MỞ ĐẦU Mã vạch DNA trong những năm gần đây được xem như một công cụ hữu hiệu hỗ trợ nghiên cứu phân loại học truyền thống với ưu điểm nhanh, chi phí thấp, độ chính xác cao. Việc sử dụng mã vạch DNA xác định tên loài được thực hiện thành công trên nhiều đối tượng động vật khác nhau, từ động vật bậc thấp như động vật thân mềm, côn trùng cho tới các loài động vật bậc cao như lưỡng cư, bò sát, chim và thú. Vùng gen CO1 (Cytochrome c oxidase subunit 1) trong gen ti thể có độ dài 658 bp (base pair) được các nhà khoa học công nhận là vùng gen chuẩn để nhận dạng loài trên Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống (BOLD). Bướm ngày là nhóm sinh vật nhận được nhiều sự quan tâm nhất kể từ lúc mã vạch DNA bắt đầu được nghiên cứu, và ngày càng mở rộng ở khắp nơi trên thế giới, hỗ trợ các nhà khoa học trong quá trình định danh bằng hình thái thông thường, góp phần giải quyết những vấn đề phức tạp trong mối quan hệ di truyền và tiến hóa giữa các loài với nhau.
Việt Nam là quốc gia có sự đa dạng về bướm ngày cao, với gần 1.200 loài đã được ghi nhận, trong đó có rất nhiều loài đặc hữu và quý hiếm, có ý nghĩa bảo tồn. Tuy nhiên, các dữ liệu công bố về mã vạch DNA ở Việt Nam còn rất hạn chế, cho thấy tiềm năng nghiên cứu mã vạch DNA trên bướm ở Việt Nam là rất lớn. Đặc biệt, khu hệ bướm ở Cao nguyên đá Đồng Văn, tỉnh Hà Giang có thành phần loài đa dạng và có tính đặc hữu cao ở Việt Nam, nhưng dữ liệu về mã vạch DNA thì rất ít. Chính vì thế, đề tài luận văn “Giải mã vùng gen Barcoding (Cytochrome c oxidase 1 - CO1) cho một số mẫu bướm ngày thu tại Hà Giang, Việt Nam” được thực hiện với những mục tiêu cụ thể như sau: (1) Giải trình tự vùng gen CO1 cho 20-30 mẫu vật của 10-15 loài và đăng ký thành công các trình tự nghiên cứu với GenBank.
(2) So sánh trình tự mẫu nghiên cứu với trình tự các mẫu tương tự đã công bố trên BOLD nhằm kiểm tra tính chính xác của quá trình định tên loài. (3) Phân tích sự sai khác về hình thái đối sánh với kết quả đọc trình tự của một số loài có hình thái tương đồng. 4 Nghiên cứu di truyền các loài sinh vật là hướng đi giàu tiềm năng, phù hợp với xu thế chung trên thế giới. Kết quả của luận văn không những góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu mã vạch DNA các loài sinh vật trong nước và quốc tế, mà còn là thông tin cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn nhằm hoàn thiện bức tranh đa dạng sinh học, giúp giải quyết các vấn đề liên quan đến phân loại học, sinh thái học và tiến hóa trong tương lai.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. MÃ VẠCH DNA Phân loại học đã có nhiều sự thay đổi đáng kể trong gần ba thế kỉ qua. Trước đây, các mẫu vật được thu thập và xử lý cẩn thận để bảo toàn những đặc điểm phân biệt, và đòi hỏi sự đánh giá của các chuyên gia phân loại nhằm so sánh những khác biệt về giải phẫu giữa các loài có quan hệ họ hàng gần nhau. Phương pháp phân loại truyền thống này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế, đặc biệt với mẫu không nguyên vẹn, hoặc mẫu vật có hình thái tương đồng, hoặc biến đổi hình thái (do yếu tố khí hậu, địa lý) trong cùng một loài, dẫn đến việc có rất nhiều tên đồng danh hoặc định danh sai.
