Khảo sát điều kiện thu nhận màng cellulose từ Gluconacetobacter xylinus cho enzyme lipase

Khảo sát điều kiện thu nhận màng cellulose từ gluconacetobacter xylinus nhằm cố định enzyme lipase, ứng dụng trong công nghệ sinh học.

• Tác giả: Huỳnh Bảo Ngân
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Trần Khánh Linh
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
• Đề tài: Khảo Sát Điều Kiện Thu Nhận Màng Cellulose Từ Gluconacetobacter Xylinus Để Cố Định Enzyme Lipase
• Loại tài liệu: Đồ Án Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN
• 1.1. Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn
• 1.2. Tổng quan về Gluconacetobacter xylinus
• 1.2.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus
• 1.2.2. Quá trình sinh tổng hợp BC
• 1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn
• 1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn trên thế giới
• 1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam
• 1.3.3. Tiền xử lý BC bằng phương pháp acetyl hóa
• 1.4. Tổng quan về enzyme lipase
• 1.4.1. Các phản ứng được xúc tác bởi enzyme lipase
• 1.4.2. Nguồn enzyme lipase
• 1.4.3. Cấu trúc và cơ chế xúc tác
• 1.4.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme lipase
• 1.5. Xử lý, phát triển hương vị và cải thiện chất lượng thực phẩm
• 1.5.1. Ngành công nghiệp bánh mì
• 1.5.2. Polymer phân hủy sinh học
• 1.5.3. Ngành công nghiệp chất tẩy rửa
• 1.6. Các nghiên cứu về việc cố định enzyme lipase
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vi sinh vật, môi trường nhân giống – môi trường thu BC, enzyme và hóa chất
• 2.2. Quy trình nhân giống, sản xuất – xử lý BC và cố định lipase trên BC
• 2.2.1. Quy trình nhân giống và thu nhận BC
• 2.2.2. Quy trình xử lý BC trước khi cố định
• 2.2.3. Quy trình cố định lipase
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Thí nghiệm
• 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ khuấy đến khả năng thu BC thích hợp
• 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vi sinh vật ban đầu đến khả năng thu nhận BC
• 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh tổng hợp BC
• 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát hiệu suất cố định enzyme lipase
• 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt độ enzyme lipase cố định trên BC
• 2.5. Phương pháp phân tích
• 2.5.1. Phương pháp thu hồi, xác định hàm lượng sinh khối và BC
• 2.5.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate
• 2.5.3. Xác định hoạt độ enzyme lipase tự do và enzyme lipase đã được cố định
• 2.5.4. Hiệu suất cố định
• 2.5.5. Đặc tính cấu trúc của BC
• 2.5.6. Phương pháp đo quang phổ FTIR
• 2.5.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Ảnh hưởng các chế độ khuấy đến khả năng thu BC thích hợp
• 3.2. Ảnh hưởng nồng độ vi sinh vật ban đầu đến khả năng thu nhận BC
• 3.3. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh tổng hợp BC
• 3.4. Khảo sát hiệu suất cố định enzyme lipase
• 3.5. Khảo sát hoạt độ enzyme cố định trên BC
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn

Màng cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC) là một loại polymer tự nhiên được sản xuất bởi các vi sinh vật như Gluconacetobacter xylinus. BC có độ tinh khiết cao hơn so với cellulose thực vật do không chứa lignin và các tạp chất khác. Đặc điểm này giúp BC có khả năng hấp thụ nước tốt hơn và độ xốp cao hơn, làm cho nó trở thành vật liệu lý tưởng cho nhiều ứng dụng trong y sinh và công nghiệp thực phẩm. Nghiên cứu cho thấy BC có thể được sử dụng như một chất mang để cố định enzyme, giúp cải thiện hoạt tính và tính ổn định của enzyme trong các quá trình công nghiệp. Theo Czaja và cộng sự (2007), BC có thể được ứng dụng trong việc đóng vết thương, làm khuôn cho các thí nghiệm in vitro và in vivo, nhờ vào tính tương tác sinh học và không độc hại của nó.

1.1. Đặc điểm của Gluconacetobacter xylinus

Gluconacetobacter xylinus là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, có khả năng sản xuất BC với năng suất cao. Vi khuẩn này phát triển tốt trong môi trường có độ pH từ 3 đến 7 và nhiệt độ từ 25 đến 30 độ C. Quá trình sinh tổng hợp BC của G. xylinus diễn ra qua nhiều bước, bắt đầu từ việc phosphoryl hóa glucose cho đến việc tổng hợp chuỗi glucan. Điều này cho thấy khả năng sinh tổng hợp BC phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và môi trường. Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2019) đã chỉ ra rằng việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy có thể nâng cao năng suất BC, từ đó mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong công nghiệp.

II. Ứng dụng của enzyme lipase

Enzyme lipase là một trong những enzyme quan trọng trong công nghiệp, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol thành glycerol và acid béo tự do. Lipase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp tẩy rửa. Tuy nhiên, enzyme này thường gặp khó khăn trong việc duy trì hoạt tính do bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, pH và thời gian bảo quản. Việc cố định enzyme lipase lên các chất mang như BC có thể cải thiện tính ổn định và khả năng tái sử dụng của enzyme. Theo nghiên cứu của Kim và cộng sự (2017), việc cố định lipase trên BC có thể giúp giảm thiểu chi phí sản xuất và nâng cao hiệu suất trong các ứng dụng công nghiệp.

