Tổng quan luận án
Công trình thuộc chuyên ngành Hóa hữu cơ (mã số 62.14), được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên và Phòng Tổng hợp hữu cơ thuộc Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, bảo vệ tại Học viện Khoa học và Công nghệ vào năm 2018.
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Bệnh ung thư hiện là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) được trích dẫn trong văn bản, mỗi năm thế giới ghi nhận thêm 14,1 triệu ca mắc mới và 8,2 triệu trường hợp tử vong do ung thư. Việc tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên thực vật tự nhiên để định hướng phát triển thuốc phòng ngừa và điều trị ung thư là hướng tiếp cận quan trọng của ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên.
Việt Nam sở hữu hệ thực vật đa dạng với khoảng 12.000 loài, trong đó có gần 3.900 loài thuộc 309 họ đã được ghi nhận sử dụng làm thuốc trong y học dân gian. Tuy nhiên, dữ liệu về thành phần hóa học cũng như mối liên hệ giữa cấu trúc hóa học và tác dụng dược lý của phần lớn các loài vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ.
Luận án tập trung giải quyết khoảng trống nghiên cứu đối với ba loài thực vật tại Việt Nam:
- Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep., họ Bồ hòn - Sapindaceae): Loài thực vật đặc hữu chỉ phân bố tại Vịnh Hạ Long, chưa từng có công bố khoa học nào về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.
- Cày ri ta Hạ Long (Chirita halongensis Kiew & T. Nguyen, họ Rau tai voi - Gesneriaceae): Loài thực vật đặc hữu của khu vực Cát Bà và Vịnh Hạ Long, hoàn toàn chưa có công trình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính.
- An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. Don) Kuntze, họ Cà phê - Rubiaceae]: Cây thuốc dân gian mọc ở vùng đồi cát ven biển từ Thừa Thiên Huế vào Nam, trước thời điểm nghiên cứu chỉ có một báo cáo sơ bộ về thành phần anthraquinone mà chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về hoạt tính sinh học.
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát của luận án là nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của ba loài thực vật trên nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, tạo cơ sở khoa học cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.
Nội dung nghiên cứu của luận án được đánh số gồm 3 phần chính:
- Phân lập các hợp chất từ ba loài Allophylus livescens, Chirita halongensis và Oldenlandia pinifolia ở Việt Nam bằng phương pháp sắc ký cột.
- Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ MS, 1D-NMR, 2D-NMR.
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết và các hợp chất phân lập được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Ba loài thực vật gồm Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.), Cày ri ta Hạ Long (Chirita halongensis Kiew & T. Nguyen) và An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. Don) Kuntze].
- Phạm vi không gian: Mẫu thực vật A. livescens và C. halongensis được thu hái tại khu vực đảo đá Vịnh Hạ Long (tỉnh Quảng Ninh) và Cát Bà (thành phố Hải Phòng); mẫu O. pinifolia được thu hái tại vùng đồi cát ven biển tỉnh Thừa Thiên Huế.
- Phạm vi nội dung và thời gian: Phân lập các nhóm hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật sắc ký; xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp quang phổ hiện đại; đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư người và khảo sát cơ chế cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư máu K562 và OCI-AML (hoàn thành năm 2018).
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Văn bản luận án đã tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế đối với ba chi thực vật chứa các loài nghiên cứu cùng lớp chất iridoid:
Chi Allophylus (họ Sapindaceae)
Chi Allophylus có khoảng 255 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; tại Việt Nam đã ghi nhận 26 loài. Y học cổ truyền sử dụng các loài thuộc chi này để điều trị kiết lỵ, gãy xương, phong thấp, viêm thận, viêm gan, vảy nến. Các nghiên cứu hóa học trước đây trên các loài A. serratus, A. edulis, A. laevigatus, A. longipes, A. caudatus, A. africanus, A. dregenus đã phân lập được các nhóm chất:
- Hợp chất flavonoid: Phân lập được 18 dẫn xuất flavonol và flavone (chủ yếu là C-glycosylflavone) như luteolin-7-O-β-D-glucoside, apigenin-4'-O-β-D-glucoside, vitexin 2"-O-rhamnoside, isovitexin, vicenin-2, orientin 2"-O-rhamnoside, saponarin. Một số hợp chất có khả năng ức chế enzyme chuyển hóa angiotensin (ACE) hoặc bảo vệ tế bào gan trong thử nghiệm gây độc bởi CCl4 và galactosamine.
