CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu 1. Giới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh Thuật ngữ nội sinh “endophytic” lần đầu tiên được định nghĩa bởi de Bary năm 1866, “VSV nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật và có sự khác biệt đáng kể so với những loại VSV được tìm thấy trên bề mặt thực vật” (de Bary, 1866). Khái niệm khác về XKNS được đưa ra khi Smith (1957) phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp.
có khả năng ức chế nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh. Tuy nhiên, định nghĩa được các nhà VSV học thừa nhận rộng rãi nhất của Bacon và White (2000) “VSV nội sinh là VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra những hiệu ứng xấu tới cây chủ”; VSV nội sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, chống côn trùng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất. (Staniek và cs., 2008; Nalini và Prakash, 2017). Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ XKNS được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng nấm, ức chế phát triển tế bào ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng.
(Bacon và White, 2000; Qin và cs., 2011; Kaishing và cs. Nấm, vi khuẩn và XKNS đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học như alkaloid, steroid, terpenoid, peptide, polyketone, flavonoid, quinol, phenol và thuốc trừ sâu tự nhiên azadirachtin cũng được sản xuất bởi VSV nội sinh hiện đang được ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y dược (Li và cs., 2008; Molina và cs., 2012; Golinska và cs., 2015; Ganapathy và Natesan, 2018; Singh và Dubey, 2018). Vi khuẩn: hơn 200 chi từ 16 ngành vi khuẩn đã được công bố là nội sinh trong thực vật, phần lớn các loài thuộc ngành Actinobacteria, Proteobacteria và 5 Firmicutes (Golinska và cs. Vi khuẩn nội sinh thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương và Gram âm: Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Brevibacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Enterobacter, Gluconobacter… (Sun và cs.
Saini và cs. Vi khuẩn nội sinh đa dạng trong tự nhiên và có khả năng sinh các chất chuyển hóa sinh học khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn và chống tế bào ung thư. Xạ khuẩn: Trong những năm gần đây, XKNS thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học, nhiều báo cáo khoa học về XKNS trên nhiều loại thực vật khác nhau đã được công bố như các loại từ cây lương thực như lúa mì, ngũ cốc, gạo, cà chua, cà rốt và khoai tây, cam quýt (Araújo và cs., 2000; Coombs và Franco, 2003) đến các cây dược liệu (Taechowisan và cs., 2003; Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017). XKNS phân lập được chủ yếu thuộc chi Streptomyces, Microbispora, Micromonospora, Nocardioides, Nocardia và Streptosporangium.
XKNS được chứng minh mang lại nhiều lợi ích như cải thiện hoặc thúc đẩy quá trình tăng trưởng thực vật, làm giảm các triệu chứng bệnh thực vật thông qua một loạt các cơ chế như sinh tổng hợp các hoạt chất thứ cấp có khả năng tiêu diệt các loại mầm bệnh do nấm hay côn trùng gây ra (Igarashi và cs. Nhiều chất kháng sinh mới được tìm thấy do xạ khuẩn Streptomyces spp. sinh tổng hợp như alnumycin, munumbicin A, D hay coronamycin (Castillo và cs., 2007; Nalini và Prakash, 2017). Ngoài ra, nhiều công trình nghiên cứu về việc tìm kiếm XKNS mới đã được công bố (Qin và cs., 2011; Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017).
Vì vậy, XKNS được kỳ vọng như một nguồn cung cấp tiềm năng trong việc phát hiện ra các hợp chất có hoạt tính sinh học mới. Nấm nội sinh: trong 10 năm qua, các nhà khoa học đã công bố khoảng 770 loại nấm nội sinh đã được phân lập. Các loài đã được định tên nhiều nhất là: Altenaria spp.; Altenaria infectoria; Aspergillus spp. gloeosporioides; Guignardia spp.
sphaerica; Penicillium 6 spp. Gần đây, Daisy và cs. (2002) đã phân lập được hai chủng nấm nội sinh mới là chủng Muscodor albus từ cây quế (Cinnamomun zeylanicum) và Muscodor roseus từ hai cây trong rừng nhiệt đối tại Úc. Hai chủng nấm sản sinh một số hợp chất trao đổi thứ cấp hoạt tính ức chế, tiêu diệt nấm và vi khuẩn hại cây.
Tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và thực vật Nhiều nhà khoa học đã đưa ra các hình ảnh mô tả sự xâm nhập của các xạ khuẩn trong thực vật, tuy nhiên phương thức xâm nhập và cơ chế nội sinh của VSV nội sinh vẫn là một ẩn số (Sardi và cs. Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S. galbus MBR-5 trên lá đỗ quyên sau 60 ngày quan sát (Nguồn: Clark và Mattews, 1987) Ghi chú: (a) quá trình xâm nhập vào lỗ khí. Khuẩn ty được gắn trên vật liệu electron (G: tế bào bảo vệ).
Suzuki và cs. (2005) đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá và thân cây đỗ quyên của chủng S. galbus MBR-5 bằng cách quan sát qua kính hiển vi điện tử, cho hệ khuẩn ty của chủng S. galbus MBR-5 vào lá thông qua các lỗ khí nhưng không thông qua lớp biểu bì, vì lớp biểu bì còn nguyên vẹn (Hình 1.
Ngoài ra, chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân như xylanase, cellulase và pectinase. VSV nội sinh đã tự thích nghi trong suốt thời gian dài cùng với sự đồng tiến hóa của cây chủ qua gen điều hòa (Qin và cs. Một giả thuyết được đưa ra rằng gen mã hóa cho các chất có hoạt tính sinh học được sinh ra từ quá trình trao đổi giữa VSV và thực vật thông qua chuyển gen ngang (HGT - horizontal gene transfer). VSV nội sinh sản sinh ra một số hợp chất để duy 7 trì mối quan hệ cộng sinh với cây chủ, thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ (Golinska và cs.
Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong công nghệ sinh học và y dược Trong thời gian gần đây, XKNS liên quan đến thực vật, đặc biệt là cây dược liệu đã được chứng minh là tạo ra các hợp chất có giá trị trị liệu cao (Singh và Dubey, 2018). Các nghiên cứu về XKNS đã xác định được nhiều sản phẩm tự nhiên mới, đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học như: 9-hydroxybafilomycin D, 29- hydroxybafilomycin D, bafilomycin D, bafilomycin E, bafilomycin A1, bafilomycin B1, bafilomycin B2, bafilomycin C1, bafilomycin C2, bafilomycin C1 amide, bafilomycin C2 amide; caryolane-1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene- 1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8-(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, tripstretine… (Qin và cs., 2011; Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017). • Các chất kháng ung thư và chống viêm từ xạ khuẩn nội sinh Hoạt chất paclitaxel từ Kitasatospora sp. được phân lập từ cây thanh tùng Ý (Taxus baccata) (Caruso và cs., 2000; Janso và Carter, 2010) là báo cáo đầu tiên về sản xuất taxol từ XKNS có hoạt tính kháng tế bào ung thư.
Trong số các hợp chất có hoạt tính chống ung thư, nhiều hợp chất có chứa khung cấu trúc hóa học đặc biệt, chưa từng phát hiện từ các nguồn tự nhiên khác naphthomycin K (dẫn xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) được phân lập đầu tiên từ chủng Streptomyces sp. CS nội sinh trên cây mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) – loại cây thuốc có tác dụng điều trị hung thư, hoạt huyết…. Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc với hai dòng tế bào ung thư: ung thư bạch cầu (P388) và ung thư phổi (A549) ở người với giá trị IC50 thấp là 0,07 và 3,17 μM, nhưng không có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và vi khuẩn lao (Lu và Shen, 2007). Năm hợp chất macrolide 16 thuộc họ bafilomycin cũng được phân lập từ XKNS và cho thấy hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư vú ở người (MDA-MB-435) bằng in vitro (Li và cs.
