CHƯƠNG I: NHỮNG NGUYÊN TẮC HOÁ SINH TRONG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT ðể tạo ra bất kì một sản phẩm lên men nào ñều phải qua các bước sau: - Chuẩn bị môi trường - Chuẩn bị giống - Lên men - Thu hồi và tinh chế sản phẩm ðể tạo ra sản phẩm có chất lượng tốt và năng suất cao thì cần hiểu rõ các vấn ñề sau.1 Phân loại sản phẩm của công nghệ vi sinh vật Các sản phẩm lên men công nghiệp ñược phân loại theo các tiêu chuẩn sinh lí trao ñổi chất. Sự phân loại này dựa vào sản phẩm chính của quá trình lên men vì các quá trình sản xuất nhờ vi sinh vật luôn luôn tạo thành nhiều sản phẩm.1 Vật chế tế bào (sinh khối) Cơ chất tế bào Ví dụ: + protein ñơn bào (trạng thái chết) + vi khuẩn cố ñịnh ñạm (sống): Rhizobium, Azotobacter, VK trừ sâu Bacillus thuringiensis… Việc tổng hợp sinh khối hay vật chất tế bào ñồng nhất với sinh trưởng của vi sinh vật. Sinh trưởng và sinh sản gắn liền với nhau. Sinh trưởng là tăng khối lượng, còn sinh sản là tăng số lượng.2 Các sản phẩm trao ñổi chất Cơ chất sản phẩm + tế bào 1.
Các sản phẩm cuối cùng của sự trao ñổi năng lượng (các sản phẩm lên men) Ví dụ: etanol, axít lactic, axeton-butanol… Lên men là quá trình yếm khí của sự thu nhận năng lượng, trong ñó hydro tách ra ñược chuyển ñến các chất nhận hữu cơ (nó không ñồng nghĩa với sự lên men trong ngôn ngữ quốc tế - nó ñược hiểu là các quá trình sản xuất công nghiệp nhờ vi sinh vật) Một số cơ thể tiến hành lên men khi không có oxy làm chất nhận hydro cuối cùng (kỵ khí tuỳ tiện), những nhóm cơ thể lên men bắt buộc thì không chứa các enzym hô hấp. Các hợp chất hữu cơ nhận hydro là những hợp chất ñược hinh thành trong quá trình trao ñổi chất dị hoá. Sau khi nhận hydro, các hợp chất này thải ra ngoài tế bào giống như các sản phẩm cuối cùng của sự hô hấp. Từ ñó nảy ra vấn ñề là trong sản xuất cần chọn các ñiều kiện nuôi sao cho càng nhiều cơ chất ñược chuyển thành các sản phẩm lên men càng tốt.
Ví dụ: trong sản xuất rượu ñể tăng hàm lượng rượu thì cần tăng hàm lượng ñường và giảm các yếu tố quan trọng cho sinh trưởng. Các chất trao ñổi bậc 1 Ví dụ: axít amin, nucleotit, vitamin, axít xitric. Các chất trao ñổi bậc một là những viên gạch cấu trúc có trọng lượng phân tử thấp của các cao phân tử sinh học của tế bào chất: axít amin, nucleotit, nucleozit, ñường, axít béo, vitamin… Ngoài ra các sản phẩm trung gian của quá trình trao ñổi chất (các axít hữu cơ trong chu trình ATC) cũng là các chất trao ñổi bậc 1. Các cơ chế ñiều hoà phát triễn trong quá trình tiến hoá bảo ñảm sao cho các chất trao ñổi bậc 1 chỉ ñược tổng hợp ñến mức ñộ cần thiết.
Các chất trao ñổi bậc 2 Ví dụ: kháng sinh, alcaloit Các chất trao ñổi bậc 2 là những chất trao ñổi có trọng lượng phân tử thấp, không gặp ở mọi cơ thể, sự phân bố của chúng chỉ giới hạn ở những ñơn vị phân loại nhất ñịnh. Chúng không có chức năng chung trong trao ñổi chất của tế bào và tế bào cũng có thể tồn tại mà không cần ñến chúng. Tuy nhiên, các chất trao ñổi bậc 2 có thể có ý nghĩa với sự sinh trưởng và các cơ thể sản sinh ra chúng. Chẳng hạn một số chất trao ñổi bậc 2 có vai trò trong sự hấp thụ sắt khi thiếu nguyên tố này.