2.1. Tình hình nghiên cứu về cố định enzyme lipase

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc cố định enzyme lipase lên các chất mang khác nhau như alginate, acrylic resin và BC có thể cải thiện hoạt tính và tính ổn định của enzyme. Tuy nhiên, các phương pháp cố định hiện tại vẫn còn nhiều hạn chế về chi phí và hiệu suất. Nghiên cứu này nhằm khảo sát khả năng cố định enzyme lipase trên BC, từ đó tìm ra phương pháp tối ưu cho việc sử dụng enzyme trong công nghiệp. Việc sử dụng BC không chỉ giúp giảm chi phí mà còn góp phần bảo vệ môi trường bằng cách giảm thiểu việc khai thác cellulose từ thực vật.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này được thực hiện thông qua việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thu nhận BC từ Gluconacetobacter xylinus. Các yếu tố được khảo sát bao gồm chế độ khuấy, nồng độ vi sinh vật ban đầu và pH môi trường. Mỗi yếu tố sẽ được điều chỉnh để tìm ra điều kiện tối ưu cho việc thu nhận BC. Sau khi thu nhận, BC sẽ được sử dụng để cố định enzyme lipase và so sánh hoạt độ của enzyme cố định với enzyme tự do. Phương pháp này không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình thu nhận BC mà còn đánh giá hiệu quả của việc cố định enzyme trên BC.

3.1. Quy trình thực hiện thí nghiệm

Quy trình thực hiện thí nghiệm bao gồm các bước nuôi cấy vi sinh vật, thu nhận BC và cố định enzyme lipase. Đầu tiên, vi sinh vật sẽ được nuôi cấy trong môi trường lỏng với các điều kiện khác nhau. Sau đó, BC sẽ được thu nhận và xử lý trước khi cố định enzyme. Cuối cùng, hoạt độ enzyme sẽ được xác định để đánh giá hiệu quả của quá trình cố định. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về khả năng thu nhận BC mà còn mở ra hướng đi mới cho việc ứng dụng enzyme lipase trong công nghiệp.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc thu nhận màng cellulose từ Gluconacetobacter xylinus có thể được tối ưu hóa thông qua việc điều chỉnh các yếu tố như pH, nồng độ vi sinh vật và chế độ khuấy. Kết quả cho thấy BC có thể được sử dụng hiệu quả để cố định enzyme lipase, từ đó cải thiện hoạt tính và tính ổn định của enzyme. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao trong việc phát triển các ứng dụng công nghiệp. Đề xuất cho các nghiên cứu tiếp theo là khảo sát thêm các điều kiện khác có thể ảnh hưởng đến hiệu suất thu nhận BC và khả năng cố định enzyme.

4.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc khảo sát các loại vi sinh vật khác có khả năng sản xuất BC và khả năng cố định enzyme trên các chất mang khác nhau. Điều này sẽ giúp mở rộng ứng dụng của BC trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ thực phẩm đến y sinh. Ngoài ra, việc nghiên cứu các phương pháp xử lý BC trước khi cố định enzyme cũng cần được thực hiện để nâng cao hiệu suất và tính ổn định của enzyme trong các ứng dụng công nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose - BC) là một polymer sinh học tự nhiên được tổng hợp bởi một số chủng vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus. Khác với cellulose thực vật (Plant Cellulose - PC) thường lẫn lignin và hemicellulose đòi hỏi quá trình xử lý hóa học phức tạp dễ làm tổn hại cấu trúc cơ lý, BC sở hữu mạng lưới sợi nano liên kết chặt chẽ với độ tinh khiết cao, diện tích bề mặt lớn, độ xốp cao, khả năng giữ nước và độ bền kéo vượt trội cùng tính tương thích sinh học tốt. Những đặc tính này giúp màng BC trở thành chất mang tiềm năng trong kỹ thuật cố định tế bào và enzyme.

Enzyme lipase (triacylglycerol acylhydrolases, E.C 3.1.1.3) là chất xúc tác sinh học quan trọng, giữ vai trò thủy phân liên kết ester trong triglyceride để tạo thành glycerol và các acid béo tự do, đồng thời xúc tác cho các phản ứng tổng hợp như ester hóa và transester hóa. Lipase được ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm (cải thiện hương vị phô mai, sữa, tăng chất lượng bột nhào bánh mì), công nghiệp chất tẩy rửa, mỹ phẩm và tổng hợp polymer phân hủy sinh học. Tuy nhiên, việc ứng dụng enzyme lipase tự do ở quy mô công nghiệp gặp phải rào cản lớn do độ bền nhiệt và tính ổn định sinh hóa trung bình, khó thu hồi sau phản ứng và giá thành thương mại rất cao (khoảng 650 SGD/100g lipase trích xuất từ Candida rugosa và 182 SGD/100mg lipase trích xuất từ Pseudomonas cepacia theo báo giá thương mại của Sigma-Aldrich).

Các nghiên cứu cố định lipase trước đây trên các chất mang nhân tạo như hạt từ tính nano $\text{Fe}_3\text{O}_4$, nhựa acrylic resin, kaolinite hoặc celite thường có chi phí cao hoặc yêu cầu điều kiện kỹ thuật phức tạp. Trong khi đó, việc cố định lipase trên hạt alginate/BC chỉ đạt hiệu suất thấp (khoảng 25% – 47%) và phải sử dụng alginate từ tảo biển. Mặt khác, BC nguyên bản có bản chất ưa nước và kỵ béo, trong khi enzyme lipase lại hoạt động tối ưu trên bề mặt phân cách pha kỵ nước. Do đó, việc nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy thu nhận màng BC từ Gluconacetobacter xylinus và biến tính bề mặt màng bằng phương pháp acetyl hóa để cố định enzyme lipase là yêu cầu thực tiễn cần được khảo sát.

