Khóa luận tốt nghiệp Y tế: Hoàng phương thảo mã sinh viên 1401559 tổng hợp

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ 2019 về tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của dẫn chất N-hydroxypropenamid ức chế histone deacetylase

• Tác giả: Hoàng Phương Thảo
• Người hướng dẫn: PGS. Phan Thị Phương Dung
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất N-hydroxypropenamid mới hướng ức chế Histone Deacetylase
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Khóa luận của Hoàng Phương Thảo

Khóa luận tốt nghiệp của Hoàng Phương Thảo (mã sinh viên 1401559) được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2019, dưới sự hướng dẫn của PGS. Phan Thị Phương Dung và NCS. Đỗ Thị Mai Dung. Đề tài nghiên cứu tập trung vào tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất N-hydroxypropenamid mới. Công trình này là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực ức chế Histone Deacetylase (HDAC), một target dược học tiềm năng trong điều trị ung thư. Khóa luận thể hiện sự kết hợp giữa hóa học dược phẩm và các phương pháp sinh học hiện đại, đóng góp vào việc phát triển các chất ức chế HDAC hiệu quả hơn.

1.1. Nội dung chính của đề tài nghiên cứu

Khóa luận của Hoàng Phương Thảo tập trung vào tổng hợp hóa học các dẫn chất N-hydroxypropenamid mới có khả năng ức chế HDAC. Các hợp chất này được thiết kế để tương tác với khu vực nhận diện bề mặt (SRG) và khu vực kết thúc gắn kẽm (ZBG) của enzyme HDAC. Thông qua thử nghiệm sinh học, các dẫn chất được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro trên nhiều dòng tế bào khác nhau, hứa hẹn ứng dụng trong phát triển thuốc chống ung thư mới.

1.2. Ý nghĩa khoa học của công trình

Công trình của Hoàng Phương Thảo (1401559) có ý nghĩa trong việc phát triển các chất ức chế HDAC thế hệ mới, với hiệu quả cao và tính độc tính thấp hơn. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế hoạt động của các chất HDACi và quan hệ giữa cấu trúc và tác dụng. Đây là bước đóng góp quan trọng cho lĩnh vực dược phẩm oncology và hóa dược chế tạo.

II. Histone Deacetylase HDAC và cơ chế hoạt động

Histone Deacetylase (HDAC) là một family enzym quan trọng có vai trò điều chỉnh acetylation của histone trong hạt nhân tế bào. Enzym này xúc tác quá trình deacetyl hóa, làm thay đổi cấu trúc chromatine và biểu hiện gen. Trong các tế bào ung thư, hoạt động của HDAC thường tăng cao, dẫn đến vô hiệu hóa các gen ức chế종양. Khóa luận của Hoàng Phương Thảo nhấn mạnh rằng ức chế HDAC là một chiến lược điều trị hứa hẹn. Các dẫn chất N-hydroxypropenamid được thiết kế để cặp liên kết mạnh với tâm hoạt động của HDAC, ngăn chặn quá trình deacetyl hóa và kích hoạt lại biểu hiện gen.

2.1. Cấu trúc và phân loại HDAC

HDAC được chia thành bốn lớp chính (Class I-IV) dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí trong tế bào. Mỗi lớp HDAC có vai trò khác nhau trong điều chỉnh biểu hiện gene và sức khỏe tế bào. Công trình của sinh viên 1401559 tập trung vào ức chế HDAC có tính chọn lọc cao, giảm thiểu tác dụng phụ không mong muốn từ ức chế HDAC toàn bộ.

2.2. Cơ chế hoạt động của các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC (HDACi) thường chứa ba thành phần chính: khu vực nhận diện bề mặt (SRG), linker, và khu vực kết thúc gắn kẽm (ZBG). ZBG (thường là acid hydroxamic) cấp liên kết với kẽm ở tâm hoạt động của HDAC. Các dẫn chất N-hydroxypropenamid trong khóa luận của Hoàng Phương Thảo được thiết kế đặc biệt để tối ưu hóa tương tác với HDAC.

III. Phương pháp tổng hợp và thử nghiệm sinh học

Khóa luận của Hoàng Phương Thảo (1401559) áp dụng các phương pháp hóa học hiện đại để tổng hợp các dẫn chất N-hydroxypropenamid. Quá trình tổng hợp bao gồm tạo liên kết amid và tạo acid hydroxamic, sử dụng các chất xúc tác hữu cơ như DMAP và các dung môi đặc chủng như DMF, THF. Các hợp chất tổng hợp được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và xác định cấu trúc bằng phổ NMR, phổ MS, phổ IR. Các dẫn chất được thử hoạt tính ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thư trên các dòng tế bào ung thư in vitro khác nhau, giúp đánh giá tiềm năng dược lý của các hợp chất.