- Hợp chất phenol khác: Bergenin, gallic acid, 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde, 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid, methyl asterrate.
- Terpenoid và steroid: β-sitosterol, lupeol, cycloart-24-en-3,26-diol, betulinic acid, ursolic acid, stigmastane-3β,4β-diol.
- Các hợp chất khác: Phenacetamide, cyanipid type III, các dẫn xuất eudesmane.
Đối với loài Allophylus livescens Gagnep., chưa có bất kỳ công trình khoa học nào công bố về thành phần hóa học hay tác dụng sinh học.
Chi Chirita (họ Gesneriaceae)
Chi Chirita gồm hơn 182 loài (trong đó có khoảng 100 loài đặc hữu của Trung Quốc); Việt Nam có 21 loài. Y học dân gian dùng một số loài làm thuốc chữa lao, cao huyết áp, cầm máu, kháng viêm gan, viêm ruột (C. fimbrisepala), điều trị rắn cắn (C. hamosa). Các nghiên cứu hóa thực vật trước đây trên thế giới mới chỉ khảo sát trên 6 loài (C. eburnea, C. fimbrisepala, C. hamosa, C. drakei, C. calignosa...):
- Hợp chất phenylethanoid: Gồm 17 hợp chất dạng monoglycoside và diglycoside như plantainoside A, B, D, calceolarioside A, B, chiritoside A, B, C, chiridrakoside A, B (trong đó chiridrakoside B có khả năng hấp thụ tia cực tím).
- Hợp chất quinone: Phân lập được 20 dẫn xuất anthraquinone và naphthoquinone như 1,7-dihydroxy-2-hydroxymethylanthraquinone, (R)-7-hydroxy-α-dunnione, (R)-7,8-dihydroxy-α-dunnione, chiritalone A, B, digiferruginol. Các dẫn xuất dunnione thể hiện hoạt tính khử gốc tự do.
- Flavonoid và triterpenoid: Phân lập được kaempferol, hispidulin, mahuangchiside, ursolic acid, cycloart-23-ene-3β,25-diol, 3α,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid. Hợp chất epoxyconiferyl alcohol phân lập từ C. drakei ức chế các dòng tế bào ung thư KB, HepG2, LU-1, MCF-7 với giá trị IC50 trong khoảng 46–128 µM.
Tại Việt Nam, trước thời điểm luận án, chỉ có duy nhất loài Chirita drakei Burtt được nghiên cứu; loài Chirita halongensis chưa có dữ liệu công bố.
Chi Oldenlandia (họ Rubiaceae)
Chi Oldenlandia có khoảng 276 loài, tại Việt Nam có 58 loài. Loài được nghiên cứu nhiều nhất là Oldenlandia diffusa (Bách hoa xà thiệt thảo), được sử dụng trong y học cổ truyền để thanh nhiệt, giải độc, tiêu ung tán kết, điều trị u bướu và viêm gan. Hơn 20 loài đã được nghiên cứu trên thế giới, phân lập được các nhóm chất:
- Hợp chất alkaloid: Khung bis-indole, β-carboline như chrysotricine (ức chế 63% dòng tế bào ung thư máu HL-60 ở nồng độ 10 µM), 10(S)-hydroxy pheophytin a.
- Hợp chất anthraquinone: 33 hợp chất anthraquinone 9,10 và 1,4 như 2-hydroxy-3-methyl-9,10-AQ, 1-methoxy-2-hydroxy-9,10-AQ (ức chế tyrosine kinase v-src và pp60src, ức chế tế bào ung thư phổi SPC-1-A, vú Bcap-37, gan HepG2), anthragallol 1,2-dimethyl ether (tiêu diệt tế bào ung thư vú MCF-7 qua con đường Ca2+/calpain/caspase-4).
- Hợp chất flavonoid: 23 hợp chất nhóm flavonol glycoside chứa nhóm thế feruloyl hoặc sinapoyl, có khả năng chống oxy hóa khử gốc DPPH và bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não chuột chống tổn thương do L-glutamate.