Nhiệm vụ nghiên cứu

Đề tài thực hiện 4 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ khuấy đến khả năng sinh tổng hợp và thu nhận màng BC.
2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi sinh vật ban đầu đến khả năng thu nhận màng BC.
3. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng đến sự sinh tổng hợp màng BC.
4. So sánh hoạt độ của enzyme lipase cố định trên màng BC với enzyme lipase tự do (thông qua khảo sát hiệu suất cố định và cấu trúc bề mặt màng).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus (được cung cấp từ Bộ sưu tập giống của Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc gia TP.HCM), màng cellulose vi khuẩn (BC) sinh tổng hợp từ môi trường nước dừa già, và chế phẩm enzyme lipase dạng bột thương mại (cung cấp bởi Công ty TNHH Dược phẩm Trung ương Navaco).
• Phạm vi không gian: Các thí nghiệm nuôi cấy, phân tích hóa sinh và xác định hoạt độ enzyme được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM. Phân tích kính hiển vi điện tử quét (SEM) được thực hiện tại Trung tâm Đào tạo Khu Công nghệ cao (Quận 9, TP.HCM).
• Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai từ ngày 06/02/2020 đến ngày 10/08/2020.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Đặc điểm vi sinh vật và cơ chế sinh tổng hợp BC: Chủng Gluconacetobacter xylinus (trước đây gọi là Acetobacter xylinum) là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc thuộc họ Acetobacteraceae, sinh trưởng trong dải nhiệt độ 25 – 30°C và pH 3 – 7. Con đường sinh hóa tổng hợp BC gồm 4 giai đoạn: (1) Glucose được phosphoryl hóa thành glucose-6-phosphate; (2) Glucose-6-phosphate đồng phân hóa thành glucose-1-phosphate; (3) Glucose-1-phosphate chuyển hóa thành uridine diphosphate glucose (UDP-glucose); (4) Chuỗi glucan liên kết $\beta\text{-1,4-glucosidic}$ được tổng hợp từ UDP-glucose.
• Cơ chế xúc tác của lipase: Enzyme lipase có cấu trúc nếp gấp $\alpha/\beta\text{-hydrolase}$ với bộ ba xúc tác Serine, Histidine và Aspartate/Glutamate mang mô típ đồng nhất $\text{G-X}_1\text{-S-X}_2\text{-G}$. Cơ chế phản ứng diễn ra qua quá trình acyl hóa tạo nhóm trung gian tứ diện (tetrahedral) mang điện tích âm tại nguyên tử oxy của carbonyl, sau đó giải phóng sản phẩm qua bước deacyl hóa với sự tham gia của nucleophile (nước hoặc alcohol).
• Cơ chế acetyl hóa biến tính màng BC: BC nguyên bản chứa mật độ nhóm hydroxyl (-OH) dày đặc nên có tính ưa nước cao. Dưới sự xúc tác của iodine ($\text{I}_2$), acetic anhydride phản ứng với các nhóm hydroxyl trên sợi cellulose, thay thế nhóm -OH bằng nhóm acetyl ($-\text{COCH}_3$), làm giảm tính ưa nước và tăng tính kỵ nước/ưa béo của màng BC, tạo điều kiện thuận lợi cho lipase hấp phụ và duy trì hoạt tính.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Môi trường nuôi cấy: Môi trường nhân giống (rắn và lỏng) và môi trường thu nhận BC (MBC) sử dụng nền nước dừa già (1000 mL) bổ sung sucrose (10 g/L), cao nấm men (1 g/L), $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$ (8 g/L), $(\text{NH}_4)_2\text{HPO}_4$ (2 g/L), điều chỉnh pH = 5 bằng acid acetic (đối với MBC bổ sung 5 mL acid acetic), tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút.
• Quy trình xử lý acetyl hóa màng BC: 7,7 g BC ướt trong 200 mL nước cất được tiệt trùng ở 121°C trong 15 phút, để ráo nước, sau đó phản ứng với 20 mL acetic anhydride bổ sung $0,125\text{ mM}$ iodine ở 80°C trong 60 phút. Dung dịch được làm nguội, làm mất màu iodine bằng $\text{Na}_2\text{S}_2\text{O}_3$ bão hòa, rửa màng lần 1 bằng alcohol 75%, rửa lần 2 bằng acetic anhydride, rửa lại bằng nước cất và sấy khô ở 60°C.
• Quy trình cố định enzyme lipase: 1 g màng BC đã acetyl hóa được bổ sung 2 mL dung dịch enzyme lipase nồng độ $5\text{ mg/mL}$ (pha trong đệm $\text{Na}_3\text{PO}_4$ $100\text{ mM}$, pH 7,0), ủ khuấy trộn ở 25°C trong 24 giờ trong bóng tối. Màng sau đó được rửa sạch bằng dung dịch đệm $\text{Na}_3\text{PO}_4$ $100\text{ mM}$ pH 7,0 và sấy ở 60°C trong 4 giờ.
• Phương pháp phân tích hóa sinh và cấu trúc:
  • Xác định mật độ sinh khối và khối lượng BC: Đo mật độ quang $\text{OD}_{620\text{nm}}$ dịch nuôi cấy sau mỗi 24 giờ; ly tâm thu hồi sinh khối và màng BC ở tốc độ $4000\text{ rpm}$ trong 15 phút, sấy đối lưu ở 60°C đến khối lượng không đổi.
  • Định lượng tổng carbohydrate: Phương pháp phenol – sulfuric acid (Nielsen, 2010), đo độ hấp thụ quang ở bước sóng $490\text{ nm}$ và đối chiếu với đường chuẩn glucose ($0 - 50\text{ mg/L}$).
  • Xác định hiệu suất cố định enzyme: Định lượng nồng độ protein hòa tan còn dư trong dịch sau cố định theo phương pháp Lowry (Waterborg, 2009) sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu và đường chuẩn albumin lòng trắng trứng ($2\text{ mg/mL}$) tại bước sóng $750\text{ nm}$.
  • Xác định hoạt độ enzyme lipase: Phương pháp chuẩn độ thể tích acid béo giải phóng (Soares và cộng sự, 1999) với cơ chất dầu olive nhũ hóa trong gum arabic, ủ ở 37°C trong 20 phút, dừng phản ứng bằng hỗn hợp acetone:ethanol (1:1) và chuẩn độ bằng $\text{NaOH}$ với chỉ thị phenolphthalein. Một đơn vị hoạt độ (U) được quy ước là lượng enzyme giải phóng $1\text{ }\mu\text{mol}$ acid béo tự do trong 1 phút.
  • Phân tích hình thái và cấu trúc: Kính hiển vi điện tử quét (SEM) tại điện thế $1\text{ kV}$ và $5\text{ kV}$ (mẫu sấy $60^\circ\text{C}$, phủ carbon và platinum); phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR Jasco FI-IR 4700) trong dải số sóng $400 - 4000\text{ cm}^{-1}$.
• Phương pháp xử lý số liệu: Xử lý và tính toán thống kê mô tả, phân tích phương sai ANOVA trên các phần mềm Excel, SPSS và vẽ đồ thị bằng Origin 2019.