Hai hợp chất anthraquinone mới là lupinacidin A và B được chiết từ dịch lên men của chủng xạ 8 khuẩn Micromonospora lupine. Lupinacidin có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư biểu mô ruột kết ở người 26-L5 (Igarashi và cs. Kim và cs. (2006) đã phân lập được hoạt chất 2 6-alkylsalicylic acid mới là salaceyin A và B từ chủng S.
laceyi MS53 nội sinh trên cây thầu dầu. Các kết quả khảo sát hoạt tính chống ung thư cho thấy, salaceyin A và B thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú ở người (SK-BR-3) với IC50 thấp lần lượt là 3,0 và 5,5 μg/ml. Mặt khác, pterocidin được phân lập từ chủng S. hygroscopicus TP-A0451, cho thấy hoạt tính gây độc với một số dòng tế bào ung thư ở người với giá trị IC50 trong khoảng 2,9- 7,1 µM (Igarashi và cs.
Trước đây, hai hợp chất 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin và 5, 7-dimetoxy-4- p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh, thường thu nhận từ nhiều loài thực vật khác nhau. Nhưng gần đây, Chủng S. aureofciens CMUAcl30 phân lập từ cây gừng (Zingiber officinale Rose) có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất kháng nấm và chống ung thư như 4-arylcoumarin (5, 7- dimethoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin và 5, 7-dimethoxy-4-phenylcoumarin). Hơn nữa, hoạt chất 4-acrylocoumarin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi Lewis (LLC) ở chuột BDF-1, bằng cách tiêm hoạt chất này vào ổ bụng của chuột.
Giá trị ức chế sự tăng trưởng của khối u (T/C treatment-to-control) của 5, 7 dimhoxy1-4-p methoxylphenylcoumarin là 80,8 và 50,0% ở liều 1 và 10 mg/kg, trong đó 5, 7-dimethoxy-4-phenylcoumarin là 81,6 và 44,9% ở liều 1 và 10 mg/kg. Hai hợp chất chống ung thư này có độc tính thấp trong đường ruột ở chuột và chỉ gây độc với các dòng tế bào ác tính và không gây độc tế bào thường (Taechowisan và cs. • Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm Ngày nay, nhiều loại thuốc kháng sinh mới được tổng hợp từ XKNS trên cây dược liệu có khả năng kháng khuẩn, nấm và virus. Năm 2005, Guan và cs đã phân lập được ba nhóm hoạt chất mới có khả năng kháng khuẩn là p-aminoacetophenic của 7-(4-aminophenyl)-2,4-dimethyl-7-oxo-hept-5-enoic acid, (9-(4-aminophenyl)- 9 7-hydroxy-2,4,6-trimethyl-9-oxo-non-2-enoic acid và 12-(4-aminophenyl)-10- hydroxy-6-(1-hydroxyethyl)-7,9-dimethyl-12-oxo-dodeca-2,4 dienoic acid từ chủng S., nội sinh trên cây ngập mặn (Kandelia candel) (Guan và cs.
Taechowisan và cs. (2005) đã công bố một số chất có hoạt tính kháng khuẩn từ chủng S. aureofaciens CMUAc130 nội sinh trên cây gừng (Zinger officinale) như 5,7-dimethoxy-4-(p-methoxy)-phenylcoumarin, 5,7-dimethoxy-4- phenylcoumarin, vanillin, 3-methoxy-4-hydroxytoluene và các chất kháng sinh kaempferol, isoscutellarin, umbelliferone và cichorii từ chủng Streptomyces sp. Tc052 nội sinh trên cây giềng nếp (Alpinia galangal).
Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu Năm 1886, chi xạ khuẩn Frankia đã được phân lập từ nốt sần của một cây không thuộc họ đậu (Okazaki, 2003). Tiếp đó, Baker và cs.