- Hợp chất iridoid: 51 dẫn xuất phân lập từ 6 loài, tiêu biểu như asperuloside (ức chế dòng tế bào ung thư vú YMB-1 và ung thư máu HL-60 với IC50 lần lượt là 0,7 và 11,0 µg/mL), asperulosidic acid (ức chế dòng ung thư đại tràng HT-29 với IC50 đạt 6,1 µg/mL), scandoside methyl ester, galioside, hedycoryside A.
Đối với loài Oldenlandia pinifolia, tài liệu trong nước chỉ có công trình của nhóm tác giả Lê Hoàng Duy công bố năm 2014 phân lập một số hợp chất anthraquinone (như 1,6-dihydroxy-7-methoxy-2-methyl-9,10-AQ; 1,6-dihydroxy-2-methyl-9,10-AQ; 3,6-dihydroxy-2-methyl-9,10-AQ; 1,3,6-trihydroxy-2-methyl-9,10-AQ; 1-methoxy-2-hydroxy-9,10-AQ), chưa có nghiên cứu về hoạt tính sinh học.
Tổng quan về lớp chất iridoid
Iridoid là các monoterpenoid có khung cấu trúc cis-2-oxabicyclo[4.3.0]nonane (khung cyclopentan-pyran), thường có hệ vòng đôi H-5/H-9β, β-cis. Iridoid được phân loại thành 4 nhóm:
- Iridoid glycoside: Hầu hết gắn đường glucose tại vị trí C-1 (như asperulosidic acid, scandoside methyl ester).
- Iridoid aglycone: Dạng không gắn đường (như genipin, mussaenin).
- Secoiridoid: Dạng mở vòng cyclopentan (như demethylalangiside, sweroside).
- Bis-iridoid: Phân tử gồm hai đơn vị iridoid liên kết với nhau (như globuloside A, pterocenoid A).
Vị trí của luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của A. livescens và C. halongensis, đồng thời mở rộng nghiên cứu cấu trúc và lần đầu tiên đánh giá hoạt tính sinh học cùng cơ chế apoptosis của các hợp chất từ O. pinifolia.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung phân tích và cơ sở lý thuyết
Nghiên cứu được thiết kế theo quy trình chuẩn của hóa học các hợp chất thiên nhiên kết hợp sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro:
- Chiết xuất phân đoạn nhằm phân tách sơ bộ các nhóm chất theo độ phân cực.
- Tinh chế hợp chất sạch bằng hệ thống sắc ký cột pha thường và pha đảo.
- Giải mã cấu trúc lập thể và cấu trúc phẳng của các phân tử hữu cơ bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ.
- Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ung thư và cơ chế phân tử liên quan đến quá trình chết theo chương trình (apoptosis).
Phương pháp phân tách và làm sạch mẫu
- Xử lý và chiết mẫu: Mẫu thực vật khô, xay nhỏ được chiết ngấm kiệt hoặc đun hồi lưu với dung môi hữu cơ (methanol/ethanol). Dịch chiết gộp được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ thấp để thu cao tổng.
- Chiết phân bố lỏng - lỏng: Cao tổng được phân tán vào nước và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, dichloromethane (CH2Cl2) hoặc chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), và n-butanol (n-BuOH).
- Kỹ thuật sắc ký:
- Sắc ký cột pha thường (Normal Phase Column Chromatography - NP-CC) sử dụng chất nhồi silica gel (cỡ hạt 0,040–0,063 mm và 0,063–0,200 mm).
- Sắc ký cột pha đảo (Reversed Phase Column Chromatography - RP-CC) sử dụng chất nhồi silica gel pha đảo RP-18.
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích và điều chế trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 và RP-18 F254, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm hoặc phun dung dịch thuốc thử H2SO4 10% rồi sấy nóng.
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết được xác định bằng tổ hợp các phương pháp quang phổ:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker AVANCE 500 MHz (tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR), sử dụng các dung môi deuterat hóa như CDCl3, CD3OD, DMSO-d6.
- Các kỹ thuật phổ 1D và 2D-NMR: Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT (DEPT-90, DEPT-135 để phân biệt carbon bậc một, bậc hai, bậc ba và bậc bốn); phổ tương tác đồng nhân 1H-1H COSY; phổ tương tác dị nhân qua một liên kết HSQC; phổ tương tác dị nhân tầm xa qua 2–3 liên kết HMBC.