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 tổng hợp các cơ sở lý luận về cấu trúc phân tử cellulose, đặc tính vượt trội của cellulose vi khuẩn so với cellulose thực vật (đường kính sợi nano của BC chỉ bằng 1/100 sợi PC, diện tích bề mặt lớn, độ tinh khiết cao không chứa lignin). Chương này trình bày chi tiết về phân loại vi sinh vật sinh tổng hợp BC, đặc điểm sinh lý của chủng Gluconacetobacter xylinus, 4 bước sinh hóa tổng hợp chuỗi polymer glucan, cùng các ứng dụng của BC trong công nghệ thực phẩm (sản xuất nata de coco, chất nhũ hóa trong surimi, màng bao kháng khuẩn BC/nisin, màng bảo quản thịt tươi với Lactococcus lactis), trong y học (màng gạc điều trị vết thương XCell, Gengiflexn) và xử lý môi trường.

Đồng thời, chương tổng quan chi tiết về enzyme lipase (E.C 3.1.1.3), các phản ứng thủy phân và phản ứng chuyển hóa ester (ester hóa, transester hóa, alcohol hóa, acid hóa), các nguồn thu nhận lipase (động vật, thực vật, vi sinh vật) và cấu trúc tâm xúc tác. Tác giả phân tích các nghiên cứu cố định lipase trên các loại giá thể trước đây (nhựa acrylic, hạt nano $\text{Fe}_3\text{O}_4$, kaolinite, hạt alginate/BC) và làm rõ cơ chế acetyl hóa màng BC với xúc tác iodine nhằm chuyển đổi bề mặt từ ưa nước sang kỵ nước để tương thích với enzyme lipase.

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc chủng vi sinh vật, hóa chất tinh khiết 99%, thiết bị đo đạc và thành phần các môi trường nhân giống, môi trường thu nhận BC (MBC) từ nước dừa già. Quy trình thực nghiệm được thiết kế qua 5 nội dung thí nghiệm:

• Thí nghiệm 1: Khảo sát 4 chế độ khuấy trộn (Ủ tĩnh - A1, Khuấy từ - A2, Lắc 100 rpm - A3, Lắc 150/200 rpm - A4) ở nồng độ giống $0,04\text{ g/L}$, theo dõi mật độ sinh khối, khối lượng BC và hàm lượng đường tiêu thụ mỗi 24 giờ.
• Thí nghiệm 2: Khảo sát 4 nồng độ giống cấy ban đầu ($0,01\text{ g/L}$; $0,04\text{ g/L}$; $0,07\text{ g/L}$; $0,1\text{ g/L}$) ở chế độ ủ tĩnh.
• Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu (pH 4, pH 5, pH 6) với nồng độ giống $0,04\text{ g/L}$ trong điều kiện ủ tĩnh.
• Thí nghiệm 4: Đánh giá hiệu suất cố định lipase thông qua định lượng protein hòa tan theo Lowry và xác định sự thay đổi cấu trúc màng qua SEM và FTIR.
• Thí nghiệm 5: Xác định hoạt độ xúc tác thủy phân của lipase tự do, lipase cố định trên BC nguyên bản và lipase cố định trên BC acetyl hóa theo phương pháp chuẩn độ thể tích acid béo giải phóng.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm và bàn luận cơ chế sinh học, hóa học qua từng nội dung:

• Ảnh hưởng của chế độ khuấy: Chế độ khuấy từ giúp vi sinh vật sinh trưởng nhanh nhất trong dịch lỏng, đạt mật độ sinh khối $0,7426\text{ g/L}$ sau 4 ngày và $0,7807\text{ g/L}$ sau 7 ngày (hiệu suất thu hồi sinh khối đạt $0,1115\text{ g/L/ngày}$), nhưng hoàn toàn không thu được màng BC do lực khuấy làm phân tán các vi sợi. Ngược lại, chế độ ủ tĩnh tạo điều kiện cho vi khuẩn tập trung cơ chất để dệt màng cellulose nổi trên bề mặt, thu được hàm lượng BC khô cao nhất đạt $14,8472\text{ g/L}$ sau 7 ngày, tương ứng với tốc độ suy giảm tổng hàm lượng đường nhanh nhất.
• Ảnh hưởng của nồng độ giống ban đầu: Nồng độ giống cao ($0,1\text{ g/L}$) thúc đẩy sinh khối lỏng tăng cực đại sau 3 ngày ($0,7241\text{ g/L}$, hiệu suất $0,1034\text{ g/L/ngày}$) nhưng không tạo màng BC do tế bào cạnh tranh oxy và dinh dưỡng. Mức cấy ban đầu $0,04\text{ g/L}$ tạo lượng BC cao nhất đạt $14,7855\text{ g/L}$ sau 7 ngày nuôi cấy tĩnh.
• Ảnh hưởng của pH môi trường: Môi trường pH 6 cho sinh khối lỏng cao nhất ($0,1286\text{ g/L}$ ở ngày thứ 5; hiệu suất $0,0183\text{ g/L/ngày}$); tuy nhiên, khả năng sinh tổng hợp BC đạt tối ưu ở pH 4 với khối lượng BC khô thu được lên tới $19,0717\text{ g/L}$ sau 7 ngày (cao gấp đôi so với môi trường pH 5 đạt $9,5954\text{ g/L}$).
• Cấu trúc màng sau acetyl hóa: Ảnh SEM cho thấy các vi sợi BC sau acetyl hóa có sự phân tách rõ nét do nhóm acetyl thay thế nhóm hydroxyl làm giảm liên kết hydro giữa các chuỗi. Phổ FTIR xác nhận sự xuất hiện của các dải hấp thụ đặc trưng cho liên kết acetyl: đỉnh $1367\text{ cm}^{-1}$ (uốn cong methyl $-\text{O(C=O)-CH}_3$), dải $1205 - 1105\text{ cm}^{-1}$ (kéo dãn $\text{C-O}$ acetyl), đỉnh 1425 và $1563\text{ cm}^{-1}$ (carboxylate), đỉnh $1030\text{ cm}^{-1}$ ($\text{C-O-C}$ ether) và sự suy giảm cường độ dải $3200 - 3600\text{ cm}^{-1}$ của nhóm $-\text{OH}$.
• Hiệu suất cố định và hoạt độ enzyme: Lượng protein dư trong dịch sau cố định trên BC acetyl hóa giảm xuống còn $66,252\text{ }\mu\text{g/mL}$ (so với $229,476\text{ }\mu\text{g/mL}$ ở mẫu BC chưa biến tính), tương ứng hiệu suất cố định đạt 82,1% (so với 38% ở BC nguyên bản). Hoạt độ của lipase cố định trên BC acetyl hóa đạt $7,3 \times 10^{-4}\text{ U}$, cao hơn so với lipase tự do ($7,6 \times 10^{-4}\text{ U}$) và lipase gắn trên BC nguyên bản ($8,2 \times 10^{-4}\text{ U}$).