3.1. Quy trình tổng hợp hóa học các dẫn chất

Quá trình tổng hợp các dẫn chất bắt đầu từ nguyên liệu thô và những thao tác hóa học cơ bản. Phương pháp tạo liên kết amid được sử dụng rộng rãi, trong đó DMAP hoạt động như chất xúc tác. Các điều kiện phản ứng (nhiệt độ, thời gian, dung môi) được tối ưu hóa để tăng hiệu suất. Sinh viên 1401559 tiến hành nhiều bước tinh chế sử dụng các phương pháp chromatography để thu được các hợp chất tinh khiết.

3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro

Các dẫn chất được thử hoạt tính ức chế HDAC thông qua các test enzymatic để xác định IC50 (nồng độ ức chế 50%). Hoạt tính kháng tế bào ung thư được đánh giá trên các dòng tế bào ung thư khác nhau như HCT116 (ung thư ruột), NCI-H23 (ung thư phổi), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), SW620 (ung thư đại tràng). Kết quả này giúp xác định potency và selectivity của các hợp chất.

IV. Kết quả ứng dụng và triển vọng phát triển

Khóa luận của Hoàng Phương Thảo (mã sinh viên 1401559) đạt được những kết quả khả quan trong tổng hợp và đánh giá hoạt tính của các dẫn chất N-hydroxypropenamid mới. Một số hợp chất tổng hợp cho thấy hoạt tính ức chế HDAC mạnh và hoạt tính kháng tế bào ung thư đáng kể. Các phát hiện này mở ra triển vọng phát triển thuốc mới trong lĩnh vực oncology. Công trình cũng cung cấp những thông tin có giá trị về quan hệ cấu trúc-tác dụng (SAR) của các chất ức chế HDAC, hỗ trợ cho thiết kế hợp chất trong tương lai. Kết quả của Hoàng Phương Thảo đóng góp vào cơ sở dữ liệu các hợp chất tiềm năng cho phát triển lâm sàng.

4.1. Các kết quả chính của khóa luận

Khóa luận của Hoàng Phương Thảo (1401559) tổng hợp thành công nhiều dẫn chất N-hydroxypropenamid mới với hiệu suất cao. Các hợp chất này thể hiện hoạt tính ức chế HDAC với giá trị IC50 ở phạm vi concentrations cạnh tranh với các inhibitor tham chiếu như SAHA. Một số dẫn chất đặc biệt cho thấy hoạt tính kháng ung thư xuất sắc trên các dòng tế bào ung thư khác nhau, chứng minh tiềm năng clinical của các hợp chất.

4.2. Triển vọng và hướng phát triển tương lai

Các kết quả từ khóa luận của Hoàng Phương Thảo tạo nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo trong phát triển dược phẩm chống ung thư. Triển vọng tương lai bao gồm tối ưu hóa cấu trúc các dẫn chất hứa hẹn, đánh giá in vivo, và nghiên cứu cơ chế hoạt động chi tiết. Công trình cũng có thể thúc đẩy hợp tác quốc tế trong lĩnh vực dược phẩm, như đã thể hiện qua sự hợp tác với các đại học Hàn Quốc trong quá trình thực hiện khóa luận.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, ung thư không chỉ là kết quả của các thay đổi di truyền trên cấu trúc gen mà còn bởi các thay đổi biểu hiện gen không liên quan tới thay đổi trình tự mã hóa ADN [7], [24]. Một số thay đổi biểu hiện gen này liên quan tới cách tế bào đọc mã gen thông qua quá trình methyl hóa ADN và các quá trình biến đổi histon như deacetyl/acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa. Khám phá này mở ra hướng nghiên cứu thuốc chống ung thư mới tập trung vào một số chất ức chế enzym kiểm soát biểu hiện gen, đặc biệt là ADN methyltransferase và histone deacetylase, kết quả cho thấy có nhiều chất được tạo ra với khả năng chống ung thư đầy hứa hẹn [7]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư [7], [26].

