TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN LANG ThS. Phẩm Minh Thu (Chủ biên) PGS. Võ Thị Chi Mai GIÁO TRÌNH THỰC HÀNH VI SINH (DÙNG CHO ĐÀO TẠO DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC) NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT CHỊU TRÁCH NHIỆM XUẤT BẢN Q. GIÁM ĐỐC: BÙI MINH CƯỜNG CHỊU TRÁCH NHIỆM NỘI DUNG TS.
NGUYỄN HUY TIẾN BIÊN TẬP NGUYỄN MINH CHÂU THIẾT KẾ MAKET NỘI DUNG NGUYỄN MINH CHÂU THIẾT KẾ BÌA ĐẶNG NGUYÊN VŨ NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT 70 Trần Hưng Đạo - Hoàn Kiếm - Hà Nội ĐT: 024 3942 3172 Fax: 024 3822 0658 Email: nxbkhkt@hn.vn Website: https://nxbkhkt.vn CHI NHÁNH NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT 28 Đồng Khởi - Quận 1 - TP Hồ Chí Minh ĐT: 028 3822 5062 Số ĐKXB: 3966-2021/CXBIPH/3-175/KHKT Quyết định xuất bản số: 209/QĐ-NXBKHKT, ngày 10 tháng 11 năm 2021. ISBN: 978-604-67-2076-8 LỜI NÓI ĐẦU Giáo trình Thực tập vi sinh là học phần thực tập cơ sở ngành bắt buộc được quy định trong Chương trình Đào tạo Dược sĩ của Trường Đại học Văn Lang, nhằm giúp cho sinh viên nắm vững nguyên tắc, kỹ năng và thực hiện được các kỹ thuật phân tích vi sinh trong phòng thí nghiệm. Trong giáo trình phần thực hành này giúp sinh viên thực hiện những kỹ thuật cơ bản: Sử dụng kính hiển vi để quan sát và nhận dạng cấu trúc tế bào vi khuẩn. Các kỹ thuật nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm và dược phẩm.
Các kỹ thuật xác định khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Phương pháp định tính và định lượng vi khuẩn trong các mẫu dược phẩm. Các kỹ thuật xác định độ vô trùng và độ nhiễm khuẩn của mẫu thuốc dược phẩm theo Dược Điển Việt Nam V. Giáo trình Thực tập vi sinh được chọn lọc đặc thù riêng cho chuyên ngành Dược.
Kỹ thuật thao tác dựa theo các kiến thức chuẩn, cơ bản nhưng có cập nhật những nội dung mới trong định danh vi khuẩn và ứng dụng kiểm nghiệm vi sinh trong dược, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng do đó mang được nét đặc thù riêng của giáo trình. Thực tế có rất nhiều sách viết về lý thuyết vi sinh từ cơ bản cho đến chuyên sâu, nhưng rất ít sách viết về thực tập vi sinh cho chuyên ngành Dược. Chúng tôi hy vọng giáo trình này sẽ hữu ích, áp dụng được vào thực tiễn công việc và mang nét riêng trong chương trình đào tạo cho sinh viên chuyên ngành Dược ở Trường Đại học Văn Lang. Mặc dù các tác giả đã cố gắng, nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các bạn đọc, để lần sau tái bản tốt hơn.
Các tác giả Phẩm Minh Thu 3 NỘI QUY PHÒNG THỰC HÀNH VI SINH Khi làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh vật mọi người đều phải tuân thủ các nội quy dưới đây: 1. Sinh viên đến học thực hành tại phòng thí nghiệm vi sinh cần: - Mặc áo choàng, mang thẻ sinh viên; - Đầu tóc gọn gàng, không để móng tay dài; - Không được ra khỏi lớp khi chưa được phép; - Tắt chuông điện thoại; - Không ăn uống trong phòng thí nghiệm; 2. Thao tác đúng vị trí quy định: phòng thực hành có 2 dãy bàn, mỗi dãy có 6 vị trí, mỗi vị trí sẽ bố trí 2 sinh viên (tương đương 1 nhóm). Chỗ của mỗi sinh viên do phòng thí nghiệm sắp xếp và không được phép thay đổi chỗ từ đầu cho tới cuối khóa học nếu chưa được phép của giảng viên.
