Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Trong hệ thống y học dân gian Việt Nam và các quốc gia nhiệt đới, nguồn tài nguyên thực vật dược liệu đóng vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị nhiều bệnh lý. Chi Olax thuộc họ Dương đầu (Olacaceae) bao gồm khoảng 40 đến 200 loài phân bố chủ yếu tại các vùng nhiệt đới châu Á và châu Phi. Cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb., còn gọi là mao trật hay cát lộ) là loài thảo dược bản địa mọc phổ biến tại Việt Nam, đặc biệt phân bố nhiều ở khu vực tỉnh Phú Yên. Theo kinh nghiệm dân gian, loài thực vật này thường được ứng dụng trong các bài thuốc điều trị bệnh phụ khoa, sốt, thương hàn, chống viêm nhiễm, kháng khuẩn và bảo quản nông sản chống mọt gạo. Các nghiên cứu hiện đại trên thế giới và tại Việt Nam đã bước đầu chứng minh các chất chiết từ chi Olax sở hữu hoạt tính sinh học đa dạng như chống oxy hóa, kháng viêm, ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase hỗ trợ điều trị đái tháo đường týp 2, cũng như gây độc trên các dòng tế bào ung thư.
Nhằm làm sáng tỏ thành phần hóa học và cung cấp cơ sở khoa học cho các ứng dụng dược liệu, đề tài khóa luận tập trung nghiên cứu chuyên sâu về phân đoạn phân cực trung bình - cao điều chế từ rễ cây Dương đầu. Nhiệm vụ nghiên cứu được giao gồm 3 nội dung chính:
- Điều chế cao chiết phân đoạn Et40B từ rễ cây Dương đầu (Olax imbricata).
- Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn Et40B bằng các kỹ thuật sắc ký thích hợp.
- Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất tinh khiết được phân lập dựa trên các phương pháp phân tích phổ hiện đại.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Mẫu rễ cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb., họ Olacaceae) được thu hái tại huyện Đông Hòa, tỉnh Phú Yên vào tháng 8 năm 2020. Danh tính thực vật được định danh và xác nhận bởi chuyên gia Hoàng Xuân Lâm (Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Dược liệu Hữu cơ Miền Trung, tỉnh Phú Yên). Mẫu tiêu bản lưu trữ tại Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh với mã ký hiệu UTE-A002.
- Phạm vi không gian: Thực nghiệm chiết xuất, sắc ký phân lập và phân tích phổ được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Hóa học - Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh và Phòng Đo phổ Cộng hưởng từ hạt nhân - Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phạm vi thời gian: Đề tài được giao thực hiện từ ngày 17/09/2023 đến ngày 10/01/2024 và được nghiệm thu chính thức vào ngày 17/01/2024.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận thuộc loại hình nghiên cứu thực nghiệm hóa học (hóa học các hợp chất thiên nhiên / hóa thực vật). Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu dựa trên các nguyên lý chiết tách phân đoạn hợp chất tự nhiên, hóa học các hợp chất triterpenoid saponin dạng glycoside (dẫn xuất khung oleanane mang aglycone là oleanolic acid kết hợp các chuỗi đường oligosaccharide), cùng lý thuyết phân tích cấu trúc phân tử thông qua các phương pháp phổ nghiệm hiện đại.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Kỹ thuật chiết xuất và phân bố lỏng - lỏng: Phương pháp trích nóng hồi lưu với dung môi ethanol 96% để thu nhận cao thô, sau đó hòa tan phân bố lỏng - rắn chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexane và methanol (MeOH).
- Kỹ thuật sắc ký phân tách:
- Sắc ký cột hấp phụ Diaion HP-20: Dùng để phân tách sơ bộ cao MeOH thành 6 phân đoạn giải ly bằng hệ dung môi EtOH:$\text{H}_2\text{O}$ giảm dần độ phân cực (20%, 40%, 60%, 80%, 96%) và tráng cột bằng acetone 100%.
- Sắc ký cột silica gel pha thường (NP-CC): Sử dụng chất hấp phụ silica gel với các hệ dung môi $\text{CHCl}_3\text{--MeOH}$ và $\text{CHCl}_3\text{--MeOH--H}_2\text{O--Af}$ (acid formic) với tỷ lệ phân cực tăng dần để làm giàu phân đoạn Et40 thành Et40B.
