Đồ án: Khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase từ chiết xuất hạt me

Nghiên cứu về chiết xuất hạt me và khả năng ức chế tyrosinase. Khám phá tiềm năng làm trắng da, mờ thâm nám từ dược liệu thiên nhiên.

• Tác giả: Nguyễn Hiếu Pháp
• Người hướng dẫn: TS. Phan Thị Anh Đào
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học & Thực Phẩm
• Đề tài: Khảo Sát Hoạt Tính Ức Chế Tyrosinase Của Hạt Me (Tamarindus Indica L.)
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Hạt Me và Hoạt Tính Ức Chế Tyrosinase

Hạt me (Tamarindus indica L.) là một nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú chứa nhiều hợp chất sinh học có giá trị. Nghiên cứu khoa học đã chứng minh rằng ức chế tyrosinase là một cơ chế quan trọng trong việc kiểm soát sự hình thành sắc tố melanin. Enzyme tyrosinase đóng vai trò then chốt trong quá trình chuyển hóa L-DOPA thành DOPAchrom, dẫn đến sản xuất melanin quá mức. Các thành phần trong hạt me có khả năng ức chế hoạt động của enzyme này, từ đó mang lại tiềm năng làm trắng da tự nhiên hiệu quả. Theo khóa luận tốt nghiệp của Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh, các cao chiết từ hạt me thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase đáng kể, mở ra hướng phát triển mỹ phẩm tự nhiên an toàn.

1.1. Đặc điểm Sinh Học của Hạt Me

Hạt me chứa hàm lượng cao các polysaccharide, flavonoid và polyphenol - những hợp chất với tác dụng ức chế enzyme mạnh mẽ. Thành phần dinh dưỡng phong phú bao gồm protein, lipid, và các nguyên tố vi lượng như kẽm, sắt. Cây me được sử dụng trong y học cổ truyền hàng ngàn năm với công dụng chữa bệnh đa dạng. Hoạt tính sinh học của hạt me được khoa học hiện đại xác nhận thông qua các thử nghiệm in vitro.

1.2. Cơ Chế Hoạt Động của Enzyme Tyrosinase

Tyrosinase là enzyme đồng yếu tố chứa đồng (Cu) có vai trò catalize oxidation của tyrosine. Enzyme này kích hoạt sự hình thành melanin qua hai giai đoạn: hydroxylation và oxidation. Ức chế tyrosinase có thể thực hiện qua nhiều cơ chế: chelate kim loại Cu2+, cạnh tranh cơ chất, hay ức chế không cạnh tranh. Các hợp chất polyphenol từ hạt me hoạt động hiệu quả bằng cách tạo phức chelate với các ion đồng, làm giảm hoạt tính enzyme.

II. Thành Phần Hóa Học Có Tác Dụng Làm Trắng Da

Các hợp chất hoạt tính trong hạt me bao gồm β-sitosterol, terpen, steroid và chất béo đặc biệt có khả năng ức chế tyrosinase hiệu quả. Nghiên cứu phân tích thành phần của cao ethyl acetate từ hạt me đã xác định được nhiều hợp chất ức chế enzyme quan trọng. Acid koijic, một chất tham khảo điển hình trong ngành mỹ phẩm làm trắng da, cũng được so sánh với các cao chiết tự nhiên từ me. Các phân đoạn cao khác nhau thể hiện mức độ ức chế tyrosinase khác nhau, cho thấy tác dụng làm trắng da tự nhiên của hạt me là nhất quán và đáng tin cậy. Những hợp chất polyphenol và flavonoid có trong hạt me không chỉ ức chế enzyme mà còn có tác dụng chống oxy hóa bổ sung.

2.1. Polyphenol và Flavonoid Các Chất ức Chế Chính

Polyphenol và flavonoid là những hợp chất chính chịu trách nhiệm cho khả năng ức chế tyrosinase của hạt me. Những hợp chất này hoạt động bằng cách tạo phức chelate mạnh với ion Cu2+ trong hoạt động tâm của enzyme. Các nghiên cứu in vitro cho thấy cao ethyl acetate có nồng độ polyphenol cao thể hiện khả năng ức chế tốt nhất. Flavonoid như quercetin và các đối tượng tương tự là những ức chế enzyme tự nhiên hiệu quả có trong thành phần hạt me.