- Phổ khối lượng (MS): Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử ESI-MS (chế độ ion dương và ion âm) và phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS để xác định chính xác khối lượng phân tử và công thức phân tử.
Phương pháp thử hoạt tính sinh học
- Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro: Xác định giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào) đối với các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy:
- KB (ung thư biểu mô biểu bì ở người)
- HepG2 (ung thư tế bào gan ở người)
- Lu (ung thư phổi ở người)
- MCF-7 (ung thư biểu mô tuyến vú ở người)
- HL-60 (ung thư máu dòng tiền tủy bào ở người)
- OCI-AML (bạch cầu cấp dòng tủy)
- K562 (ung thư máu mạn tính dòng tủy)
- Phương pháp thử nghiệm cảm ứng apoptosis:
- Đo tỉ lệ tế bào sống và tỷ lệ tế bào đi vào quá trình apoptosis sau các mốc thời gian nuôi cấy (24 giờ, 72 giờ).
- Phân tích chu kỳ tế bào qua các pha G0/G1, S, G2/M bằng đo dòng tế bào (Flow Cytometry).
- Nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm nhân huỳnh quang Hoechst 33342 để quan sát sự phân mảnh và biến đổi hình thái nhân tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang.
- Đo hoạt tính enzyme caspase-3 nhằm xác định con đường tín hiệu dẫn truyền apoptosis.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 1 trình bày chi tiết về vị trí phân loại thực vật, phân bố địa lý, đặc điểm hình thái, công dụng y học cổ truyền, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học đã được công bố của 3 chi: Allophylus, Chirita, và Oldenlandia, đồng thời tổng quan chuyên sâu về nhóm hợp chất iridoid.
Chương này thống kê danh mục 26 loài thuộc chi Allophylus, 21 loài thuộc chi Chirita và 58 loài thuộc chi Oldenlandia tại Việt Nam. Về mặt hóa thực vật, tác giả lập bảng tổng hợp cấu trúc của các hợp chất flavonoid, phenol, steroid, terpenoid, alkaloid, anthraquinone, phenylethanoid và iridoid đã được các nhà khoa học trên thế giới phân lập từ các loài cùng chi. Từ đó, chương 1 khẳng định tính cấp thiết của việc nghiên cứu 3 loài thực vật cụ thể của Việt Nam chưa được nghiên cứu hoặc chưa có dữ liệu hoạt tính sinh học.
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết thông tin mẫu thực vật nghiên cứu, nguồn gốc thu hái, giám định tên khoa học, cùng sơ đồ chiết tách và toàn bộ trang thiết bị, hóa chất, quy trình thực nghiệm.
Chương này trình bày các sơ đồ phân đoạn tổng thể từ dịch chiết thô đến các phân đoạn dịch chiết dung môi hữu cơ; mô tả nguyên lý và thông số vận hành của các phương pháp phân tích sắc ký (silica gel, RP-18), các kỹ thuật phổ nghiệm (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, ESI-MS, HR-ESI-MS) và các quy trình sinh học tế bào (đánh giá tỷ lệ sống sót của tế bào ung thư, định lượng apoptosis, nhuộm nhân Hoechst 33342, phân tích chu kỳ tế bào G0/G1, S, G2/M và định lượng caspase-3).