- Sắc ký cột nhanh silica gel pha đảo (RP-18 CC): Tách thô 2,010 g phân đoạn Et40B qua 4 hệ dung môi giải ly ($\text{H}_2\text{O}$, dung dịch MeOH 20%, MeOH 50%, MeOH 100%).
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Theo dõi thành phần các phân đoạn, kiểm tra độ sạch của hợp chất, phát hiện vết chất bằng buồng soi tử ngoại (bước sóng 254 nm và 365 nm) và thuốc thử hiện màu vanilin/$\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% trong ethanol (hơ nóng).
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích: Khảo sát thành phần và độ tinh khiết của các phân đoạn trên hệ dung môi đẳng dòng acetonitrile (MeCN) 35% trong 30 phút.
- Sắc ký lỏng điều chế (Prep-HPLC): Thiết bị Buchi Pure Advance (Thụy Sĩ), sử dụng cột silica gel pha đảo C18-30, tốc độ dòng 7 mL/phút, áp suất 644 psi, hệ dung môi gradient gồm Kênh A (MeCN 35% chứa 0,1% acid formic) và Kênh B (MeCN 100%), đầu dò bước sóng 254 nm và 365 nm để tinh chế hợp chất mục tiêu.
- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR: Phổ proton ($^1\text{H-NMR}$, tần số 600 MHz) và phổ carbon-13 ($^{13}\text{C-NMR}$, tần số 125 MHz) đo trên máy AVANCE III HD (Bruker, Thụy Sĩ) trong dung môi $\text{CD}_3\text{OD}$ (MeOD).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều 2D-NMR: Phổ tương quan proton-proton qua liên kết ($\text{COSY}$), phổ tương quan dị hạt nhân qua một liên kết ($\text{HSQC}$) và phổ tương quan dị hạt nhân qua nhiều liên kết ($\text{HMBC}$).
- Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): Thực hiện trên máy X500R QTOF để xác định chính xác khối lượng ion phân tử giả $[\text{M}+\text{Na}]^+$ và công thức phân tử.
- Phần mềm hỗ trợ: Phần mềm ChemDraw được sử dụng để vẽ cấu trúc, mô phỏng và so sánh độ dịch chuyển hóa học ($\delta$, ppm) lý thuyết với số liệu thực nghiệm.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương này trình bày tổng quan về thực vật học, hoạt tính sinh học và thành phần hóa học đã được công bố của chi Olax và loài Olax imbricata.
-
Đặc điểm thực vật học chi Olax và loài Olax imbricata:
Họ Olacaceae trên thế giới có 25 chi và 250 loài; riêng tại Việt Nam có 4 chi và 10 loài. Cây Dương đầu (Olax imbricata) thuộc dạng cây bụi đứng cao từ 2–5 m, thân màu nâu, cành non màu xám. Lá hình trái xoan mọc so le hai dãy, mặt trên bóng láng, mặt dưới hơi vàng có lông. Hoa màu trắng có mùi thơm, chuyển vàng khi khô; cây ra hoa vào tháng 12–1 và kết quả vào tháng 8.
-
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Olax:
- Kháng viêm và kháng oxy hóa: Chiết xuất ethanol từ lá và vỏ thân Olax subscorpioidea có khả năng chống tổn thương gan do $\text{CCl}4$ gây ra trên chuột. Chiết xuất lá Olax psittacorum có tác dụng giảm đau, kháng viêm và ức chế TNF-$\alpha$ trên dòng tế bào RAW 264.7. Chiết xuất lá Olax scandens dùng tổng hợp hạt nano nanocomposite Ag-Cu có tính kháng khuẩn. Chiết xuất methanol của Olax nana thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, kháng cholinesterase với giá trị $\text{IC}{50}$ từ 71,46 đến 92,33 $\mu\text{g/mL}$ và ức chế $\alpha$-glucosidase với $\text{IC}_{50} = 639,89\ \mu\text{g/mL}$.
- Kiểm soát đái tháo đường, béo phì và lipid máu: Nghiên cứu của Võ Thị Ngà và cộng sự (2022) cho thấy dịch chiết n-hexane từ rễ cây Olax imbricata thu hái tại Phú Yên có tác dụng ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase in vitro mạnh hơn chất đối chứng acarbose 2,83 lần (giá trị $\text{IC}_{50}$ của dịch chiết rễ đạt $47,8 \pm 0,3\ \mu\text{g/mL}$ so với acarbose là $135,4 \pm 0,2\ \mu\text{g/mL}$), mở ra tiềm năng kiểm soát đường huyết và hỗ trợ điều trị đái tháo đường týp 2 trên chuột béo phì.