2.2. Cơ Chế Tạo Phức Chelate với Cu2

Cơ chế ức chế tyrosinase thông qua chelate Cu2+ là một trong những cách làm trắng da tự nhiên hiệu quả nhất. Các hợp chất trong hạt me có thể kiết nước các ion đồng trong hoạt động tâm của enzyme, làm giảm khả năng xúc tác phản ứng oxidation. Phương pháp khảo sát khả năng khử Cu2+ trong nghiên cứu sử dụng BCDS như chất chỉ thị hiệu quả. Kết quả thử nghiệm cho thấy các cao chiết từ hạt me có khả năng tạo phức chelate tương đương hoặc vượt trội so với acid koijic tiêu chuẩn.

III. Tiềm Năng Ứng Dụng trong Mỹ Phẩm Làm Trắng Da

Tiềm năng làm trắng da tự nhiên từ hạt me mang lại nhiều lợi ích so với hóa chất tổng hợp truyền thống. Các sản phẩm mỹ phẩm tự nhiên sử dụng cao chiết hạt me có thể cung cấp hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh mẽ mà không gây tác dụng phụ nghiêm trọng. Ứng dụng thực tế của các hợp chất ức chế enzyme từ hạt me trong các sản phẩm dưỡng da đang được phát triển rộng rãi. Tiềm năng thương mại của mỹ phẩm làm trắng da tự nhiên dựa trên hạt me là rất lớn, đặc biệt trên thị trường mỹ phẩm hữu cơ đang phát triển nhanh chóng. Những công thức dược mỹ phẩm kết hợp cao hạt me với các thành phần tự nhiên khác có thể tạo ra sản phẩm làm trắng da an toàn và hiệu quả cho người tiêu dùng hiện đại.

3.1. Lợi Ích So Với Thành Phần Hóa Học Tổng Hợp

Hóa chất tổng hợp như hydroquinone và tretinoin thường gây kích ứng da và tác dụng phụ không mong muốn. Hạt me làm trắng da mang lại tác dụng ức chế tyrosinase tự nhiên an toàn hơn. Cao chiết từ hạt me không chỉ ức chế enzyme mà còn cung cấp chống oxy hóa và chống viêm. Sản phẩm mỹ phẩm tự nhiên từ me phù hợp với làn da nhạy cảm và xu hướng tiêu dùng bền vững hiện nay.

3.2. Phát Triển Công Thức Mỹ Phẩm Hiệu Quả

Phát triển sản phẩm mỹ phẩm từ hạt me đòi hỏi tối ưu hóa nồng độ cao chiết và phương pháp điều chế. Công thức dược mỹ phẩm cần kết hợp cao hạt me với các thành phần bổ trợ như vitamin C hoặc azelaic acid. Kiểm định an toàn và hiệu quả lâm sàng là bước quan trọng trước khi đưa sản phẩm làm trắng da ra thị trường. Ứng dụng công nghệ nano có thể tăng cường hấp thụ của hoạt chất ức chế tyrosinase vào da.

IV. Hướng Nghiên Cứu và Phát Triển Tương Lai

Nghiên cứu về ức chế tyrosinase từ hạt me vẫn còn nhiều hướng phát triển tiềm năng chưa được khai thác. Phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất hoạt tính mới từ hạt me là một trong những mục tiêu nghiên cứu quan trọng. Thử nghiệm in vivo trên mô hình da thực tế cần được thực hiện để xác nhận hiệu quả làm trắng da tự nhiên của hạt me. Tối ưu hóa quá trình chiết xuất và nâng cao hiệu suất các hợp chất ức chế enzyme là những thách thức kỹ thuật cần giải quyết. Phát triển bệ phôi bảo quản để bảo vệ hoạt tính của các cao chiết hạt me trong sản phẩm mỹ phẩm cuối cùng cũng là vấn đề quan trọng cần nghiên cứu sâu hơn.

4.1. Phân Lập Hợp Chất Ức Chế Tyrosinase Mới

Phân lập hợp chất từ cao ethyl acetate của hạt me đã xác định được β-sitosterol (TI-C01) và nhiều hợp chất khác có khả năng ức chế tyrosinase. Phương pháp phân tách chromatography và phân tích phổ NMR cho phép xác định cấu trúc chính xác của các hợp chất ức chế enzyme. Tổng hợp hóa học các hợp chất này từ tiền chất có thể tối ưu hóa hoạt tính và cải thiện độc tính. Kinh tế hóa quá trình phân lập và tinh chế các hợp chất hoạt tính là mục tiêu phát triển công nghệ trong tương lai.