Chương 3: Thực nghiệm
Chương 3 ghi nhận đầy đủ các bước thực nghiệm chiết xuất, phân tách sắc ký và bảng số liệu phổ của tất cả 26 hợp chất tinh khiết phân lập được từ ba loài cây:
-
Từ cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens): Phân lập được 5 hợp chất (ký hiệu AL1 đến AL5):
- AL1: 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (hợp chất diterpenoid)
- AL2: catechin (hợp chất polyphenol)
- AL3: stigmasterol (hợp chất steroid)
- AL4: β-sitosterol (hợp chất steroid)
- AL5: β-sitosterol glucoside (hợp chất steroid glycoside)
-
Từ cây Cày ri ta Hạ Long (Chirita halongensis): Phân lập được 8 hợp chất (ký hiệu CH1 đến CH9):
- CH1: 7-hydroxytectoquinone (hợp chất anthraquinone)
- CH2: 3α,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (hợp chất triterpenoid)
- CH3: ursolic acid (hợp chất triterpenoid)
- CH4: oleanolic acid (hợp chất triterpenoid)
- CH6: acteoside (hợp chất phenylethanoid glycoside)
- CH7: isoacteoside (hợp chất phenylethanoid glycoside)
- CH8: decaffeoylacteoside (hợp chất phenylethanoid glycoside)
- CH9: β-hydroxyacteoside (hợp chất phenylethanoid glycoside)
-
Từ cây An điền lá thông (Oldenlandia pinifolia): Phân lập được 14 hợp chất (ký hiệu HP1 đến HP14):
- HP1: 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (hợp chất anthraquinone)
- HP2: 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone (hợp chất anthraquinone)
- HP3: 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (hợp chất anthraquinone)
- HP4: digiferruginol (hợp chất anthraquinone)
- HP5: lutein (hợp chất carotenoid)
- HP6: ursolic acid (hợp chất triterpenoid)
- HP7: oleanolic acid (hợp chất triterpenoid)
- HP8: asperuloside (hợp chất iridoid glycoside)
- HP9: deacetyl asperuloside (hợp chất iridoid glycoside)
- HP10: asperulosidic acid (hợp chất iridoid glycoside)
- HP11: scandoside methyl ester (hợp chất iridoid glycoside)
- HP12: afzelin (hợp chất flavonoid glycoside)
- HP13: isorhamnetin-3-O-β-rutinoside (hợp chất flavonoid glycoside)
- HP14: rutin (hợp chất flavonoid glycoside)
Chương 3 cũng mô tả chi tiết các bước tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học đối với cao chiết và các hợp chất đơn lập.
Chương 4: Kết quả và thảo luận
Chương 4 là chương nội dung chính của luận án, tập trung vào hai phần: biện luận xác định cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học.
Biện luận cấu trúc hóa học 26 hợp chất
Tác giả sử dụng các dữ liệu dịch chuyển hóa học ($\delta_H$, $\delta_C$), độ bội phổ, hằng số tương tác spin-spin ($J$), cũng như các tương tác qua không gian và liên kết trên phổ COSY, HSQC, HMBC để xác lập cấu trúc cho từng chất:
- Hợp chất diterpenoid AL1 (1,6,10,14-phytatetraen-3-ol) được biện luận dựa trên phổ 1H- và 13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) kết hợp tương tác HMBC.
- Các dẫn xuất phenylethanoid glycoside (CH6–CH9) từ C. halongensis được phân tích qua phổ 1H- và 13C-NMR trong CD3OD, xác định rõ các vị trí gắn liên kết caffeoyl, hydroxyl và các hợp phần đường glucose/rhamnose.
- Các dẫn xuất anthraquinone (HP1–HP4) và iridoid glycoside (HP8–HP11) từ O. pinifolia được xác định cấu trúc dựa trên phổ 1D-NMR, DEPT, HMBC và phổ phân giải cao HR-ESI-MS. Hợp chất HP1 được làm sáng tỏ cấu trúc 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone qua phân tích phổ 1H-, 13C-NMR trong cả hai dung môi (CDCl3 + CD3OD) và DMSO-d6. Hợp chất HP5 được đối chiếu dữ liệu phổ với lutein chuẩn.