Đầu buổi học, mỗi nhóm sẽ tự lãnh dụng cụ và trả lại khi buổi học kết thúc. Mỗi vị trí bố trí 1 kính hiển vi tùy bài thực hành và sẽ được sử dụng trong suốt buổi học. Đầu buổi học khi phát hiện thiếu hoặc hư hỏng phần nào của kính, xin báo ngay cho giảng viên của phòng thí nghiệm. Sau khi kết thúc buổi thực hành, sinh viên tự thu dọn và làm vệ sinh bàn thực hành của mình.
Nhóm thực tập phân công vệ phòng học và thu gom rác thải theo qui đinh. Sinh viên chịu trách nhiệm về các dụng cụ mà phòng thí nghiệm đã cấp phát trong mỗi buổi học. Khi mất hoặc làm hư hỏng thì phải mua trả lại. Các đồ dùng mang theo: - Giáo trình thực tập, bút viết; - Bút lông dầu viết trên lam kính, ống nghiệm, hộp lồng; - Găng tay, khẩu trang.
Phải tuân thủ đúng chỉ dẫn của giảng viên. Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm khi chưa được hướng dẫn cụ thể. Sinh viên phải đọc kỹ các bài trong giáo trình trước khi đến lớp để buổi thực hành thu được kết quả tốt. Sinh viên phải thực hiện đầy đủ các bài thực tập theo chương trình của môn học.
Vắng 01 buổi thực tập sẽ không được thi hết môn. Phải làm đơn xin phép nghỉ và xin đi thực tập bù nộp cho giảng viên phụ trách buổi thực tập đó. Đơn xin thực tập bù phải được sự cho phép của trưởng bộ môn. 5 MỤC LỤC Lời nói đầu.
3 Nội quy phòng thực hành vi sinh. 6 Danh mục chữ viết tắt. 8 TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH I. Trang thiết bị.
Dụng cụ thí nghiệm. An toàn sinh học trong phòng thí nghiệm. An toàn trong quá trình lấy và vận chuyển mẫu. Bảo đảm an toàn sinh học tại phòng thí nghiệm.
Sự cố an toàn sinh học. An toàn hóa học, lửa, bức xạ và trang thiết bị. Xử lý chất thải. Thực hành tốt trong phòng thí nghiệm.
Các kỹ thuật vi sinh cơ bản. Sử dụng kính hiển vi. Kỹ thuật nhuộm màu. Dụng cụ và môi trường nuối cấy, phân lập vi khuẩn.
Kỹ thuật cấy và phân lập vi khuẩn. 34 Câu hỏi lượng giá. Các thử nghiệm sinh hóa định danh cầu khuẩn. Cầu khuẩn Gram dương gây bệnh thường gặp.
Các thử nghiệm sinh hóa định danh cầu khuẩn. 38 Câu hỏi lượng giá. Các thử nghiêm sinh hóa định danh trực khuẩn đường ruột. Các loại môi trường nuối cấy vi khuẩn.
Các thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn đường ruột. Quan sát kết quả cấy trên môi trường EMB và SS. Thử nghiệm oxidase. Thử nghiệm MR.
Thử nghiệm VP (Voges - Proskauer). Thử nghiệm trên môi trường SIM (Sulfur Indole Mobility). Thử nghiệm citrat. Thử nghiệm trên môi trường KIA.
59 Câu hỏi lượng giá. Các thử nghiệm kháng sinh. Cơ sở lý thuyết về kháng sinh. Phần thực hành.
Thử nghiệm kháng sinh đồ. Phối hợp kháng sinh. Xác định MIC và MBC. 65 Câu hỏi lượng giá.
Kiểm tra vi sinh mẫu nước. Phương pháp lấy mẫu. Phương pháp kiểm tra vi sinh mẫu nước. 73 Một số quy chuẩn quốc gia đánh giá chất lượng nước.82 Câu hỏi lượng giá.
Phương pháp kiểm tra độ vô trùng, độ nhiễm khuẩn của dược phẩm. Thử nghiệm độ vô trùng. Phương pháp thử nghiệm độ nhiễm khuẩn. 86 Tài liệu tham khảo.