- Độc tính tế bào và chống ung thư: Nghiên cứu năm 2019 của nhóm tác giả chứng minh cả 3 loại cao chiết (n-hexane, ethyl acetate, methanol) từ rễ cây Olax imbricata đều có hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú MCF7 và ung thư phổi LU. Cao n-hexane và ethyl acetate còn có hoạt tính trên dòng tế bào ung thư gan HepG2.
- Tác động lên hệ thần kinh: Phân đoạn butanol của Olax subscorpioidea thể hiện tác dụng an thần và chống trầm cảm trong các thử nghiệm tiền lâm sàng.
-
Tổng quan về thành phần hóa học đã phân lập từ chi Olax:
- Hợp chất béo: Các acid béo chưa bão hòa mang liên kết ba như (E)-henicos-7-en-9-ynoic acid, 2,3-dihydroxypropyl (E)-henicos-7-en-9-ynoate, santalbic acid, exocarpic acid.
- Hợp chất terpenoid: Các hợp chất triterpene như rhoiptelenol, glutinol, oleanolic acid, và các dẫn xuất 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene glucoside.
- Hợp chất polyphenol và flavonoid: Hơn 17 dẫn xuất flavonoid glycoside khung kaempferol, quercetin, morin kết hợp với các gốc đường arabinofuranosyl, rhamnopyranoside, glucopyranosyl, xylopyranoside; cùng các dẫn xuất phenolic glycoside và leonuriside A.
- Hợp chất chứa nitrogen: Hợp chất acid amin không chuẩn S-ethenylcysteine và hợp chất amide béo (Z)-docos-13-enamide.
Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm
Chương 2 mô tả chi tiết nguồn nguyên liệu, trang thiết bị hóa chất và toàn bộ quy trình thực nghiệm điều chế mẫu từ rễ cây Olax imbricata.
| Giai đoạn điều chế |
Khối lượng ban đầu / Điều kiện xử lý |
Sản phẩm trung gian / Phân đoạn thu được |
Khối lượng thu được |
| Xử lý mẫu thực vật |
50 kg rễ tươi thu tại Đông Hòa, Phú Yên (8/2020) |
Bột rễ khô (sấy 60–70°C, xay mịn) |
7,0 kg |
| Chiết cao thô EtOH |
7,0 kg bột rễ chiết hồi lưu nhiệt với ethanol 96% |
Cao thô ethanol tổng (sau cô quay thu hồi dung môi) |
1,5 kg (1500 g) |
| Phân chia cao thành phần |
1,5 kg cao thô hòa tan lần lượt trong n-hexane và MeOH |
- Cao n-hexane
- Cao MeOH |
- 600 g
- 750 g |
| Sắc ký cột Diaion HP-20 |
600 g cao MeOH, giải ly hệ $\text{EtOH:H}_2\text{O}$ giảm dần phân cực |
- Phân đoạn Et20 (20% EtOH)
- Phân đoạn Et40 (40% EtOH)
- Phân đoạn Et60 (60% EtOH)
- Phân đoạn Et80 (80% EtOH)
- Phân đoạn Et96 (96% EtOH)
- Phân đoạn Ace (100% Acetone) |
- 54,30 g
- 65,33 g
- 84,06 g
- 35,53 g
- 45,47 g
- 1,69 g |
| Sắc ký cột pha thường 1 |
65,33 g phân đoạn Et40, hệ $\text{CHCl}_3\text{--MeOH}$ (60:40 $\rightarrow$ 0:100) |
3 phân đoạn phụ: Et40.1, Et40.2, Et40.3 |
Chọn phân đoạn Et40.2 |
| Sắc ký cột pha thường 2 |
Phân đoạn Et40.2, hệ $\text{CHCl}_3\text{--MeOH}$ (95:5 $\rightarrow$ 0:100) |
6 phân đoạn phụ: Et40.2.1 đến Et40.2.6 |
Chọn Et40.2.6 |
| Sắc ký cột pha thường 3 |
Phân đoạn Et40.2.6, hệ $\text{CHCl}_3\text{--MeOH--H}_2\text{O--Af}$ (9:3:0,5:0,1 $\rightarrow$ 6:3:0,5:0,1) |
12 phân đoạn nhỏ: Et40.2.6.1 đến Et40.2.6.12 |
Phân đoạn Et40.2.6.9 (Et40B): 4,209 g |
Từ phân đoạn Et40B (khối lượng 4,209 g), tác giả lấy 2,010 g đem tiến hành sắc ký cột nhanh silica gel pha đảo (RP-18) với 4 hệ dung môi giải ly phân cực giảm dần, thu được 4 phân đoạn:
- Phân đoạn Et40B-$\text{H}_2\text{O}$: 680 mg
- Phân đoạn Et40B-Me20: 377 mg
- Phân đoạn Et40B-Me50: 380 mg
- Phân đoạn Et40B-Me100: 84 mg
Chương 3: Kết quả và bàn luận
Chương 3 trình bày chi tiết quy trình tinh chế sắc ký điều chế và toàn bộ tiến trình phân tích dữ liệu phổ để giải mã cấu trúc phân tử của hợp chất cô lập được.