| STT | Loài thực vật | Ký hiệu chất | Tên hợp chất | Lớp chất |
|---|---|---|---|---|
| 1 | A. livescens | AL1 | 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol | Diterpenoid |
| 2 | A. livescens | AL2 | Catechin | Polyphenol |
| 3 | A. livescens | AL3 | Stigmasterol | Steroid |
| 4 | A. livescens | AL4 | β-sitosterol | Steroid |
| 5 | A. livescens | AL5 | β-sitosterol glucoside | Steroid glycoside |
| 6 | C. halongensis | CH1 | 7-hydroxytectoquinone | Anthraquinone |
| 7 | C. halongensis | CH2 | 3α,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid | Triterpenoid |
| 8 | C. halongensis | CH3 | Ursolic acid | Triterpenoid |
| 9 | C. halongensis | CH4 | Oleanolic acid | Triterpenoid |
| 10 | C. halongensis | CH6 | Acteoside | Phenylethanoid glycoside |
| 11 | C. halongensis | CH7 | Isoacteoside | Phenylethanoid glycoside |
| 12 | C. halongensis | CH8 | Decaffeoylacteoside | Phenylethanoid glycoside |
| 13 | C. halongensis | CH9 | β-hydroxyacteoside | Phenylethanoid glycoside |
| 14 | O. pinifolia | HP1 | 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone | Anthraquinone |
| 15 | O. pinifolia | HP2 | 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone | Anthraquinone |
| 16 | O. pinifolia | HP3 | 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone | Anthraquinone |
| 17 | O. pinifolia | HP4 | Digiferruginol | Anthraquinone |
| 18 | O. pinifolia | HP5 | Lutein | Carotenoid |
| 19 | O. pinifolia | HP6 | Ursolic acid | Triterpenoid |
| 20 | O. pinifolia | HP7 | Oleanolic acid | Triterpenoid |
| 21 | O. pinifolia | HP8 | Asperuloside | Iridoid glycoside |
| 22 | O. pinifolia | HP9 | Deacetyl asperuloside | Iridoid glycoside |
| 23 | O. pinifolia | HP10 | Asperulosidic acid | Iridoid glycoside |
| 24 | O. pinifolia | HP11 | Scandoside methyl ester | Iridoid glycoside |
| 25 | O. pinifolia | HP12 | Afzelin | Flavonoid glycoside |
| 26 | O. pinifolia | HP13 | Isorhamnetin-3-O-β-rutinoside | Flavonoid glycoside |
| 27 | O. pinifolia | HP14 | Rutin | Flavonoid glycoside |
Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học và cơ chế gây độc tế bào
- Hoạt tính của hợp chất AL1 từ cây Ngoại mộc tái: Hợp chất diterpenoid AL1 được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với các dòng tế bào ung thư.
- Khảo sát hoạt tính của phân đoạn và hợp chất từ cây An điền lá thông (O. pinifolia):
- Thử nghiệm trên dòng tế bào bạch cầu OCI-AML: Cao chiết phân đoạn n-butanol được thử nghiệm ở 5 dải nồng độ (300; 150; 75; 37,5; 18,75 µg/mL). Kết quả sau 24 giờ nuôi cấy cho thấy tỷ lệ tế bào sống sót giảm phụ thuộc vào nồng độ, đồng thời tỷ lệ tế bào xảy ra hiện tượng chết theo chương trình (apoptosis) tăng lên rõ rệt so với đối chứng dung môi EtOH/H2O.
- Thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư máu K562: Cao chiết phân đoạn n-butanol và 4 hợp chất phân lập gồm HP9 (deacetyl asperuloside), HP11 (scandoside methyl ester), HP13 (isorhamnetin-3-O-β-rutinoside) và HP14 (rutin) ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào K562 trong thời gian theo dõi 72 giờ.
- Cơ chế cảm ứng apoptosis trên tế bào K562 sau 24 giờ:
- Nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342: Quan sát thấy nhân tế bào K562 bị biến đổi hình thái đặc trưng của apoptosis (co cụm chất nhiễm sắc, phân mảnh nhân) dưới tác động của cao chiết n-butanol và các chất HP9, HP11, HP13, HP14.
- Kích hoạt Caspase-3: Đo hoạt tính enzyme caspase-3 sau 24 giờ xử lý cho thấy cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 kích hoạt làm tăng hoạt tính enzyme caspase-3, chứng minh quá trình apoptosis diễn ra qua con đường phụ thuộc caspase.
- Phân tích chu kỳ tế bào: Cao chiết n-butanol và các hợp chất gây thay đổi phân bố tế bào ở các pha G0/G1, pha S và pha G2/M của chu kỳ tế bào ung thư máu K562.
Kết quả và những đóng góp mới
Những đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận
-
Về hóa thực vật:
- Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa học của hai loài thực vật đặc hữu của Việt Nam gồm Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.) và Cày ri ta Hạ Long (Chirita halongensis Kiew & T. Nguyen).
- Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 26 hợp chất tinh khiết thuộc nhiều khung cấu trúc khác nhau (diterpenoid, triterpenoid, steroid, anthraquinone, phenylethanoid glycoside, iridoid glycoside, flavonoid glycoside, carotenoid).
- Bổ sung bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR và khối phổ phân giải cao cho các hợp chất của ba loài thực vật thuộc các chi Allophylus, Chirita và Oldenlandia.
-
Về hoạt tính sinh học và dược lý:
- Lần đầu tiên công bố dữ liệu thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) phân lập từ loài Allophylus livescens.
- Lần đầu tiên công bố kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và cơ chế cảm ứng apoptosis của dịch chiết phân đoạn n-butanol cùng 4 hợp chất (HP9, HP11, HP13, HP14) phân lập từ cây An điền lá thông (Oldenlandia pinifolia) trên các dòng tế bào ung thư máu (OCI-AML và K562).
- Chứng minh cơ chế gây độc tế bào của các hợp chất từ O. pinifolia thông qua con đường kích hoạt caspase-3, phân mảnh nhân và làm biến đổi chu kỳ tế bào ở các pha G0/G1, S, G2/M.
Kiến nghị và đề xuất
- Cần tiếp tục nghiên cứu phân lập sâu hơn các phân đoạn chiết còn lại của ba loài thực vật trên để tìm kiếm thêm các hợp chất thứ cấp mới.
- Đề xuất mở rộng thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các mô hình in vitro khác và thử nghiệm in vivo đối với các hợp chất iridoid glycoside và flavonoid glycoside có hoạt tính tiềm năng.
- Cần có biện pháp bảo tồn nguồn gen đối với hai loài thực vật đặc hữu quý hiếm của Vịnh Hạ Long (Allophylus livescens và Chirita halongensis).
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của luận án
- Đối tượng nghiên cứu giới hạn ở các mẫu thực vật thu hái tại một số địa điểm đại diện (Vịnh Hạ Long, Cát Bà, Thừa Thiên Huế), chưa khảo sát biến động thành phần hóa học theo mùa hoặc theo các vùng sinh thái khác nhau.
- Thử nghiệm hoạt tính sinh học mới dừng lại ở quy mô in vitro trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy, chưa tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật sống (in vivo).
- Hoạt tính cảm ứng apoptosis mới chỉ tập trung làm rõ trên dòng tế bào ung thư máu K562 và OCI-AML đối với phân đoạn n-butanol và một số hợp chất iridoid, flavonoid từ cây An điền lá thông; chưa tiến hành khảo sát cơ chế sâu cho toàn bộ 26 hợp chất phân lập được.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Tiếp tục khảo sát hóa thực vật trên các phân đoạn có độ phân cực khác (như phân đoạn dichloromethane, ethyl acetate) của ba loài nghiên cứu.
- Tiến hành bán tổng hợp hoặc biến đổi hóa học trên các khung cấu trúc iridoid glycoside và phenylethanoid glycoside thu được để tối ưu hóa hoạt tính sinh học.
- Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và thử nghiệm tác dụng dược lý in vivo trên động vật thực nghiệm đối với các hợp chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị trong các lĩnh vực:
- Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược và Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Cung cấp tài liệu tra cứu về quy trình phân lập sắc ký (silica gel, RP-18) và bộ dữ liệu phổ nghiệm chi tiết (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, ESI-MS, HR-ESI-MS) của các nhóm hợp chất iridoid glycoside, phenylethanoid glycoside, anthraquinone, triterpenoid và flavonoid glycoside.
- Các nhà nghiên cứu Dược lý và Sinh học thực nghiệm: Cung cấp quy trình thử nghiệm độc tính tế bào in vitro, phương pháp đánh giá apoptosis qua nhuộm Hoechst 33342, định lượng hoạt tính caspase-3 và kỹ thuật phân tích chu kỳ tế bào bằng Flow Cytometry.
- Các nhà thực vật học và bảo tồn đa dạng sinh học: Cung cấp dẫn liệu hóa phân loại (chemotaxonomy) và giá trị sinh học thực tế của hai loài thực vật đặc hữu Vịnh Hạ Long (Allophylus livescens và Chirita halongensis), phục vụ công tác quy hoạch và bảo tồn nguồn gen thực vật quý hiếm tại Việt Nam.