Thường các chất bậc 2 ñược tạo thành khi sự sinh trưởng ñã kết thúc. Các chủng tồn tại trong tự nhiên thường chỉ tạo thành rất ít chất trao ñổi bậc 2, những chất này ñược tích luỹ trong tế bào hoặc thải ra ngoài.Các enzym Ví dụ: enzym ngoại bào: proteaza, amylaza enzym nội bào : asparaginaza, penixilinaza. Tế bào vi sinh vật chứa khoảng 1000 enzym khác nhau. Một số enzyme chỉ có mặt với số lượng vài phân tử nhưng nhiều enzym có mặt với số lượng lớn.
Chỉ những enzym chịu trách nhiệm phân huỷ các cơ chất không hoà tan như tinh bột, xenlulo, protein…mới ñược tiết từ tế bào vào môi trường. Vi sinh vật có khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau cho sinh trưởng và thích ứng với các ñiều kiện sinh trưởng rất khác nhau. Trong sự giới hạn của thể tích tế bào chỉ tổng hợp những enzym mà nó cần. Trong công nghệ sản xuất enzym cần phải ñiều khiển trao ñổi chất sao cho enzym mà ta mong muốn ñược tổng hợp càng nhiều càng tốt.3 Các sản phẩm của sự chuyển hoá chất Ví dụ: sự oxy hoá không hoàn toàn ñể tạo thành axit axetic soboza.
Trong quá trình chuyển hoá các tế bào hoạt ñộng như những hệ thống xúc tác cho một hoặc nhiều bước chuyển hoá chất. Về mặt lí thuyết những phản ứng này cũng xảy ra nhờ các enzym cô lập, tuy nhiên con ñường này không thể thực hiện ñược hoặc không kinh tế (ví dụ với các phản ứng enzym phụ thuộc năng lượng). Các enzym chuyển hoá các chất theo cách rất ñặc hiệu. Ví dụ: sự www.com chuyển hoá hoặc tách hydro xảy ra nhờ phân tử steroid không có ý nghĩa ñối với tế bào (cũng có thể ñó là những phản ứng khử ñộc).
Trong sự chuyển hoá ñể tạo axít axetic gắn liền với sinh trưởng, nó gắn liền với sự thu nhận năng lượng.2 ðộng học của sinh trưởng và của sự tạo thành sản phẩm Sinh trưởng của một quần thể vi sinh vật diễn ra qua các giai ñoạn khác nhau. Sự sinh sản của tế bào bắt ñầu sau một giai ñoạn tiềm phát. Trong giai ñoạn log tiếp theo xảy ra sự sinh sản theo hàm số mũ. Sau một thời gian sinh trưởng ngừng lại vì thiếu chất dinh dưỡng cơ bản và vì tích luỹ các chất ức chế.
Các tế bào chuyển vào giai ñoạn cân bằng. Trong giai ñoạn này không diễn ra sinh trưởng nữa nhưng tế bào vẫn còn hoạt ñộng trao ñổi chất. Toàn bộ quá trình nuôi gắn liền với sự thay ñổi kéo dài của các ñiều kiện nuôi. Chất dinh dưỡng giảm ñi, số lượng tế bào tăng lên.
ðồng thời hoạt tính trao ñổi chất cũng thay ñổi. Về phương diện chức năng của các sản phẩm trao ñổi chất ñối với tế bào có thể phân biệt 2 nhóm: - Các sản phẩm mà sự hình thành của chúng gắn liền với sự sinh trưởng. Ví dụ: các sản phẩm lên men, các chất trao ñổi bậc 1, các enzym. Sự tổng hợp những sản phẩm này xảy ra trong thời gian sinh trưởng và còn có thể tiếp diễn sau khi sinh trưởng ñã kết thúc.