Hiện nay, trong các chất ức chế HDAC được tổng hợp và công bố, nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic có hoạt tính khá tốt trong đó điển hình là SAHA (Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC (HDACi) đầu tiên được FDA cấp phép lưu hành năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T. Sau đó là belinostat (Beleodaq®) năm 2014 và gần đây nhất panobinostat (Farydax®) cũng được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư vào năm 2015 [13]. Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC cho hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư thử nghiệm tốt. Trong đó có một số dẫn chất là N-hydroxypropenamid cho tác dụng ức chế HDAC mạnh và tiềm năng trên độc tính tế bào [13].

Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất N-hydroxypropenamid mới hướng ức chế histon deacetylase” với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp (E)-N-(3-((4-(3-(hydroxyamino)-3-oxoprop-1-en-1-yl)benzyl)oxy) phenyl)benzamid và 4 dẫn chất. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được. Khái niệm và phân loại histon deacetylase 1.

Khái niệm histon deacetylase Histon deacetylase (HDAC) là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm acetyl từ ε-N-acetyl lysin của nhiều protein khác nhau, trong đó acid amin này có nhiều trong đầu N của protein histon. HDAC cùng với histon acetyltransferase (HAT) quyết định dạng tồn tại acetyl hóa hoặc deacetyl hóa của histon [23]. Nucleosom là đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể (NST), gồm một đoạn ADN chứa 146 cặp nucleotid quấn quanh lõi protein octamer hình đĩa của các histon (1 tetramer H3/H4 và 2 dimer H2A/H2B). Các cặp histon có cấu trúc 2 phần quan trọng: đầu C nằm bên trong lõi, đầu N nằm bên ngoài nucleosom với acid amin kết thúc là lysin [6].

Vai trò của HDAC và HAT trong điều hòa quá trình phiên mã 2 HDAC deacetyl hóa lysin, làm đầu N tích điện dương lớn gây tương tác mạnh với ADN tích điện âm, dẫn tới đóng xoắn NST, ngăn cản quá trình phiên mã. Ngược lại HAT acetyl lysin, trung hòa điện tích dương nhóm ε-NH2 của lysin ở đầu N của histon, NST được tháo xoắn, quá trình phiên mã diễn ra [12] (xem hình 1. Phân loại histon deacetylase Hiện nay,các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở người và chúng được chia thành 4 nhóm [23], [11] (xem hình 1. Nhóm I, II và IV là những enzym phụ thuộc Zn2+.

Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các acid hydroxamic. Nhóm III là những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất như vậy vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào NAD+ [11], [10]. Phân loại các HDAC 1. Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym HDAC và cơ chế deacetyl hóa Các HDAC nhóm I, II, IV có trung tâm hoạt động gồm hai phần chính: + Ion Zn2+: là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon qua liên kết phối trí.

Trong phân tử HDAC, ion Zn2+ có thể tạo 4 liên kết phối trí với các acid amin và 1 3 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của acetyl lysin ở đầu N của histon từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl. Thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [25]. Như acid hydroxamic, ức chế HDAC bằng cách tạo hai liên kết phối trí với Zn2+ qua 2 nguyên tử oxy của nó. + Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, là nơi chứa cơ chất, tham gia liên kết Van der Waals với cơ chất và được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phenylalamin, Tyrosin, Prolin, Histidin.

Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất. Miệng túi có một vài vòng xoắn protein để tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC. Đáy túi có một vài phân tử nước, có nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deacetyl hóa và tạo liên kết hydro khi không có -OH của Tyrosin [9]. Cơ chế deacetyl hóa của HDAC được Finnin và cộng sự đưa ra vào năm 1999 dựa trên kết quả nguyên cứu HDLP (histon deacetylase like protein) có cấu trúc vùng acid amin tương đồng 30% với HDAC1 [9].

Cơ chế deacetyl hóa theo Finnin Đầu tiên, nguyên tử oxy của nhóm carbonyl của phần N-acetyl lysin trên đầu N của histon liên kết phối trí với Zn2+, làm nhóm carbonyl phân cực về phía oxy và 4 carbon trở nên ái điện tử hơn. Một phần nước sẽ tạo liên kết phối trí với Zn2+. Nhờ hệ thống chuyển tiếp Asp173-His132 và Asp166-His131, nguyên tử oxy của nước trở nên ái nhân hơn. Sau khi được hoạt hóa, oxy của nước tấn công và nguyên tử C của nhóm carbonyl tạo ra oxyanion tứ diện trung gian (oxy của nhóm carbonyl), được ổn định bởi Tyr297 và Zn2+.