1. Quá trình phân lập hợp chất OI-PD9.1
Khi kiểm tra 4 phân đoạn thu được từ cột RP-18 bằng HPLC phân tích (pha động MeCN 35% trong 30 phút), cả 4 phân đoạn đều thể hiện sắc đồ tương tự nhau với sự xuất hiện của 3 peak chính tại thời gian lưu ($t_R$) lần lượt là 10 phút, 11 phút và 12 phút. Tác giả tiến hành gộp 4 phân đoạn và nạp vào hệ thống sắc ký lỏng điều chế Buchi Pure Advance.
- Thông số vận hành Prep-HPLC: Cột pha đảo C18-30; tốc độ dòng 7 mL/phút; áp suất 644 psi; bước sóng phát hiện $\lambda = 254\ \text{nm}$ và $365\ \text{nm}$. Chương trình dung môi kéo dài 60 phút: 40 phút đầu chạy đẳng dòng 100% Kênh A (MeCN 35% có 0,1% Af); 20 phút sau chạy gradient 50% Kênh A và 50% Kênh B (MeCN 100%).
- Sản phẩm thu nhận: Thu được 52 mg hợp chất ký hiệu OI-PD9.1 (tương ứng với peak ở thời gian lưu 10 phút). Hợp chất có dạng bột vô định hình màu hơi ánh vàng, tan hoàn toàn trong MeOH 100%, cho phản ứng hiện màu tím đặc trưng của saponin/triterpenoid trên bản mỏng TLC khi phun thuốc thử vanilin/$\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% và sấy nóng.
2. Biện luận cấu trúc hóa học của hợp chất OI-PD9.1
Cấu trúc của hợp chất OI-PD9.1 được xác lập thông qua phân tích kết hợp phổ 1D-NMR, 2D-NMR và HR-ESI-MS:
- Xác định khung Aglycone (Oleanolic acid):
- Phổ $^1\text{H-NMR}$ thể hiện 7 mũi đơn ($\text{singlet}$) cường độ 3H đặc trưng cho 7 nhóm methyl bậc ba trên khung triterpenoid oleanane: $\delta_\text{H}\ 1,12\ (\text{s, H-23})$, $1,34\ (\text{s, H-24})$, $0,82\ (\text{s, H-25})$, $1,07\ (\text{s, H-26})$, $1,29\ (\text{s, H-27})$, $0,94\ (\text{s, H-29})$, $1,01\ (\text{s, H-30})$.
- Một tín hiệu proton olefin ở trường thấp $\delta_\text{H}\ 5,27\ (\text{t, } J = 3,6\ \text{Hz, H-12})$, tương ứng trên phổ $^{13}\text{C-NMR}$ với hai carbon nối đôi tại $\delta_\text{C}\ 123,8\ (\text{C-12})$ và $\delta_\text{C}\ 144,8\ (\text{C-13})$.
- Tín hiệu carbon carbonyl của nhóm carboxylic acid tại $\delta_\text{C}\ 176,8\ (\text{C-28})$ (hoặc $\delta_\text{C}\ 178,1$ khi tạo liên kết ester với đường).
