Luận văn: Ức chế phát quang Vibrio fischeri phát hiện độc tính nước sinh hoạt

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu sự ức chế phát quang của vi khuẩn vibrio fischeri nhằm phát hiện độc tính của nước sinh, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Kiều Thị Hòa
• Người hướng dẫn: Nguyễn Văn Hoằng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Khoa học môi trường
• Đề tài: Nghiên cứu sự ức chế phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri nhằm phát hiện độc tính của nước sinh hoạt nhiễm một số kim loại nặng
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Vibrio fischeri và ứng dụng phát hiện độc tính kim loại nặng

Vibrio fischeri là một loài vi khuẩn biển có khả năng phát quang sinh học độc đáo, được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực kiểm định chất lượng nước. Khả năng phát quang của vi khuẩn này có thể bị ức chế khi tiếp xúc với các chất độc như kim loại nặng, làm cho nó trở thành công cụ sinh học lý tưởng để phát hiện ô nhiễm kim loại nặng trong nguồn nước sinh hoạt. Phương pháp này có những ưu điểm vượt trội so với các kỹ thuật hóa học truyền thống như nhanh chóng, nhạy cảm cao và chi phí thấp. Nghiên cứu về sự ức chế phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri từ các kim loại nặng như Cadmium (Cd2+) và Đồng (Cu2+) cung cấp thông tin quý báu cho công tác bảo vệ chất lượng nước.

1.1. Đặc tính sinh học của Vibrio fischeri

Vibrio fischeri là vi khuẩn gram âm, di động, hình thanh hoặc dạng cong. Chủng vi khuẩn này sở hữu hệ thống phát quang sinh học được điều khiển bởi các gen quorum sensing. Cơ chế phát quang liên quan đến sự tương tác giữa luciferin và luciferase, tạo ra ánh sáng xanh-xanh lam. Khi vi khuẩn gặp các điều kiện bất lợi hoặc chất độc, cường độ phát quang giảm đáng kể, cho phép chúng ta đánh giá mức độ độc tính của môi trường.

1.2. Cơ chế hoạt động trong phát hiện độc tính

Cơ chế hoạt động dựa trên sự ức chế khả năng phát quang khi vi khuẩn Vibrio fischeri tiếp xúc với chất độc hại. Các kim loại nặng như Cd2+ và Cu2+ tác động vào hệ enzym của vi khuẩn, làm giảm cường độ phát quang theo thang đo định lượng. Bằng cách đo lường mức độ giảm phát quang so với đối chứng, ta có thể xác định ngưỡng độc tính và nồng độ chất ô nhiễm trong nước.

II. Hiện trạng ô nhiễm kim loại nặng trong nước sinh hoạt ở Việt Nam

Tại Việt Nam, ô nhiễm kim loại nặng trong nguồn nước sinh hoạt là vấn đề đáng lo ngại, đặc biệt ở các khu vực công nghiệp và nông thôn. Nước mặt và nước ngầm đều có khả năng bị contamination bởi các kim loại độc hại như Cadmium, Đồng, Chì và Thủy ngân. Các hoạt động khai thác mỏ, sản xuất công nghiệp và nông nghiệp sử dụng phân bón chứa kim loại nặng đều góp phần tăng tồn lượng kim loại nặng trong nước. Việc sử dụng phương pháp phát hiện độc tính bằng Vibrio fischeri giúp cơ quan quản lý nước tăng cường kiểm soát chất lượng nước và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

2.1. Ô nhiễm kim loại nặng trong nước mặt

Nước mặt ở Việt Nam bị ô nhiễm từ các nguồn công nghiệp xả thải trực tiếp và nông thôn sử dụng phân bón chứa kim loại nặng. Cadmium và Đồng là hai loại kim loại phổ biến gây ô nhiễm. Mức độ độc tính thường cao hơn nước ngầm và tác động trực tiếp đến sức khỏe của người dân sử dụng nước này cho sinh hoạt hàng ngày.

2.2. Ô nhiễm kim loại nặng trong nước ngầm

Nước ngầm bị contamination chủ yếu từ quá trình thấm lọc của kim loại nặng từ tầng đất bề mặt. Mặc dù quá trình tự lọc tự nhiên giảm nồng độ nhưng vẫn còn nguy hiểm, đặc biệt ở các khu vực có lịch sử khai thác mỏ. Phương pháp kiểm định bằng Vibrio fischeri giúp phát hiện độc tính sớm trước khi nước được cung cấp cho cộng đồng.

III. Phương pháp phát hiện ô nhiễm kim loại nặng sử dụng Vibrio fischeri

Phương pháp phát hiện độc tính bằng Vibrio fischeri là một kỹ thuật sinh học hiện đại có nhiều ưu điểm so với phương pháp hóa học truyền thống. Trong khi phương pháp hóa học như AAS hay ICP-MS đòi hỏi thiết bị đắt tiền và phức tạp, phương pháp Vibrio fischeri nhanh chóng, nhạy cảm và rẻ tiền hơn. Sự ức chế phát quang của vi khuẩn khi tiếp xúc với chất độc hại được đo lường bằng photometer, cho phép xác định EC50 và EC90 - những chỉ số quan trọng đánh giá độc tính kim loại nặng. Phương pháp này đặc biệt hiệu quả trong việc phát hiện độc tính tổng thể của mẫu nước, bất kể nó chứa loại kim loại nào.