Sự phát triển vượt trội của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ máy tính và công nghệ gen đã tạo ra những biến đổi lớn trong phân loại học, trong đó yếu tố di truyền đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc xác định mối quan hệ và quá trình tiến hóa giữa các loài với nhau. Nguyên lý của phương pháp mã vạch DNA là dựa trên việc so sánh các trình tự DNA ngắn giữa mẫu chưa biết với nguồn cơ sở dự liệu gen sẵn có, từ đó xác định tên loài cho mẫu nghiên cứu. Về lý thuyết và thực nghiệm, phương pháp mã vạch DNA đã được chứng minh trên nhiều đối tượng khác nhau, bao gồm virus, vi khẩn, nấm, tảo, thực vật và động vật [1, 2]. Trải qua gần ba thập kỉ, các nhà khoa học đã thu thập được một nguồn cơ sở dữ liệu trình tự nucleotide khổng lồ ở khắp nơi trên thế giới, và được lưu trữ trên Ngân hàng dữ liệu trình tự di truyền (Genetic Sequence Data Bank – GenBank) tại địa chỉ http://www.
GenBank được xây dựng và chia sẻ bởi Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information – NCBI) trực thuộc Viện Y tế Quốc gia Hoa Kỳ (National Institutes of Health – NIH). Đây là một kho dữ liệu toàn diện chứa 2,1 tỷ trình tự nucleotide có sẵn công khai cho khoảng 478.000 loài, và thường xuyên được cập nhật theo các quy tắc thống nhất với Cơ quan lưu trữ 6 Nucleotide Châu Âu (European Nucleotide Archive – ENA) và Ngân hàng Dữ liệu DNA Nhật Bản (DNA Data Bank of Japan – DDBJ), đảm bảo phạm vi phủ sóng trên toàn cầu [3]. Đồng thời, một Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống (Barcode of Life Data System – BOLD) có địa chỉ www.org cũng đã được xây dựng để quản lý, giới hạn các trình tự được chọn làm mã vạch DNA có chất lượng và độ tin cậy cao dựa vào các trình tự đã có trên GenBank [4]. Đi kèm với đó là Công cụ tìm kiếm gióng cột cục bộ cơ bản (Basic local alignment search tool – BLAST), là một phương pháp sử dụng thuật toán heuristics để truy vấn các vùng tương đồng ở bên trong các chuỗi trình tự (nucleotide hoặc protein) với nhau, nhằm xác định trình tự đang thao tác giống hoặc gần giống với trình tự nào có trong GenBank.
BLAST và trang web https://blast.cgi lần đầu tiên được giới thiệu vào khoảng năm 1990, có cập nhật sửa đổi vào năm 1997 [5, 6]. Sau đó, với sự phát triển vượt bậc của khoa học công nghệ, đặc biệt là công nghệ thông tin và công nghệ sinh học, vào cuối năm 2009, NCBI đã thay thế các bộ công cụ cũ, cung cấp phiên bản BLAST mới hơn (được gọi là BLAST+) dựa trên bộ công cụ NCBI C++ làm nền tảng phát triển trở về sau [7]. Đây là một công cụ quan trọng thiết yếu hỗ trợ các nhà khoa học có thể dễ dàng kiểm tra, đối chiếu dữ liệu nghiên cứu với các dữ liệu đã có sẵn một cách nhanh chóng và chính xác. Khái niệm mã vạch DNA được đề xuất dựa trên vùng gen Cytochrome c oxidase 1 (viết tắt là CO1) của gen ti thể (mitochondrial), có độ dài 658 bp [2].
Sau này, các kết quả nghiên cứu trên nhiều nhóm sinh vật cho thấy có những vùng gen khác cũng có thể được lựa chọn làm mã vạch DNA, bên cạnh vùng gen CO1 được sử dụng rộng rãi trên động vật, thì các vùng gen rbcL, matK, ITS, … thường được sử dụng trên thực vật, nấm và các loài sinh vật khác [1]. Do đó, chưa có đoạn gen chuẩn nào được sử dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài trên thế giới. Việc lựa chọn những đoạn gen đặc trưng để làm mã vạch và kết hợp các đoạn mã vạch DNA với nhau là rất cần thiết, giúp phân biệt các loài tốt hơn, đặc biệt là các loài quan hệ họ hàng gần gũi với nhau [1]. Do có tính bảo thủ cao, vùng gen CO1 đã đạt được nhiều thành công lớn và được lựa chọn là gen mã vạch chuẩn cho nhiều nhóm trong giới động vật, 7 điển hình như là côn trùng, cá, chim [1].