- Tín hiệu carbon mang oxy tại vị trí C-3 dịch chuyển xuống trường thấp $\delta_\text{C}\ 92,5$ (so với $\sim 78\ \text{ppm}$ ở dạng tự do), chứng tỏ C-3 đã bị ether hóa gắn chuỗi đường.
- Các tương quan trên phổ COSY, HSQC và HMBC hoàn toàn phù hợp với khung aglycone là oleanolic acid.
| Vị trí carbon |
$\delta_\text{C}$ (ppm) của Oleanolic acid chuẩn [12] |
$\delta_\text{H}$ (ppm) của Oleanolic acid chuẩn [12] |
$\delta_\text{C}$ (ppm) của OI-PD9.1 (MeOD) |
$\delta_\text{H}$ (ppm) của OI-PD9.1 (MeOD) |
| C-1 |
39,8 |
0,85 m; 1,64 m |
39,2 |
1,41 m |
| C-2 |
27,1 |
1,75 m; 1,89 m |
27,1 |
1,82 m; 2,22 m |
| C-22 |
34,0 |
1,34 m; 1,49 m |
33,2 |
1,75 m; 2,11 m |
| C-23 |
16,8 |
0,89 s |
17,3 |
1,12 s |
| C-24 |
28,3 |
1,09 s |
28,7 |
1,34 s |
| C-25 |
16,0 |
0,98 s |
16,0 |
0,82 s |
| C-26 |
17,8 |
0,82 s |
18,0 |
1,07 s |
| C-27 |
26,0 |
0,89 s |
26,5 |
1,29 s |
| C-28 |
178,1 |
- |
176,8 / 178,1 |
- |
| C-29 |
33,5 |
0,93 s |
33,7 |
0,94 s |
| C-30 |
24,0 |
0,95 s |
24,2 |
1,01 s |
- Xác định các đơn vị đường:
- Phổ $^1\text{H-NMR}$ và HSQC xuất hiện 5 tín hiệu proton anomer trong vùng $\delta_\text{H}\ 4,5\text{--}5,5\ \text{ppm}$ tương quan với 5 carbon anomer trong vùng $\delta_\text{C}\ 95\text{--}110\ \text{ppm}$, khẳng định hợp chất chứa 5 đơn vị đường:
- Đường $\alpha$-L-rhamnose (Rhm c): Proton anomer tại $\delta_\text{H}\ 5,17\ (\text{d, } J = 1,2\ \text{Hz, H-1-Rhm c})$ kết hợp tín hiệu nhóm methyl bậc hai đặc trưng tại $\delta_\text{H}\ 1,27\ (\text{d, } J = 6,0\ \text{Hz, H-6-Rhm c})$ và $\delta_\text{C}\ 17,9\ (\text{C-6-Rhm c})$.
- Đường $\beta$-D-glucuronic acid (GlcA b): Proton anomer $\delta_\text{H}\ 4,57\ (\text{d, } J = 7,8\ \text{Hz, H-1-GlcA b})$ tương quan với carbon anomer $\delta_\text{C}\ 105,6$ và carbon carboxyl tại $\delta_\text{C}\ 172,0\ (\text{C-6-GlcA b})$.
- 3 đơn vị đường $\beta$-D-glucose (Glc a, Glc d, Glc e): Thể hiện 3 proton anomer với hằng số ghép lớn dạng diaxial ($J = 7,8\text{--}8,4\ \text{Hz}$) tại $\delta_\text{H}\ 5,40\ (\text{d, } J = 8,4\ \text{Hz, H-1-Glc a})$, $\delta_\text{H}\ 4,75\ (\text{d, } J = 8,4\ \text{Hz, H-1-Glc d})$, và $\delta_\text{H}\ 4,98\ (\text{d, } J = 7,8\ \text{Hz, H-1-Glc e})$, cùng 3 tín hiệu nhóm methylene oxymethyl ($\text{C-6}$) trong vùng $\delta_\text{C}\ 62,5\text{--}63,7\ \text{ppm}$.