4.2. Ứng Dụng Công Nghệ Hiện Đại trong Nghiên Cứu

Công nghệ nano có thể tăng cường sinh khả dụng của các hợp chất ức chế tyrosinase từ hạt me. Thử nghiệm lâm sàng trên tình nguyện viên cần được tiến hành để đánh giá hiệu quả làm trắng da thực tế. Mô hình da tái tạo (reconstructed epidermis) là công cụ hiệu quả để đánh giá tác dụng trước khi thử nghiệm trên người. Công nghệ xác suất gen và giải mã protein có thể giúp hiểu rõ cơ chế ức chế tyrosinase ở mức độ phân tử để phát triển hợp chất hiệu quả hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Khái quát về Tamarindus Indica L. Đặc điểm thực vật học Theo phân loại theo khoa học của cây Tamarindus indica L. [1], được trình bày trong bảng 1.

1: Phân loại khoa hoc của Tamarindus indica L. Bộ Fabales Họ Fabaceae Phân họ Caesalpinioideae Tông Detarieae Chi Tamarindus Loài Tamarindus indica Cây me, Tamarindus indica L. indica), là một loại cây ăn trái nhiệt đới thuộc họ đậu (Fabaceae), được sử dụng rộng rãi trong cuộc sống hằng ngày. Loài duy nhất của chi Tamarindus thuộc họ đậu (Fabaceae) là Tamarindus Indica L.

hay cây me. Cây me là cây thân gỗ thường xanh, thân cây cao to từ 15 đến 30 m. Gỗ của thân cây me gồm lớp gỗ lõi cứng, màu đỏ sẫm và lớp dác gỗ mềm màu vàng [2]. Cây có rất nhiều lá, lá dạng kép lông chim, dài từ 8 đến 10 cm, dài khoảng 2 cm rộng 0.

Hoa trắng nhạt hoặc có vệt đỏ, màu của hoa giống nhau trên toàn bộ cây không trộn lẫn [3]. Hoa mọc thành từng chùm ở kẽ lá hoặc thành chùy tận cùng. Hoa đa phần là lưỡng tính, thông thường có mười nhụy hoa và có một nhụy dài vượt trội và cong. Quả dài mọc thõng xuống, hơi dẹt và thòng, dài từ 7 đến 12 cm, rộng 2.

Vỏ quả mỏng, cứng, giòn, màu hung đỏ, vỏ quả giữa có sơ, mẫm vị chua, sau khi loại hết sơ thì phần vỏ quả có màu nâu nhạt. Quả chứa từ 3 đến 5 hạt màu nâu đỏ, cứng, nhẵn, bóng [2]. Rễ cây bao 1 gồm phần rễ cộc mọc đâm sâu xuống đất và hệ thống rễ phụ dày đặc xung quanh [4]. Mùa quả là khoảng từ tháng 10 đến 11 trong năm [2].

1:Cây me và một số bộ phận của cây 1. Phân bố và sinh thái Họ đậu (Fabaceae) là họ lớn thứ ba trong các họ thực vật có hoa, chỉ sau họ phong lan và cúc, tổng cộng có 751 chi đã được tìm ra, số lượng loài đã đạt tới con số 19,327 [5-7], chiếm khoảng 7% các loại thực vật có hoa [6, 8]. Họ đậu bao gồm cây thân thảo hay cây bụi hằng năm hoặc lâu năm, được nhận dạng thông qua hình dạng của quả, hợp 2 chất có trong cây và hình dạng và cách bố trí của lá. Họ đậu chiếm số lượng lớn cây ăn quả và cây nông nghiệp như cây đậu phộng, đậu nành, cây kim tước.

Họ đậu là họ phổ biến nhất được tìm thấy ở các khu rừng khô thuộc châu Mỹ và châu Phi [9]. Cây me là cây bản địa của vùng nhiệt đới châu Phi, được trồng để lấy bóng mát [4]. Cây me phát triển tốt ở các vùng cao hơn 1,500 m trên mực nước biển và có lượng mưa hàng năm hơn 1,500 mm. Cây me có thể phát triển ở nhiều loại đất khác nhau, thích hợp nhất ở các loại đất mùn thoát nước, có độ pH= 5-6, nhưng cũng có thể phát từ đất phù sa đến đất đá vôi.

Cây me được phân bố rộng rãi trên toàn thế giới với hơn 50 quốc gia. Diện tích trồng phần lớn tập trung ở hầu hết tại các nước châu Á như Ấn Độ, Thái Lan, …[10, 11]. Ở châu Mỹ, Mexico và Costa Rica là nơi có sản lượng lớn nhất. Cây me được phân bố rộng, được trồng hoặc mọc hoang khắp Việt Nam từ tỉnh Hà Bắc, Vĩnh Phú tới các tỉnh Tây Nguyên, miền trung và các hải đảo, trồng nhiều hơn ở các tỉnh miền nam.