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Chương 4 đúc kết các thông số kỹ thuật tối ưu để thu nhận màng BC từ G. xylinus (30°C, pH 4, giống ban đầu $0,04\text{ g/L}$, nuôi cấy ủ tĩnh 7 ngày) và khẳng định tính hiệu quả của phương pháp biến tính bề mặt màng bằng acetyl hóa xúc tác iodine để cố định lipase với hiệu suất đạt $82,1% - 82,5%$.

---

Kết quả và đóng góp của đề tài

Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm

Đề tài đã xác lập được hệ thống số liệu thực nghiệm định lượng về các điều kiện sinh tổng hợp màng BC và các chỉ số cố định enzyme lipase:

Thông số khảo sát	Điều kiện tối ưu	Kết quả sinh khối lỏng	Hàm lượng màng BC thu được
Chế độ khuấy	Ủ tĩnh ($30^\circ\text{C}$, 7 ngày)	Thấp, ổn định	$14,8472\text{ g/L}$ (khuấy từ đạt $0\text{ g/L}$)
Nồng độ giống cấy	$0,04\text{ g/L}$	Thấp, ổn định	$14,7855\text{ g/L}$ (mức $0,1\text{ g/L}$ đạt $0\text{ g/L}$)
Độ pH môi trường	$\text{pH} = 4,0$	$0,0802\text{ g/L}$ (ngày 7)	$19,0717\text{ g/L}$ (pH 5 đạt $9,5954\text{ g/L}$)

Bảng 1: Tổng hợp các điều kiện nuôi cấy tối ưu sinh tổng hợp màng BC từ G. xylinus

Mẫu khảo sát	Nồng độ protein còn dư ($\mu\text{g/mL}$)	Hiệu suất cố định (%)	Hoạt độ enzyme ($U$)
Lipase tự do ($5\text{ mg/mL}$)	$240,580$	—	$7,6 \times 10^{-4}$
Lipase cố định trên BC nguyên bản	$229,476$	$\approx 38,0%$	$8,2 \times 10^{-4}$
Lipase cố định trên BC acetyl hóa	$66,252$	$82,1%$ (kết luận ghi $82,5%$)	$7,3 \times 10^{-4}$

Bảng 2: Hàm lượng protein, hiệu suất cố định và hoạt độ của các chế phẩm enzyme lipase

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Ứng dụng quy trình nuôi cấy tĩnh trong môi trường nước dừa già bổ sung khoáng và sucrose ở pH 4 để thu hồi sinh khối màng cellulose vi khuẩn với năng suất cao và chi phí nguyên liệu thấp.
• Áp dụng phương pháp xử lý bề mặt BC bằng phản ứng acetyl hóa với acetic anhydride xúc tác iodine ($0,125\text{ mM}$) ở 80°C trong 60 phút để tạo chất mang kỵ nước cố định enzyme lipase.

