyệt chủng khác nhau thuộc họ Asteraceae. Kỹ thuật ly trích DNA thực vật 2. Phương pháp ly trích DNA DNA là vật liệu mang thông tin di truyền cấu tạo bởi các nucleotide, là yêu tố mở đầu cho mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử.
ĐỀ có thé tiến hành các thí nghiệm phân tích sâu hơn thì việc thu nhận một lượng DNA lớn và sạch là điều kiện tiên quyết. Đối với ly tích DNA thì mối quan tâm hàng đầu là thu nhận các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tôi đa, ít bị huỷ do các tác nhân cơ học hay hoá học. Quá trình ly trích DNA cần thực hiện ở nhiệt độ thấp dé ức chế enzyme nội bào (Hồ Huynh Thuy Dương, 2002). Quy trình ly trích DNA gồm có 3 bước cơ bản: Bước 1: phá vỡ màng tế bảo.
Thông thường, tế bảo hoặc mô được nghiền trong hỗn hợp dung dịch đệm chiết. Hỗn hợp này sẽ phá vỡ vách tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường và phân huỷ các protein gắn với DNA. Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Có thé sử dụng dung dịch CTAB/NaCl dé tạo phức với polysaccharides và protein rồi kết tủa chúng.
Loại bỏ protein và phức hợp CTAB — polysaccharide -protein bằng hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). Phenol va chloroform sẽ làm biến tính protein. Ngoài ra chloroform làm cho pha nước va pha hữu co dé dang tach ra. Isoamyl alcohol hạn chế tao bot trong suốt quá trình ly trích.
Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid va sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ. Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại. Bước 3: kết tủa nucleic acid. Kết tủa trong ethanol lạnh.
Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa, vì vậy chúng có thé được loại bỏ bằng cách kết tủa trong isopropanol. Nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa phải rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn sót lại. Phương pháp định tính và định lượng DNA thu nhận được phân tích định tính và định lượng bằng một số phương pháp như đo mật độ quang, điện di.
Định lượng bằng quang phổ kế: Phương pháp này cho phép ước tính nồng độ tương đối của acid nucleic có trong mẫu sau khi ly trích. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine va pyrimidine. Giá trị mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm của mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa trên mối tương quan: 1 đơn vị OD 260 nm tương ứng với nồng độ 50 ng/ul đối với dung dịch chứa DNA sợi đôi và 40 ng/ul đối với dung dich chứa DNA và RNA sợi đơn. Dé kiểm tra độ tinh khiết của dung dịch, người ta bỗ sung thêm giá trị OD 280 nm được đo với tỉ lệ OD 260 nm /OD 280 nm nằm trong khoảng 1,8 đến 2.
Định tính bằng phương pháp điện di: Nguyên lý của phương pháp này dựa trên đặc tính cấu trúc của nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của điện trường nó sẽ chuyên động về cực dương. Độ linh động của các phân tử này được phân tích trên bảng gel và phụ thuộc vao 2 tiêu chí: khối lượng phân tử và nồng độ các thành phan gel. Việc lựa chọn các loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc kích thước trung bình của các đoạn phân tử nucleic acid cần phân tách.
Gel agarose: loại gel thông dụng nhất, ding dé phân tách những đoạn DNA có kích thước từ 0,5 - 200 kb. Gel polyacrylamide: được dùng dé phân tách những đoạn có kích thước nhỏ, dưới 1000 bp. Kỹ thuật PCR 2. Khái niệm và nguyên tắc của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR về bản chất là phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm không cần sự hiện diện của tế bào.
Phương pháp PCR sẽ khuếch đại đoạn DNA nằm giữa cặp primer. Theo nguyên tắc trên thì yêu cầu của phản ứng PCR phải biết trình tự đoạn DNA, đặc biệt là trình tự 2 đầu của đoạn DNA cần khuếch đại. PCR được thực hiện dựa trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo chiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước sau: Bước 1: biến tính Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94 - 95°C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bồ sung mới.