Cuối cùng liên kết C-N bị bẻ gãy, 1 proton được chuyển từ His132 cho nguyên tử N tạo thành acetat và lysin [9]. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACi) 1. Phân loại HDACi Dựa vào cấu trúc hóa học, các chất ức chế HDAC được chia thành 6 nhóm: các acid hydroxamic, các aminobenzamid, các epoxyceton các peptid vòng, các acid carboxylic mạch ngắn, và các phân tử lai [22] (xem hình 1. Mỗi nhóm chất ức chế HDAC đều có những ưu nhược điểm riêng, trong đó nhóm acid hydroxamic bị nhanh thải trừ, tác dụng ức chế không chọn lọc HDAC nhóm I, II, IV nhưng có ưu điểm là ức chế ở nồng độ rất thấp (cỡ nM) và cấu trúc đơn giản, dễ tổng hợp [14].

Phân loại các chất ức chế HDAC 1. Cấu trúc các chất HDACi Các chất ức chế HDAC thường bao gồm 3 phần chính [8]: 5 - Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group - SRG) do hay còn gọi là nhóm khóa hoạt động (Capping group - CAP): tham gia vào quá trình nhận diện với bề mặt amino acid của enzym, thường là các vòng thơm hoặc peptid vòng. - Vùng cầu nối (Linker): có vai trò tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym giúp cho cơ chất cố định trong kênh, thường là các nhóm sơ nước, gồm các hydrocarbon thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no. - Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): tham gia tạo tương tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC, có thể là acid hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton.

Mô hình cấu trúc HDACi 1. Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC 1. Ảnh hưởng của nhóm nhận diện bề mặt Từ việc xác định được vai trò như đã nêu trên của nhóm nhận diện bề mặt, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc thay đổi nhóm nhận diện bề mặt giúp làm thay đổi hoạt tính và tính chọn lọc của HDACi [28], [16]. Năm 2010, nghiên cứu của T.

Sundarapandian và cộng sự đã chỉ ra các dẫn chất có nhóm nhận diện bề mặt thân dầu cho hoạt tính tốt hơn các dẫn chất không chứa nhóm này [27]. Trong nghiên cứu được công bố năm 2006, tác giả Juvale và cộng sự đã chỉ ra rằng việc thêm các nhóm thế giàu điện tử trên vòng phenyl của 6 nhóm CAP có thể làm tăng hoạt tính, cùng với đó sự có mặt của các nguyên tử hydro linh động và các trung tâm mang điện tích âm có khả năng tạo liên kết hydro với các acid amin trên kênh enzym cũng giúp làm tăng hoạt tính [16]. Nghiên cứu của nhóm tác giả Di Micco S. đã giải thích sự ức chế chọn lọc của các hợp chất cyclopeptid thiên nhiên mang vòng lớn (azumamid E và apicidi) trên HDAC nhóm I.

Nghiên cứu chỉ ra rằng, do cấu trúc miệng túi của kênh enzym khác nhau giữa các HDAC nên việc thay đổi cấu trúc vùng CAP phù hợp với cấu trúc miệng túi sẽ làm tăng tính chọn lọc của HDACi. Các HDAC nhóm I dễ dàng cho nhóm nhận diện bề mặt cồng kềnh của các cyclopeptid vào tương tác tạo liên kết bền vững giữa các chất ức chế HDAC với kênh enzym. Còn với các HDAC nhóm II, do bề mặt enzym lại chứa các phân tử cồng kềnh, khó tạo liên kết với các hợp chất vòng lớn [5]. Ảnh hưởng của vùng cầu nối Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vùng cầu nối của các chất ức chế HDAC nhóm 1 có chiều dài 4-6 carbon cho hiệu quả tốt vì nó tương ứng với chiều dài kênh enzym là khoảng 11 Å của nhóm này [20], [5].

Năm 2011, Choi và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bằng cách thêm các nhóm thế ở các vị trí khác nhau trên vùng linker của SAHA, kết quả chỉ ra rằng việc gắn thêm các nhóm thế vào vùng linker gần với nhóm acid hydroxamic gây bất lợi cho hoạt tính. Ngược lại việc thêm các nhóm thế trong vùng cầu nối gần với nhóm CAP cho hoạt tính tốt hơn [4]. Ảnh hưởng của nhóm kết thúc gắn kẽm Nghiên của của Zhang và cộng sự năm 2018 cho thấy nhóm ZBG đóng vai trò quyết định trong việc gắn với trung tâm hoạt động của HDAC qua đó xác định hiệu lực của các HDACi.