Đóng góp so với các nghiên cứu trước

• Là nghiên cứu thực nghiệm khảo sát việc sử dụng màng cellulose vi khuẩn (G. xylinus) làm chất mang để cố định enzyme lipase tại Việt Nam.
• Phương pháp acetyl hóa màng BC nâng hiệu suất cố định lipase lên mức $82,1% - 82,5%$, vượt trội so với phương pháp cố định lipase trên hạt alginate/BC bằng cơ chế hấp phụ trước đây (chỉ đạt $25% - 47%$ theo Kim và cộng sự, 2017).
• Quy trình chế tạo màng BC acetyl hóa có chi phí thấp và điều kiện thực hiện đơn giản hơn so với việc cố định enzyme trên các chất mang tổng hợp đắt tiền như nhựa acrylic resin hay hạt nano từ tính $\text{Fe}_3\text{O}_4$.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Khóa luận chưa tiến hành khảo sát độ bền tái sử dụng (reusability) của enzyme lipase cố định trên màng BC qua nhiều chu kỳ phản ứng liên tiếp.
  • Chưa đánh giá tính ổn định nhiệt (thermal stability) và độ bền hoạt tính của chế phẩm lipase-BC trong các điều kiện bảo quản kéo dài hoặc trong các khoảng pH phản ứng khác nhau.
  • Khảo sát hoạt độ thủy phân mới dừng lại trên cơ chất chuẩn là dầu olive ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa thử nghiệm trên các nguồn cơ chất chất béo công nghiệp thực tế hoặc trong các phản ứng tổng hợp hữu cơ.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:
  • Nghiên cứu khả năng tái sử dụng nhiều lần của enzyme lipase cố định trên màng BC trong sản xuất công nghiệp để tối ưu hóa chi phí.
  • Mở rộng khảo sát hoạt tính xúc tác của phức hợp BC-lipase trong các phản ứng tổng hợp ester, transester hóa sản xuất diesel sinh học (biodiesel) hoặc este hương liệu trong môi trường dung môi hữu cơ.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng tham khảo:
  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên các ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học, Kỹ thuật Hóa học và Khoa học Vật liệu.
  • Các nhóm nghiên cứu về công nghệ enzyme, kỹ thuật cố định xúc tác sinh học và kỹ thuật lên men sản xuất vật liệu sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp.
• Nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Dữ liệu chi tiết về điều kiện sinh tổng hợp BC của G. xylinus trên nền nước dừa già (pH 4, nồng độ giống $0,04\text{ g/L}$, chế độ ủ tĩnh).
  • Quy trình thực nghiệm acetyl hóa màng BC sử dụng chất xúc tác iodine và phương pháp tẩy màu iodine dư bằng natri thiosunfat.
  • Giao thức định lượng protein vết bằng phương pháp Lowry và phương pháp chuẩn độ thể tích xác định hoạt độ lipase theo Soares (1999).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chế độ nuôi cấy khuấy từ cho tốc độ tăng sinh khối tế bào cao nhất nhưng lại không thu được màng cellulose vi khuẩn (BC)?

Ở chế độ khuấy từ, môi trường lỏng được đảo trộn liên tục và oxy được khuếch tán đồng đều giúp vi khuẩn G. xylinus sinh trưởng sinh khối nhanh (đạt $0,7807\text{ g/L}$ sau 7 ngày). Tuy nhiên, chuyển động quay với vận tốc cao làm phân tán hoàn toàn các sợi nano cellulose mới hình thành vào dung dịch, ngăn cản các sợi này kết mạng với nhau trên bề mặt tiếp xúc pha khí - lỏng để tạo thành tấm màng BC có kích thước và khối lượng định hình.

2. Mục đích chính của việc xử lý màng BC bằng phản ứng acetyl hóa trước khi cố định lipase là gì?

BC nguyên bản là vật liệu có tính ưa nước mạnh do mật độ nhóm hydroxyl (-OH) cao, trong khi enzyme lipase hoạt động tối ưu trong môi trường kỵ nước/ưa béo. Phản ứng acetyl hóa thay thế một phần các nhóm -OH bằng nhóm acetyl ($-\text{COCH}_3$), làm giảm tính ưa nước và tăng tính kỵ nước của bề mặt màng BC, giúp cấu trúc màng tương thích và giữ chặt enzyme lipase mà không làm mất hoạt tính của nó.

3. Những tín hiệu phổ FTIR nào chứng minh nhóm acetyl đã gắn thành công lên màng BC?

Phổ FTIR của màng BC sau xử lý xuất hiện đỉnh $1367\text{ cm}^{-1}$ đặc trưng cho dao động uốn cong của liên kết methyl trong nhóm $-\text{O(C=O)-CH}_3$, dải hấp thụ từ $1205\text{ cm}^{-1}$ đến $1105\text{ cm}^{-1}$ tương ứng với dao động kéo dãn liên kết $\text{C-O}$ của nhóm acetyl, cùng sự suy giảm cường độ vùng hấp thụ $3200 - 3600\text{ cm}^{-1}$ do các nhóm $-\text{OH}$ tự do bị thay thế.

4. Hiệu suất cố định enzyme lipase trên màng BC acetyl hóa đạt bao nhiêu và khác biệt như thế nào so với màng BC chưa xử lý?

Hiệu suất cố định lipase trên màng BC acetyl hóa đạt $82,1%$ (lượng protein enzyme còn dư trong dịch chỉ là $66,252\text{ }\mu\text{g/mL}$), cao hơn gấp 2,16 lần so với màng BC nguyên bản chưa xử lý chỉ đạt hiệu suất khoảng $38,0%$ (lượng protein dư là $229,476\text{ }\mu\text{g/mL}$).

5. Điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để thu nhận màng BC từ chủng G. xylinus trong nghiên cứu này là gì?

Điều kiện tối ưu được xác định gồm: môi trường MBC nền nước dừa già có độ $\text{pH} = 4,0$, nồng độ vi sinh vật cấy ban đầu là $0,04\text{ g/L}$, nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C theo phương pháp ủ tĩnh liên tục trong 7 ngày (168 giờ), cho năng suất màng BC khô đạt $19,0717\text{ g/L}$.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã xác định thành công các thông số kỹ thuật tối ưu để thu nhận màng cellulose vi khuẩn từ chủng Gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già ở điều kiện ủ tĩnh 7 ngày tại 30°C, pH = 4 và mật độ giống $0,04\text{ g/L}$, đạt năng suất màng khô $19,0717\text{ g/L}$. Việc biến tính bề mặt màng BC bằng phản ứng acetyl hóa xúc tác iodine đã chuyển đổi thành công bề mặt màng sang tính chất kỵ nước, nâng cao hiệu suất cố định enzyme lipase lên $82,1% - 82,5%$ so với mức $38%$ của màng BC nguyên bản. Chế phẩm lipase cố định trên màng BC acetyl hóa duy trì hoạt độ xúc tác thủy phân đạt $7,3 \times 10^{-4}\text{ U}$, khẳng định tiềm năng ứng dụng của màng polymer sinh học BC làm giá thể cố định enzyme kinh tế và hiệu quả trong công nghệ thực phẩm và sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn Cellulose là một hợp chất hữu cơ có công thức phân tử (C6H10O5)n. Cellulose là đơn vị cấu trúc cơ bản của thành tế bào ở gần như tất cả các loài thực vật, nhiều loại nấm và một số loại tảo (Jonas và cộng sự, 1998). Nghiên cứu đầu tiên về lĩnh vực sản xuất cellulose từ vi khuẩn là trên chủng Acetobacter xylinum (A.