Đó là loại gỗ ưa sáng, có biên độ sinh thái rộng và có thể sống trên nhiều loại đất. Cây me được trồng để làm bóng mát, vừa lấy lá, quả và làm thuốc. Những công dụng của cây T. Kinh nghiệm sử dụng trong dân gian Ở Ấn Độ, cây me được sử dụng để điều trị một số bệnh liên quan đến dạ dày, tiêu hóa và tim mạch [12].

Ở miền bắc Nigeria, vỏ thân cây me tươi và lá tươi được sử dụng như thuốc sắc pha trộn với bồ tạt cho điều trị các chứng bệnh về dạ dày, đau cơ thể, sốt vàng da và loại thuốc bổ máu và những chất rửa da [13]. Theo y học phương tây, hạt me là một phương thức lợi tiểu, điều trị chứng rồi loạn mật, vàng da, giúp hệ thần kinh hoạt động tốt do thành phần thiamin chiếm 29%. Thiamin là một loại vitamin có vai trò quan trọng trong các hoạt động của dây thần kinh và cơ bắp. Me là một nguồn cung cấp vi chất cho cơ thể như Ca2+, Mg2+ [2, 14].

Quả me chứa nhiều vitamin C nên giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể, hạn chế các bệnh do nhiễm trùng. Quả me là nguồn cung cấp chất sơ cao nhất trong các loại trái cây với thành phần chất xơ khoảng 20%. Với lượng kali cao gấp hai lần lượng kali có trong chuối do đó hạt me có tác dụng kiểm soát huyết áp rất tốt [14]. Quả me được biết đến như một vị thuốc chữa bệnh thiếu máu do hàm lượng sắt chiếm 2.

Vì vậy, đây cũng là loại trái cây tốt cho những người thiếu máu, đặc biệt là phụ nữ có thai. Bên cạnh đó, 3 quả me còn kiểm soát mức độ cholesterol, cung cấp năng lượng mà không gây béo, hỗ trợ cơ chế đông máu. Gỗ cây me được dùng dưới dạng thuốc sắc để thông tiểu. Việt Nam, theo các nhà dinh dưỡng học, trong quả me có nhiều vitamin B, C… Nên có tác dụng nhuận tràng, giúp kích thích vị giác, cải thiện tình trạng kém ăn, mệt mỏi do nắng nóng hay buồn nôn, chán ăn khi mang thai.

Trái me có khả năng bù nước, điện giải, cung cấp vitamin, khoáng chất, giải nhiệt… Trong đông y, quả me có vị chua tính mát, thanh nhiệt, giải khát, tăng cường tiêu hóa. Chữa các bệnh: phụ nữ mang thai nôn nghén, chữa ho, làm ấm bụng, trị chứng chảy máu chân răng, chữa sốt do nắng nóng… Một số bài thuốc dân gian về quả me [2]: Quả me xanh đem cạo vỏ ngoài, rửa sạch, để ráo nước, giã nát với gừng tươi cho thật nhuyễn, loại bỏ xơ. Thêm đường vừa đủ. Đun nhỏ lửa và đảo đều, sau đó trộn với bột cam thảo vừa đủ khô, rồi đóng khuôn làm thành dạng ô mai, mỗi ngày ngậm 3 – 6 lần dùng để chữa ho, làm ấm bụng, kích thích tiêu hóa (theo Y học cổ truyền Việt Nam).

Thịt quả me pha với nước ấm, uống vào mỗi buổi sáng sau bửa ăn dùng để trị chảy máu chân răng. Me xanh đem đun với nước, giã nhuyễn lấy phần thịt loại hạt, trộn chung với muối thoa đểu lên chỗ xương khớp đau nhứt để giảm đau. Hoạt tính sinh học của cây T. indica Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây T.

indica trên thế giới: Năm 2017, Sukant Garg và cộng sự đã nghiên cứu và cô lập được các hợp chất polysaccaride từ hạt me (TSP) bằng dung môi ethanol và nước. nghiên cứu đã chỉ ra rằng, chiết xuất TSP không gây độc hại cho tế bào khi tiếp xúc trong thời gian dài [15]. Siddhuraju và cộng sự (2007) đã nghiêu cứu và công bố các hợp chất polyphenol được trích từ vỏ hạt me trong nhiều phân đoạn cao khác nhau và các phương pháp điều chế cao. Từ đó tiến hành xác định tổng hàm lượng polyphenol và tannin có trong hạt me đồng thời thử khả năng kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH và khử sắt.