Bước 2: bắt cặp Giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho phép các primer bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 30 - 70°C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút. Bước 3: kéo dải Đây là giai đoạn tông hợp sợi đơn bé sung đọc theo chiều 5’ - 3° của 2 primer nhờ hoạt động của enzyme polymerase. Nhiệt độ được tăng lên 72°C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến 1 phút.
10 Nguyên tắc cơ bản của phản ứng là khuếch đại 1 đoạn gen quan tâm bằng primer chuyên biệt kết hợp với hoạt động của enzyme chịu nhiệt polymerase trong một chu trình nhiệt hợp lý. Tác động của primer xem như yếu tố đánh dấu cho hoạt động của polymerase khi nó được gắn kết vào DNA mạch đơn làm khuôn cho giai đoạn bắt cặp. Primer bên trái tác động lên dây DNA 3’ - 5’ được gọi là primer F, primer bên phải tác động lên dây 5’ - 3’ còn gọi là primer R. Thành phần phản ứng PCR DNA bản mẫu.
Nước khử ion. Cây phát sinh loài Tất cả các phương pháp được sử dụng dé nghiên cứu sự đa dang của quan thể cuối cùng đều dẫn đến dữ liệu phân tử rất phức tạp được biểu thị bằng các dải trên bảng điện di. Đề trích xuất thông tin sinh học từ dữ liệu thô này, các nhà khoa học cần có sự hỗ trợ của máy tính bằng phần mềm phân tích dữ liệu thực nghiệm. Các thông số như đa dạng kiểu gen, da dạng kiểu hình, khoảng cách di truyền giữa quan thé được tính toán theo công thức cua Nei (1978) Trước khi tìm hiểu phải lựa chọn phương pháp và phần mềm phù hợp, chúng ta cần tìm hiểu một số thuật ngữ về cây phát sinh loài nhằm cung cấp những thông tin cơ bản đề hiểu và giải thích cây phát sinh loài.
Một số thuật ngữ: điểm cùng (đại diện cho các cá thể, còn được gọi là đơn vi tiến hóa OTU- Operational Taxonomic Units), điểm giữa (dung dé phân loại hay thể hiện tổ tiên của cá thể), nhánh (xác định các mối quan hệ của cá thể ở hiện tại với tổ tiên của chúng), chiều đài nhánh (thể hiện thời gian tiến hóa của loài), gốc (là một tô tiên chung của các cá thé được biéu diễn trên cây phát sinh loài). Cây phát sinh loài có thể được vẽ bằng nhiều cách. Có thể vẽ cây phát sinh loài trong đó chiều dai của cành biéu thị thời gian tiến hóa. Cũng có thé vẽ một cái cây có thời gian tiến hóa hiển thị trên các nhánh.
Cây phát sinh loài có thể vẽ có hoặc không có sốc. Hiện nay, có hai phương pháp đang được sử dụng phổ biến nhất là UPGMA và 11 Neighbor - Joining, cả hai phương pháp đều tạo cây tiến hóa từ ma trận khoảng cách gen và độ tương đồng gen giữa các quan thé. UPGMA: đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất dé xây dựng cây phát sinh loài và phản ánh mức độ giống nhau về kiểu hình giữa các OTU. Với một ma trận cho trước, thuật toán sẽ nhóm một cặp đơn vi tiến hóa có khoảng cách nhỏ nhất (có mức tương đồng gen cao nhất) với giá trị bằng nửa khoảng cách giữa hai OTU.
Sau đó, cặp đơn vi tiễn hóa này được xem như một OTU mới. Neighbor - Joining: đây là một trong những phương pháp xây dựng cây tiến hóa với ít nhánh nhất. Nguyên tắc của phương pháp này là tìm ra thứ tự các cặp hàng xóm (neighbor) hợp lý nhất làm giảm tổng chiều dai của cây tiến hóa. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.
Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Thời gian: tháng 7/2023 đến tháng 12/2023. Địa điểm: phòng thí nghiệm Sinh học Tích hợp Thực vật, khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Vật liệu nghiên cứu 3.