| Đơn vị đường |
Vị trí C-1 ($\delta_\text{C}$ / $\delta_\text{H}$) |
Vị trí C-2 ($\delta_\text{C}$ / $\delta_\text{H}$) |
Vị trí C-3 ($\delta_\text{C}$ / $\delta_\text{H}$) |
Vị trí C-4 ($\delta_\text{C}$ / $\delta_\text{H}$) |
Vị trí C-5 ($\delta_\text{C}$ / $\delta_\text{H}$) |
Vị trí C-6 ($\delta_\text{C}$ / $\delta_\text{H}$) |
| Glc a |
95,7 / 5,40 d (8,4) |
74,0 / 3,42 d (1,8) |
78,2 / 3,42 d (1,8) |
72,5 / 3,10 t (9,6) |
78,2 / 3,82 m |
63,7 / 3,59 d (4,2) |
| GlcA b |
105,6 / 4,57 d (7,8) |
86,3 / 3,83 d (3,0) |
74,0 / 3,33 m |
71,8 / 3,66 t (3,0) |
76,5 / 3,87 d (3,0) |
172,0 / - |
| Rhm c |
102,9 / 5,17 d (1,2) |
72,3 / 3,97 dd (3,6; 1,8) |
72,3 / 3,71 d (3,0) |
78,4 / 3,36 m |
78,7 / 3,36 m |
17,9 / 1,27 d (6,0) |
| Glc d |
104,0 / 4,75 d (8,4) |
75,9 / 3,39 m |
70,3 / 3,36 m (6,0) |
84,7 / 3,54 t (8,4) |
78,4 / 3,83 d (6,0) |
62,6 / 3,91 d (1,8) |
| Glc e |
103,3 / 4,98 d (7,8) |
76,1 / 3,17 t (1,2) |
71,2 / 3,37 d (6,0) |
78,4 / 3,37 d (6,0) |
70,1 / 3,95 d (6,0) |
62,5 / 3,83 d (3,0) |
- Xác định vị trí liên kết glycoside qua tương quan HMBC:
- Tương quan giữa proton $\text{H-1-Glc a}\ (\delta_\text{H}\ 5,40)$ với carbon $\text{C-28}\ (\delta_\text{C}\ 178,1)$ của aglycone chứng minh đơn vị đường glucose Glc a liên kết theo kiểu ester glycosyl hóa tại vị trí C-28.
- Tương quan giữa proton $\text{H-1-GlcA b}\ (\delta_\text{H}\ 4,57)$ với carbon $\text{C-3}\ (\delta_\text{C}\ 92,5)$ của aglycone xác nhận đơn vị acid glucuronic gắn trực tiếp vào C-3 của aglycone.
- Tương quan giữa proton $\text{H-1-Glc d}\ (\delta_\text{H}\ 4,75)$ với carbon $\text{C-2-GlcA b}\ (\delta_\text{C}\ 86,3)$ chứng minh Glc d gắn vào C-2 của GlcA b.
- Tương quan giữa proton $\text{H-1-Rhm c}\ (\delta_\text{H}\ 5,17)$ với carbon $\text{C-4-Glc d}\ (\delta_\text{C}\ 84,7)$ chỉ ra đường rhamnose gắn vào C-4 của Glc d.
- Tương quan giữa proton $\text{H-1-Glc e}\ (\delta_\text{H}\ 4,98)$ với carbon $\text{C-4-Rhm c}\ (\delta_\text{C}\ 78,4)$ chứng minh đường glucose Glc e gắn vào C-4 của Rhm c.
- Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS: Cho mũi ion phân tử giả $[\text{M}+\text{Na}]^+$ tại $m/z = 1287,7498$ (hoặc $1287,7492$), phù hợp với giá trị tính toán lý thuyết cho $[\text{C}{60}\text{H}{96}\text{O}{28}\text{Na}]^+$ là $1287,5980$. Qua đó xác định công thức phân tử của hợp chất OI-PD9.1 là $\text{C}{60}\text{H}{96}\text{O}{28}$ (khối lượng phân tử $M = 1264\ \text{g/mol}$).
Kết quả và đóng góp
Kết quả nghiên cứu chính
- Đã triển khai thành công quy trình chiết tách và làm giàu phân đoạn từ 7 kg bột rễ khô cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb.), thu được 1,5 kg cao thô EtOH, 750 g cao MeOH và 65,33 g cao phân đoạn Et40 qua cột Diaion HP-20.