Các số liệu có được từ thực nghiệm đã phản ánh kháng oxi hóa của nhiều phương pháp điều chế cao khác nhau [16]. Sudjaroen và các cộng sự công bố bài nghiên cứu về việc nghiên cứu cấu trúc của chất kháng oxi hóa – polyphenol được trích từ vỏ hạt me, đưa ra các số 4 liệu về sự đa dạng và hàm lượng của polyphenol có trong vỏ hạt me. Phần trăm các hợp chất polyphenol điển hình trong vỏ me như sau: tổng proanthcyanidin (chiếm 73.4) tồn tại các dạng (+)-catechin (2. Trong thực nghiệm khảo sát hypoxanthine / xanthine oxyase đã đưa ra giá trị IC50 trong việc ức chế xanthine oxyase lần lượt là 38.

Trong xét nghiệm 2-deoxyquanosine, giá trị IC50 lần lượt là 185 và 90,0 μG/mL đối với hạt và vỏ quả [16]. Zhongshan, Lihong và cộng sự đã tạo dẫn chất sulfate hóa và acetyl hóa của polysaccharide làm tăng khả năng chống oxy hóa [17]. Từ kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa và tyrosinase của 60 loại phụ phẩm Việt Nam (2014-2016) của nhóm tác giả P. Đào và cộng sự đã phát hiện ra cao chiết ethanol từ hạt me có hoạt tính cao tương ứng giá trị IC50 đối với phép thử ức chế gốc tự do DPPH là 6.91 µg/mL, phép thử ức chế H2O2 là 113.8 µg/mL, tổng hàm lượng flavonoid là 848.

Takanori Tsuda và cộng sự đã định danh được các hợp chất 2-hydroxy-3’,4’- dihydroxyacetophenone; methyl 3,4-dihydroxybenzoate; 3,4-dihydroxyphenylacetate và epicatechin. Đây là những chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh. Bên cạnh đó, chất chống oxi hóa ưa lipid (linoleic acid) cũng được phân lập và định danh từ hạt me, thử nghiệm hoạt tính theo mô hình thử với acid thiobarbituric [18]. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây T.

Thành phần dinh dưỡng của cây T. indica Phần có giá trị và được sử dụng phổ biến nhất của cây me là quả. Phần thịt quả chiếm khoảng 30-50% trên toàn bộ quả [19, 20], phần vỏ và chất xơ khoảng 11-30%, phần hạt khoảng 25-40% [20, 21], thành phần dinh dưỡng được thể hiện qua bảng 1. 2: Thành phần dinh dưỡng của thịt quả me, lá non, hoa me Thành phần Thịt quả me (%) Lá non (%) Hoa me (%) Nước 20.7 Trong thịt quả me, lá non, hoa me còn chứa các loại muối khoáng vi lượng.

Trong thịt quả me, hàm lượng calci (34-94 mg/100g), phospho (34-78 mg/100g), sắt (0. Trong hạt me bao gồm vỏ hạt 20- 30% và nhân hạt 70- 75% trên tổng khối lượng hạt [20, 22]. Hạt me rất giàu protein, phần vỏ hạt chứa rất nhiều chất sơ va tannin. Theo báo cáo của Panigrahi và các cộng sự (1989), đã nói rằng trong hạt me có chứa 131,3 g/kg protein thô, 67.1 g/kg chất sơ thô, 48.2 g/kg chất béo thô, 56.2 g/kg tannin, với rất nhiều carbohydrate đạng đường.

Phần vỏ hạt chứa 14- 18% albuminoid tannin [24]. Thành phần dinh dưỡng trong hạt me được thể hiện trong bảng bảng 1. 3: Thành phần dinh dưỡng của hạt me, (%) Thành phần Hạt me Nhân hạt Vỏ hạt Nước 9.4 Hạt me còn được xem như là lương thực hoặc thực phẩm vì bên trong hạt chứa một lượng lớn protein [26]. Protein thô và các thành phần dinh dưỡng không chứa nitrogen có hàm lượng tương ứng 15.

Đường pentose chiếm khoảng 20%, menose từ 17% đến 35% và glucose là 12% trên tổng lượng đường. Hạt me còn chứa nhiều loại protein và amino acid thiết yếu như isoleucine (313 mg/g), leucine (531 mg/g), methionine (113 mg/g), phenylalanin (318 mg/g)… [20, 27].