xylinum) được Brown công bố vào năm 1886. Các nghiên cứu khác cho thấy cellulose còn có thể được sản xuất bởi các vi khuẩn khác nhau, bao gồm cả các loài vi khuẩn gram âm như Acetobacter, Azotobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas, Salmonella, Alcaligenes, vi khuẩn gram dương duy nhất sản xuất được cellulose là Sarcina ventriculi (Campano và cộng sự, 2016). Cellulose được sản xuất từ các vi khuẩn có nguồn gốc khác nhau sẽ có hình thái, cấu trúc, tính chất và ứng dụng khác nhau. Trong số các vi khuẩn có khả năng sản xuất cellulose thì Gluconacetobacter xylinus đang được sử dụng trong sản xuất cellulose thương mại do có năng xuất cao (Wang và cộng sự, 2019).

Cellulose thực vật (x200) Cellulose vi khuẩn (x20000) Hình 1. 1: Cellulose thực vật và cellulose vi khuẩn (Nguyễn, 2006) BC có độ tinh khiết cao (Jonas và cộng sự, 1998) do chúng không chứa lignin và các chất khác (Iguchi và cộng sự, 2000). Đường kính BC bằng 1/100 đường kính của PC (Yoshinaga và cộng sự, 1997) làm cho chúng có độ xốp cao hơn (Chawla và cộng sự, 2009). Ngoài ra, BC còn có độ bền kéo, khả năng giữ nước, tính ổn định đối với hóa chất và nhiệt độ cao hơn so với PC (Sun và cộng sự, 2010).

Tổng quan về Gluconacetobacter xylinus 1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus Gluconacetobacter xylinus (còn được biết đến với tên gọi là Acetobacter xylinum hoặc Acetobacter xylinus) là vi khuẩn hình que, Gram âm, hiếu khí bắt buộc thuộc họ Acetobacteraceae (Yamada và cộng sự, 1997; Kersters và cộng sự, 2006). xylinus chịu được môi trường có độ acid cao, tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết hành từng chuỗi. Vì vậy, điều kiện nuôi cấy thu nhận BC có nhiệt độ từ 25 – 30 oC và pH môi trường nuôi cấy từ 3 – 7 (Nguyễn, 2006).

Trong môi trường lỏng, G. xylinus phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành từng lớp màng mỏng trong suốt, có độ dày khác nhau. Trên môi trường rắn, khuẩn lạc của G. xylinus có hình dạng tròn đều, đường kính trung bình khoảng 1 – 3 mm (Nguyễn, 2006).

Quá trình sinh tổng hợp BC Quá trình sinh hóa tổng hợp cellulose của G. xylinus bao gồm bốn bước chính (Ullah và cộng sự, 2016): (a) glucose được phosphoryl hóa thành glucose – 6 – phosphate; (b) glucose – 6 – phosphate được đồng phân hóa thành glucose – 1 – phosphate; (c) glucose – 1 – phosphate được chuyển thành uridine diphosphate glucose (UDP – glucose); (d) chuỗi glucan được tổng hợp từ UDP – glucose 5 do an Hình 1. 3: Con đường sinh tổng hợp BC trong G. liên kết β 1- 4 glcosidic Hình 1.

4: Cấu tạo phân tử cellulose (Salgado, 2015). Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn 1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn trên thế giới Do có nhiều ưu điểm nên hiện tại BC được ứng dụng rất phổ biến trong các ngành công nghệ thực phẩm, y tế và các lĩnh vực kỹ thuật khác. a) Thực phẩm 6 do an BC có nhiều tiềm năng trong ngành công nghiệp thực phẩm do chúng có độ tinh khiết cao, cấu trúc của BC có thể thay đổi bằng cách thay đổi thành phần của môi trường nuôi cấy.

Chúng có thể được sử dụng như là chất nhũ hóa, chất làm dày trong các sản phẩm thịt bởi vì chúng ổn định trong các điều kiện pH khác nhau. Mặt khác chúng còn được sử dụng làm vật liệu bao gói nhờ khả năng hút nước và giữ nước của chúng (Cho và cộng sự, 2012). Cellulose vi khuẩn cũng đã được sử dụng như một chất làm đặc để duy trì độ nhớt trong thực phẩm và đóng vai trò như một chất ổn định. Do có kết cấu đặc biệt và hàm lượng chất xơ cao, nó đã được bổ sung vào nhiều sản phẩm thực phẩm.

Một ví dụ cụ thể là Cellulon, một chất làm phồng được sử dụng làm nguyên liệu thực phẩm để hoạt động như chất làm đặc, cải thiện kết cấu hoặc chất làm giảm năng lượng của thực phẩm (Okiyama và cộng sự, 1992). BC được sử dụng làm nguyên liệu thô để sản xuất nata de coco (thạch dừa), một món tráng miệng truyền thống của Philippines. Một số sắc tố tự nhiên (oxycarotenoids, anthocyanin) và các chất chống oxy hóa) đã được kết hợp với BC để làm cho món tráng miệng hấp dẫn hơn (Fontana và cộng sự, 2017). Ngoài ra, BC còn được nghiên cứu để cố định vi khuẩn acid lactic sử dụng trong quá trình lên men sữa (Jagannath và cộng sự, 2010).