- Từ 2,010 g cao phân đoạn Et40B, qua quá trình sắc ký nhanh pha đảo RP-18 và sắc ký điều chế Prep-HPLC pha đảo (hệ MeCN--$\text{H}_2\text{O}$ chứa 0,1% acid formic), đã phân lập được 52 mg hợp chất tinh khiết OI-PD9.1.
- Xác định đầy đủ cấu trúc hóa học của hợp chất OI-PD9.1 là một bidesmosidic triterpenoid saponin có công thức phân tử $\text{C}{60}\text{H}{96}\text{O}_{28}$, cấu tạo gồm phần khung aglycone là oleanolic acid mang 5 đơn vị đường: một gốc $\beta$-D-glucopyranosyl gắn tại C-28 theo liên kết ester, và một chuỗi tetrasaccharide gồm $\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$4)-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$4)-$\beta$-D-glucopyranosyl-(1$\rightarrow$2)-$\beta$-D-glucuronopyranosyl gắn tại vị trí C-3 của aglycone.
Đóng góp khoa học
- Đề tài đóng góp dữ liệu thực nghiệm mới về thành phần hóa học phân cực của rễ cây Dương đầu (Olax imbricata) thu hái tại tỉnh Phú Yên, bổ sung một dẫn xuất saponin triterpenoid pentacyclic có cấu trúc chuỗi 5 đường phức tạp vào cơ sở dữ liệu hóa thực vật học của chi Olax tại Việt Nam.
- Thiết lập quy trình sắc ký kết hợp hiệu quả giữa cột hấp phụ thể tích lớn (Diaion HP-20, silica gel pha thường) và sắc ký lỏng điều chế pha đảo C18, cho phép tách chiết tinh sạch các hợp chất saponin đa đường có độ phân cực cao từ nguồn dược liệu tự nhiên.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế
- Do giới hạn về mặt thời gian thực hiện khóa luận, tác giả mới chỉ phân lập và giải mã trọn vẹn cấu trúc của 01 hợp chất chính (OI-PD9.1 ở peak $t_R = 10$ phút), chưa kịp phân lập và định danh 2 hợp chất còn lại xuất hiện trên sắc phổ HPLC (ở thời gian lưu $t_R = 11$ phút và 12 phút).
- Vị trí liên kết lập thể chi tiết của các đơn vị đường trên chuỗi mạch phân nhánh phức tạp (Glc d, Glc e, Rhm c) cần thêm các dữ liệu phổ nghiệm khẳng định bổ sung.
Hướng nghiên cứu tiếp
- Tiếp tục triển khai sắc ký điều chế trên phân đoạn Et40B để cô lập và làm tinh khiết 2 hợp chất chưa phân lập ở thời gian lưu 11 phút và 12 phút.
- Tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro, trọng tâm là đánh giá khả năng ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase của hợp chất tinh khiết OI-PD9.1 nhằm làm sáng tỏ tiềm năng hạ đường huyết và hỗ trợ điều trị đái tháo đường.
Giá trị tham khảo
- Đối tượng sử dụng: Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Hóa hữu cơ, Hóa dược, Dược học và Hóa học các hợp chất tự nhiên.
- Nội dung tham khảo giá trị:
- Quy trình phân đoạn liên hoàn sử dụng chất hấp phụ đa cơ chế (nhựa macroporous Diaion HP-20 kết hợp silica gel pha thường và pha đảo RP-18).
- Phương pháp thiết lập thông số vận hành sắc ký lỏng điều chế Buchi Pure Advance cho các hợp chất saponin phân cực.
- Toàn bộ phương pháp luận quy gán tín hiệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, HSQC, HMBC, COSY) để xác định cấu trúc aglycone triterpenoid khung oleanane và giải mã trật tự chuỗi oligosaccharide phức tạp.
Câu hỏi thường gặp
1. Nguồn gốc mẫu thực vật rễ cây Dương đầu được thu thập ở đâu và được định danh như thế nào?
Mẫu rễ cây Dương đầu được thu hái tại huyện Đông Hòa, tỉnh Phú Yên vào tháng 8 năm 2020. Danh tính khoa học được xác nhận là Olax imbricata Roxb. thuộc họ Olacaceae bởi chuyên gia Hoàng Xuân Lâm (Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất Dược liệu Hữu cơ Miền Trung, Phú Yên). Mẫu tiêu bản thực vật được ký hiệu UTE-A002 và lưu giữ tại Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