90 Phần phụ lục. 92 7 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BYT: Bộ Y Tế BGBL: Brilliant Green Bile Lactose CFU: Colony Forming Unit EMB: Eosin Methylene Blue Agar IMViC: Indol Methyl red, Voges-Proskauer, Citrate KIA: Kligler Iron Agar KIA LT: Heat-labile toxin MPN: Most Probable Number PCA: Plate Count Agar QCVN: Quy chuẩn Việt Nam SIM: Sulfur Indole Mobility SS: Salmonella Shigella ST: Heat-stable toxin TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam TSI: Triple Sugar Iron TSI: Triple sugar iron agar VP: Voges - Proskauer 8 TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH I. TRANG THIẾT BỊ 1. Tủ sấy (vacuum oven) Tủ có thể điều chỉnh nhiệt độ từ 60 - 200oC, dùng để tiệt trùng khô các loại dụng cụ chịu được nhiệt độ cao, chủ yếu là dụng cụ thủy tinh hay kim loại.
Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà chọn chế độ sấy ở nhiệt độ và thời gian phù hợp. Thông thường sấy ở 160oC trong 60 phút hoặc 170oC trong 30 phút. Tủ ấm (incubator hoặc etuve) Nhiệt độ từ 20 - 60oC, có chế độ nhiệt ổn định, sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật. Nhiệt độ được cài đặt khác nhau tùy vào đối tượng nuôi cấy để vi sinh vật có thể phát triển tốt.
Ví dụ Coliform ở 30oC trong 24 - 48 giờ, E. coli thích hợp ở 44oC trong 24 - 48 giờ. Tủ lạnh hay tủ mát (refrigerator) Nhiệt độ từ 0 - 10oC, dùng để bảo quản môi trường đã pha chế, giữ chủng vi khuẩn, các chế phẩm sinh học (vacxin, huyết thanh, đĩa kháng sinh.), hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường. Nồi hấp ướt (autoclave) Thiết bị được cấp nhiệt bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao, sử dụng để hấp tiệt trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật, dụng cụ phòng thí nghiệm, dụng cụ phẫu thuật, một số nguyên liệu dùng trong sản xuất.
Nhiệt độ sử dụng: 121oC/15 phút; 1 atm hoặc 127oC/30 phút; 1,5 atm hay 117oC/15 phút 0,8 atm. Tùy đối tượng cần tiệt trùng mà điều chỉnh nhiệt độ, thời gian và áp suất thích hợp. Tương quan giữa thể tích môi trường và thời gian hấp tiệt trùng ở 121oC Thể tích môi trường nuôi cấy (ml) Thời gian hấp tiệt trùng tối thiểu (phút) 25 20 50 25 100 28 250 31 500 35 1. Tương quan giữa áp suất hơi (chỉ số của áp kế nồi hấp) và nhiệt độ Chỉ số áp kế nồi 0,0 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0 áp suất (atm) Nhiệt độ sôi nước (0C) 100 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134 Nhiệt độ sôi nước (0F) 212 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273 1.
Cân phân tích điện tử 4 số lẻ (analytical balance) Dùng cân trọng lượng từ 100 µg - 200 g. Cân kỹ thuật có độ chính xác 10-2g dùng để cân môi trường và hóa chất. Trong quá trình sử dụng không cân quá trong lượng tối đa và tối thiểu. Tủ cấy vô trùng (flux laminar) Tủ này có không gian vô trùng nhờ hệ thống đèn tử ngoại (UV) và bộ phận thổi khí vô trùng, được sử dụng để thao tác với vi sinh vật.
Máy ly tâm (centrifuge) Máy này dùng để tách các chất ở pha rắn - lỏng ra khỏi nhau như tách sinh khối tế bào ra khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme. Khi sử dụng, các ống ly tâm được đặt vào máy theo nguyên tắc đối xứng và đồng lượng. Kính hiển vi (microscope) Kính hiển vi có vai trò rất quan trọng để quan sát đặc điểm cấu trúc hình thái của tế bào, một số tính chất sinh lý sinh hóa của vi sinh vật nhờ vào khả năng phóng đại của kính. Máy đo pH (pH meter) Dùng để đo pH dung dịch, hóa chất, môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Máy cách thủy ổn nhiệt (water bath) Thiết bị này chứa nước do vậy nên có ưu điểm giữ nhiệt độ ổn định và đồng nhất. Tùy vào những thí nghiệm mà cài đặt nhiệt độ thích hợp.