Một số ứng dụng khác của BC trong thực phẩm được Faezah Esa tổng hợp theo bảng (1. 1: Ứng dụng của BC trong thực phẩm (Esa và cộng sự, 2014) Vật liệu Chức năng Sản phẩm BC/nisin Bao bì thức phẩm kháng khuẩn Thịt Bao bì thực phẩm phân huỷ BC/polylysine Xúc xích sinh học BC Chất nhũ hoá Surimi Carboxymethycellulose Điều chỉnh độ nhão bột nhào Bột mì Hydroxypropyl methyl cellulose Chất cải thiện cấu trúc Whipped cream Methyl cellulose Cải thiện thời hạn sử dụng Trứng Tăng cường tính khả dụng Methyl cellulose Vitamin C sinh học b) Y tế 7 do an Ngày nay, BC đã được ứng dụng vào trong lĩnh vực y tế vì chúng có khả năng giữ nước và có tính thấm hơi nước. Khả năng giữ nước cao sẽ cung cấp không khí ẩm tại vết thương và thuốc dạng lỏng có thể được hấp thụ bởi gạc phủ BC nhằm tăng hiệu quả điều trị (Meftahi và cộng sự, 2010). Chính vì vậy, một số sản phẩm từ BC như Bioprocess, Gengiflexn đã và đang được thương mại hóa để ứng dụng trong phẫu thuật, cấy ghép nha khoa.

Một sản phẩm thương mại từ BC khác là XCell được sản xuất bởi Tập đoàn Xylos, chủ yếu được sử dụng để điều trị vết thương do loét tĩnh mạch (Meftahi và cộng sự, 2010). Mặt khác BC còn được ứng dụng để phục hồi các mô nha chu bằng cách tách các tế bào biểu mô miệng và các mô liên kết khỏi bề mặt chân răng (Jonas và cộng sự, 1998). c) Sản phẩm khác BC còn được sử dụng trong ngành công nghiệp điện tử bao gồm sản xuất điốt phát quang hữu cơ (OLED) (Vandamme và cộng sự, 1998). Một nghiên cứu khác đã sử dụng BC để cố định vi khuẩn khử nitơ là Pseudomonas stutzeri ứng dụng trong xử lý nước thải (Rezaee và cộng sự, 2008).

Ngoài ra đã có các công trình nghiên cứu chứng minh rằng BC còn được ứng dụng khá hiệu quả làm vật liệu cố định cho một số loại enzyme, vi khuẩn hay nấm men như cố định enzyme glucoamylase lên BC dạng viên (Wu và cộng sự, 2008), cố định enzyme laccase lên BC biến đổi từ tính (Drozd và cộng sự, 2018), cố định enzyme lysozyme lên BC để khảo sát tính chất (Bayazidi và cộng sự, 2018), cố định tế bào nấm men lên màng BC (Yao và cộng sự, 2011). Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam Hiện nay, BC là đối tượng của nhiều nghiên cứu và ứng dụng của các nhà khoa học trong nước. Để đáp ứng nhu cầu phát triển các ứng dụng mới đòi hỏi sản xuất BC phải đạt quy mô công nghiệp với nhiều yêu cầu như: Đa dạng hoá nguồn nguyên liệu ban đầu, dễ khai thác, giá thành rẻ, và tính sẵn có của nguyên liệu. Ngoài ra các chủng giống mới sẽ phù hợp hơn với mục đích sản xuất bởi chủng sẽ tạo ra BC có độ bền chắc hơn, đặc biệt là các chủng mới có thể phát triển nhanh trong các loại môi trường khác nhau.

Sàng lọc các chủng giống thích hợp với điều kiện lên men cũng là một yếu tố không kém phần quan trọng. Nghiên cứu “Chọn lọc dòng Acetobacter Xylinum thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn” của tác giả Nguyễn Thúy Hương 8 do an và Phạm Thành Hổ (2003) nhằm sàng lọc và lựa chọn dòng A. xylinum phát triển tốt trên 2 loại môi trường mật rỉ đường và nước mía. Các kết quả thu được từ 2 loại môi trường này hứa hẹn sử dụng tốt trong sản xuất BC ở quy mô công nghiệp (Nguyễn, 2003).

Mặt khác cũng với mục đích nâng cao khả năng sản xuất BC trong quy mô công nghiệp, đề tài nghiên cứu “Ảnh hưởng của nguồn cơ chất và kiểu lên men đến năng suất và chất lượng cellulose vi khuẩn” của tác giả Nguyễn Thúy Hương (2008) khảo sát khả năng lên men tạo BC từ nhiều nguồn cơ chất khác nhau. Kết quả ở nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng mật rỉ đường, nước mía, dịch thải trái cây trong nuôi cấy … để tạo cellulose vi khuẩn. Tác giả cũng nhận thấy khả năng tạo BC của A. xylinum giảm dần sau mỗi đợt cấy chuyền.

BC thu được ở phương pháp nuôi cấy bề mặt sẽ có các ưu điểm như khả năng giữ nước, độ chịu lực cao hơn nhiều so với phương pháp nuôi cấy chìm (Nguyễn, 2008). Đối với lĩnh vực thực phẩm, tác giả Nguyễn Thúy Hương (2008) thực hiện nghiên cứu cố định vi khuẩn A. xylinum trên chất nền có giá đỡ là BC nhằm tạo chế phẩm ứng dụng trong lên men cellulose vi khuẩn (Nguyễn, 2008). Kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ chế phẩm giống là 2%, có thể tái sử dụng lên men thu nhận cellulose vi khuẩn 7 lần nhưng vẫn đảm bảo về mặt thời gian, sản lượng, chất lượng BC và hoàn toàn không có sự khác biệt so với chế phẩm dịch giống truyền thống (Nguyễn, 2003).

Ngoài ra, Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An (2007) còn thực hiện nghiên cứu việc cố định tế bào vi khuẩn Lactococcus lactic trên chất mang BC để ứng dụng lên men thu nhận bacteriocin và bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu. Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao, có thể tái sử dụng 9 – 10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, số lượng và chất lượng bacteriocin so với đối chứng. Thịt tươi có thể được bảo quản đến 3 ngày bằng màng BC hấp phụ dịch bacteriocin 200 AU/m vẫn đảm bảo chất lượng thịt, theo TCVN 7046:2002. Kết quả thu được cũng góp phần thăm dò 2 ứng dụng mới của BC đó là sử dụng BC làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật và sử dụng màng mỏng BC làm màng bao thực phẩm (Nguyễn, 2003).