- Các sản phẩm mà sự hình thành của chúng xảy ra sau khi sinh trưởng ñã kết thúc; ví dụ các sản phẩm trao ñổi chất bậc 2. ðồng thời Thời gian Không ñồng thời Thời gian Hình 1: ðộng học của quá trình sinh trưởng và tạo thành sản phẩm Nhiều sản phẩm chiếm một vị trí trung gian. Ví dụ sự tổng hợp axít amin mặc dù diễn ra trong thời gian sinh trưởng nhưng vẫn tiếp diễn sau khi sinh trưởng ñã kết thúc, vì quá trình tổng hợp tiếp diễn trên cơ sở của một sai hỏng www.com di truyền. Sự tổng hợp của nhiều enzym xảy ra không song song với sinh trưởng mà gắn liền với một trạng thái sinh lí nhất ñịnh của tế bào cho nên trong lên men công nghiệp cần phải tìm ra trạng thái sinh lí của năng suất cao nhất và duy trì nó trong thời gian dài.3 Sự tổng hợp thừa Vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên sinh ra các sản phẩm trao ñổi chất và các thành phần tế bào chỉ ở mức ñộ cần thiết cho sự sinh sản tối ưu và cho sự duy trì loài.
Sự trao ñổi chất như vậy ñược bảo ñảm nhờ các cơ chế ñiều hoà. Ví dụ: các cơ chế này cần hoạt ñộng sao cho các axit amin không ñược tổng hợp quá nhu cầu của sự tổng hợp protein. Như vậy, trong ñiều kiện tự nhiên không có sự sản sinh dư thừa các sản phẩm trao ñổi chất bậc 1, bậc 2 và các enzym. Nếu trong tự nhiên cơ chế ñiều hoà này bị rối loạn, ví dụ do kết quả ñột biến thì các thể ñột biến sai hỏng trao ñổi chất thường có hại ñốt với chủng ban ñầu.1 Những nguyên tắc ñiều hoà trao ñổi chất Có 3 cơ chế chịu trách nhiệm ñiều hoà trao ñổi chất: 1.
ðiều hoà hoạt tính enzym nhờ sự ức chế bằng sản phẩm cuối cùng hay còn gọi là sự kìm hãm theo liên kết ngược. ðiều hoà tổng hợp enzym nhờ sự kiềm chế bằng sản phẩm cuối cùng và sự giải kiềm chế. ðiều hoà tổng hợp enzym nhờ sự kiềm chế dị hoá. Các enzym cấu trúc 1 2 3 4 Glucoza Kiềm chế dị hoá Kiềm chế bằng sản phẩm cuối cùng E.phẩm cuối cùng Ức chế bằng sản phẩm cuối cùng Sơ ñồ1: Các nguyên tắc của sự ñiều hoà enzyme * Trong cơ chế 1 sản phẩm cuối cùng của 1 quá trình sinh tổng hợp gây ra sự ức chế quá trình tổng hợp của chính nó.
Ở ñây, sản phẩm cuối cùng dù ñược hình thành trong tế bào hay ñược thu nhận từ môi trường dinh dưỡng, ñiều ñó cùng ý nghĩa. Trong cơ chế này, sản phẩm cuối cùng nói chung ảnh hưởng ñến enzyme ñầu tiên của chuỗi sinh tổng hợp. Enzym có tính quyết ñịnh này là 1 protein dị lập thể. Nó có ñặc ñiểm là thay ñổi cấu hình không gian khi www.com có mặt sản phẩm cuối cùng nhằm giảm bớt hoạt tính xúc tác.
Sự ức chế này xảy ra nhanh và rất có hiệu quả. * Trong cơ chế 2, sản phẩm cuối cùng ức chế sự tổng hợp enzym cần cho sự tạo thành sản phẩm ấy, trong ñó việc ñọc thông tin di truyền cần cho sự tổng hợp enzym (sự phiên âm) bị phong toả. Ở nồng ñộ cao của sản phẩm cuối cùng sự tổng hợp của các enzym tham gia vào chuỗi phản ứng bị ngừng hoặc bị kéo dài một cách ñáng kể. Nếu nồng ñộ của sản phẩm cuối cùng giảm xuống dưới 1 mức nào ñó thì xảy ra sự giải kiềm chế, nghĩa là các enzym ñược tạo thành với tốc ñộ cao hơn.
Sự ñiều hoà theo kiểu này xảy ra từ từ vì nó gắn liền với sự tổng hợp enzym. Hoạt ñộng Chất ảnh hưởng dị lập thể Chất ảnh hưởng dị lập thể Thể ñột biến Không hoạt ñộng Dạng hoang dại Hình 2: Mô hình của sự ức chế bằng sản phẩm cuối cùng *Sự kiềm chế dị hoá ñiều hoà quá trình tổng hợp các enzym dị hoá xúc tác sự phân huỷ cơ chất. Các enzym này ñược tổng hợp nhờ sự cảm ứng enzym.