Đặc biệt, bướm ngày là một trong những nhóm sinh vật nhận được nhiều sự quan tâm nhất kể từ lúc mã vạch DNA bắt đầu được nghiên cứu đến nay. Cách tiếp cận này đã giúp giải quyết mối quan hệ phức tạp giữa các loài bướm với nhau, hỗ trợ rất nhiều trong nghiên cứu sinh thái học, tiến hóa và phân loại học với những thông tin chi tiết được trình bày trong phần nội dung tiếp theo. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU MÃ VẠCH DNA CỦA BƯỚM NGÀY 1. Nghiên cứu trên thế giới Bướm ngày (sau đây gọi tắt là bướm) là một trong những nhóm côn trùng đẹp, có màu sắc sặc sỡ và nhận được nhiều sự quan tâm tìm hiểu của các nhà khoa học từ những thế kỉ trước.
Chúng đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc nghiên cứu sự hình thành loài, sinh thái học quần xã, địa lí sinh học, biến đổi khí hậu, tương tác giữa côn trùng và thực vật, bao gồm cả loài chỉ thị và loài dịch hại [8]. Bướm thuộc bộ Lepidoptera, siêu họ Papilionoidea và có sự sắp xếp về mặt phân loại học khá phức tạp. Các nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền gần đây đã khẳng định rằng, siêu họ này với khoảng 18.800 loài được chia làm 07 họ chính là Papilionidae, Hesperiidae, Hedylidae, Pieridae, Lycaenidae, Riodinidae và Nymphalidae [8, 9, 10]. Các họ này phân bố ở khắp nơi trên thế giới, ngoại trừ họ Hedylidae phân bố chủ yếu ở khu vực Trung và Nam Mỹ, có số lượng ít nhất với 36 loài; Nymphalidae, Lycaenidae, Hesperiidae là những họ có số lượng nhiều nhất với khoảng 6.000 loài tương ứng; trong khi đó, Riodinidae, Pieridae và Papilionidae có số lượng loài không nhiều với khoảng 1.000 loài đã được mô tả [8, 9, 10].
Cùng với sự phát triển của xu hướng nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử, nghiên cứu mã vạch DNA, đặc biệt là trình tự vùng gen CO1 của nhóm bướm đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong thời gian qua. Đồng thời, một số cặp mồi cũng đã được phát triển để có thể thu nhận tốt nhất trình tự vùng gen CO1 trong nghiên cứu mã vạch ở bướm (xem Bảng 1. Một số cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu mã vạch DNA ở bướm. Stt Cặp mồi Trình tự từ 5’đến 3’ Độ dài Ghi chú (bp) 1 LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 658 Cặp mồi phổ quát [2, 11] HCO2198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 2 LepF ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG 658 LepR TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA Cặp mồi đặc hiệu cho côn trùng [12, 13] 8 3 LepF ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG 609 Enh_LepR CTCCWCCAGCAGGATCAAAA 4 LepF ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG 307 Cặp mồi đoạn ngắn dùng cho mẫu lâu năm hoặc mẫu bị hư MH-MR1 CCTGTTCCAGCTCCATTTTC hỏng.
Hai đoạn ngắn này sau đó 5 MH-MF1 GCTTTCCCACGAATAAATAATA 407 được nối lại với nhau hoàn LepR TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA chỉnh [13, 14] tRWF1 AAACTAATARCCTTCAAAG 6 700 Cặp mồi cải tiến [15, 16] LepR TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA Theo thống kê của BOLD, tính đến tháng 07 năm 2021, ước tính có khoảng 151.656 mẫu vật đã được giải trình tự với 146.