2. Phân đoạn Et40B được điều chế qua các bước phân tách nào từ cao thô ban đầu?
Từ 7 kg bột rễ khô điều chế được 1,5 kg cao thô EtOH, sau đó hòa tan chọn lọc thu được 750 g cao MeOH. Tiếp tục lấy 600 g cao MeOH sắc ký qua cột Diaion HP-20 (hệ $\text{EtOH:H}_2\text{O}$) thu được 65,33 g phân đoạn Et40 (40% EtOH). Phân đoạn Et40 tiếp tục qua cột silica gel pha thường lần 1 thu phân đoạn Et40.2; phân đoạn Et40.2 qua cột silica gel lần 2 thu phân đoạn Et40.2.6; phân đoạn Et40.2.6 qua cột silica gel lần 3 (hệ $\text{CHCl}_3\text{--MeOH--H}_2\text{O--Af}$) thu được phân đoạn Et40.2.6.9 (chính là Et40B) với khối lượng 4,209 g.
3. Điều kiện chạy sắc ký điều chế để phân lập hợp chất OI-PD9.1 được thiết lập ra sao?
Quá trình phân lập 52 mg hợp chất OI-PD9.1 được thực hiện trên máy Buchi Pure Advance sử dụng cột silica gel pha đảo C18-30, tốc độ dòng 7 mL/phút, áp suất 644 psi, đầu dò tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm. Hệ dung môi giải ly trong 60 phút gồm Kênh A (MeCN 35% chứa 0,1% acid formic) và Kênh B (MeCN 100%), trong đó 40 phút đầu giải ly đẳng dòng 100% Kênh A và 20 phút sau chạy tỷ lệ 50% Kênh A : 50% Kênh B.
4. Cấu trúc hóa học của hợp chất OI-PD9.1 gồm những thành phần nào và liên kết với nhau ở vị trí nào?
Hợp chất OI-PD9.1 là một triterpenoid saponin mang khung aglycone là oleanolic acid kết hợp với 5 đơn vị đường. Trong đó, một đơn vị glucose (Glc a) liên kết ester vào carboxyl C-28 của aglycone; một đơn vị acid glucuronic (GlcA b) gắn vào C-3 của aglycone. Tiếp theo, đơn vị glucose thứ hai (Glc d) gắn vào C-2 của GlcA b; đơn vị rhamnose (Rhm c) gắn vào C-4 của Glc d; và đơn vị glucose thứ ba (Glc e) gắn vào C-4 của Rhm c.
5. Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS xác định công thức phân tử của hợp chất OI-PD9.1 như thế nào?
Phổ HR-ESI-MS của hợp chất OI-PD9.1 xuất hiện mũi ion phân tử giả $[\text{M}+\text{Na}]^+$ tại $m/z = 1287,7498$ (hoặc $1287,7492$), hoàn toàn phù hợp với khối lượng tính toán lý thuyết cho $[\text{C}{60}\text{H}{96}\text{O}{28}\text{Na}]^+$ là $1287,5980$. Qua đó xác định chính xác công thức phân tử của hợp chất là $\text{C}{60}\text{H}{96}\text{O}{28}$ với khối lượng phân tử tương ứng là $1264\ \text{g/mol}$.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp đã thực hiện thành công quy trình phân lập hóa thực vật từ phân đoạn Et40B điều chế từ rễ cây Dương đầu (Olax imbricata Roxb., họ Olacaceae) thu hái tại tỉnh Phú Yên. Bằng việc kết hợp sắc ký cột nhanh pha đảo RP-18 và sắc ký lỏng điều chế Buchi Pure Advance, tác giả đã tinh chế được 52 mg hợp chất tinh khiết ký hiệu OI-PD9.1. Dựa trên phân tích toàn diện dữ liệu phổ HR-ESI-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, COSY, HSQC, HMBC), công trình đã xác lập cấu trúc hóa học của OI-PD9.1 là dẫn xuất triterpenoid saponin mang khung aglycone oleanolic acid liên kết với 5 đơn vị đường ($\text{C}{60}\text{H}{96}\text{O}_{28}$). Kết quả nghiên cứu cung cấp dẫn liệu khoa học mới cho nguồn tài nguyên dược liệu chi Olax, đồng thời tạo tiền đề cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học ức chế $\alpha$-glucosidase tiếp theo.