Câu hỏi thường gặp
1. Luận án nghiên cứu những loài thực vật nào và chúng phân bố ở đâu?
Luận án nghiên cứu 3 loài thực vật của Việt Nam:
- Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep., họ Sapindaceae): Loài cây bụi nhỏ đặc hữu của Vịnh Hạ Long, tỉnh Quảng Ninh.
- Cày ri ta Hạ Long (Chirita halongensis Kiew & T. Nguyen, họ Gesneriaceae): Loài thân thảo sống trên vách đá đặc hữu của khu vực Cát Bà và Vịnh Hạ Long.
- An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. Don) Kuntze, họ Rubiaceae]: Cây thảo nhỏ mọc ở các đồi cát ven biển, mẫu nghiên cứu được thu hái tại Thừa Thiên Huế.
2. Có bao nhiêu hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ ba loài này?
Tổng cộng có 26 hợp chất tinh khiết được phân lập và xác định cấu trúc:
- 5 hợp chất từ cây Ngoại mộc tái (A. livescens): 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1), catechin (AL2), stigmasterol (AL3), β-sitosterol (AL4), β-sitosterol glucoside (AL5).
- 8 hợp chất từ cây Cày ri ta Hạ Long (C. halongensis): 7-hydroxytectoquinone (CH1), 3α,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (CH2), ursolic acid (CH3), oleanolic acid (CH4), acteoside (CH6), isoacteoside (CH7), decaffeoylacteoside (CH8), β-hydroxyacteoside (CH9).
- 14 hợp chất từ cây An điền lá thông (O. pinifolia): 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (HP1), 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone (HP2), 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3), digiferruginol (HP4), lutein (HP5), ursolic acid (HP6), oleanolic acid (HP7), asperuloside (HP8), deacetyl asperuloside (HP9), asperulosidic acid (HP10), scandoside methyl ester (HP11), afzelin (HP12), isorhamnetin-3-O-β-rutinoside (HP13), rutin (HP14).
3. Những phương pháp quang phổ nào được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học?
Cấu trúc hóa học của 26 hợp chất được xác định bằng:
- Phổ khối lượng: Phổ khối ion hóa phun mù điện tử ESI-MS và phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ 1D-NMR (1H-NMR tần số 500 MHz, 13C-NMR tần số 125 MHz, DEPT-90, DEPT-135) và phổ 2D-NMR (1H-1H COSY, HSQC, HMBC).
4. Cao chiết và các hợp chất từ cây An điền lá thông (Oldenlandia pinifolia) thể hiện hoạt tính sinh học gì và qua cơ chế nào?
Phân đoạn n-butanol và các hợp chất deacetyl asperuloside (HP9), scandoside methyl ester (HP11), isorhamnetin-3-O-β-rutinoside (HP13), rutin (HP14) từ O. pinifolia thể hiện hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư máu K562 và OCI-AML. Quá trình gây chết tế bào được chứng minh diễn ra theo cơ chế cảm ứng apoptosis phụ thuộc enzyme caspase-3, đi kèm hiện tượng phân mảnh nhân tế bào (nhuộm Hoechst 33342) và gây biến đổi chu kỳ tế bào ở các pha G0/G1, S, G2/M.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Khiếu Thị Tâm đã hoàn thành việc khảo sát hóa thực vật và hoạt tính sinh học trên ba loài thực vật của Việt Nam gồm Allophylus livescens, Chirita halongensis và Oldenlandia pinifolia. Bằng các phương pháp sắc ký và quang phổ hiện đại (1D/2D-NMR, MS, HR-ESI-MS), công trình đã phân lập và xác định cấu trúc của 26 hợp chất hữu cơ thuộc nhiều nhóm chất đa dạng. Kết quả thử nghiệm sinh học đã làm sáng tỏ hoạt tính gây độc tế bào và cơ chế cảm ứng apoptosis qua enzyme caspase-3 của dịch chiết phân đoạn cùng các hợp chất iridoid và flavonoid từ loài Oldenlandia pinifolia trên dòng tế bào ung thư máu K562 và OCI-AML. Đây là công trình cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học về thành phần hóa học và tác dụng sinh học cho các loài thực vật đặc hữu và dược liệu của Việt Nam.