3.1. Phương pháp hóa học truyền thống

Phương pháp AAS (Atomic Absorption Spectrometry) và ICP-MS là các kỹ thuật hóa học xác định chính xác nồng độ kim loại nặng. Tuy nhiên, những phương pháp này chỉ cho biết nồng độ mà không phản ánh độc tính sinh học thực tế đối với con người. Chi phí cao và yêu cầu kỹ thuật viên giàu kinh nghiệm là những nhược điểm của phương pháp này.

3.2. Phương pháp sinh học sử dụng Vibrio fischeri

Phương pháp sinh học này dựa trên sự ức chế phát quang và được coi là phương pháp đánh giá độc tính toàn diện hơn. Nó phản ánh tác động thực tế của kim loại nặng đến các tế bào sống. Phương pháp được áp dụng để xác định EC10, EC50, EC90 giúp đánh giá mức độ độc tính một cách khoa học và tin cậy cho công tác bảo vệ chất lượng nước.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn phát hiện Cadmium và Đồng

Các nghiên cứu về sự ức chế phát quang của Vibrio fischeri cho thấy Cadmium (Cd2+) và Đồng (Cu2+) có độc tính khác nhau đối với vi khuẩn này. Thông qua việc đo lường cường độ phát quang ở các nồng độ kim loại khác nhau, các nhà nghiên cứu xác định được ngưỡng độc tính và EC50 cho từng loại kim loại. Cadmium thường được coi là độc tính hơn Đồng dựa trên giá trị EC50 thấp hơn. Ngoài ra, nghiên cứu về hỗn hợp Cu2+ và Cd2+ cho thấy có hiệu ứng tương tác giữa các kim loại, tăng thêm độc tính tổng thể. Những kết quả này cung cấp dữ liệu quan trọng cho việc đề ra tiêu chuẩn chất lượng nước và chiến lược quản lý ô nhiễm.

4.1. Ảnh hưởng của Cadmium đến cường độ phát quang

Khi nồng độ Cd2+ tăng, cường độ phát quang của Vibrio fischeri giảm theo hàm lôgarit. Thông qua phân tích dữ liệu, EC50 của Cadmium được xác định, chỉ ra rằng mức độ ức chế phát quang 50% xảy ra ở nồng độ nhất định. Kết quả này cho phép đánh giá độc tính Cadmium nhanh chóng và chính xác trong mẫu nước.

4.2. Ảnh hưởng của Đồng và hỗn hợp kim loại đến độc tính

Cu2+ gây ức chế phát quang ở mức độ khác Cd2+, với EC50 cao hơn. Khi kết hợp Cu2+ và Cd2+ lại với nhau, độc tính tổng hợp vượt quá tổng độc tính riêng lẻ của mỗi kim loại. Hiện tượng này chứng minh tầm quan trọng của việc phát hiện độc tính hỗn hợp trong nước thực tế, nơi thường có sự tồn tại đồng thời của nhiều kim loại nặng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hiện nay ở nƣớc ta, hiện trạng ô nhiễm kim loại nặng trong nƣớc sinh hoạt ngày một phổ biến và diễn biến theo chiều hƣớng phức tạp. Hiện trạng này đƣợc phản ánh thông qua hàm lƣợng các kim loại nặng nhƣ đồng, chì, cadimi, asen,… trong nƣớc của các sông, suối, ao, hồ,… nơi cấp nƣớc dùng cho sinh hoạt cao hơn tiêu chuẩn cho phép nhiều lần. Bên cạnh đó, ô nhiễm kim loại nặng trong nƣớc sinh hoạt gây hại cho sinh vật và ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sức khỏe con ngƣời. Tính đến nay, có hai nhóm phƣơng pháp cơ bản phát hiện độc chất kim loại, đó là phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp hiện đại.

Phƣơng pháp truyền thống đã sử dụng cá, bo bo (McFetters, 1983; Wang, 1991), tảo, Daphnia magna,… để xác định độc tính đơn kim loại. Phƣơng pháp này đơn giản, dễ thực hiện và không tốn kém. Tuy nhiên kết quả thu đƣợc từ phƣơng pháp chƣa định tính, định lƣợng từng kim loại cụ thể. Bên cạnh đó, các phƣơng pháp hiện đại nhƣ quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), khối phổ plasma cảm ứng (ICP - MS),.

đã phân tích chính xác đƣợc từng kim loại cụ thể với độ nhạy cao nhƣng đòi hỏi máy móc, trang thiết bị hiện đại và chƣa áp dụng ngoài điều kiện phòng thí nghiệm. Để khắc phục đƣợc hạn chế đó, trên thế giới đã sử dụng vi khuẩn Vibrio fischeri dƣới dạng test, kit (để đánh giá độc tính của nƣớc) ở ngoài phòng thí nghiệm (nhờ vào khả năng phát quang của vi khuẩn). Trên thế giới, các nhà khoa học Mỹ đã chế tạo thành công bộ thuốc thử Microtox, có thành phần chính là Vibrio fischeri dạng đông khô. Tuy nhiên, bộ thuốc thử cần đƣợc bảo quản ở nhiệt độ thấp (-15 oC đến -25oC), vì thế ở ngoài hiện trƣờng, việc bảo quản gặp nhiều khó khăn.

Ở Việt Nam, việc sử dụng vi khuẩn đƣợc tiêu chuẩn hóa trong TCVN 6831:2010 và đƣợc đề cập trong nhiều nghiên cứu. Trong đó, Đỗ Thị Lan Chi năm 2006, đã xác định đƣợc độc tính đơn kim loại nặng trong bùn thải công nghiệp bằng bộ thuốc thử Microtox. Tuy nhiên, ở nƣớc ta hiện nay các nghiên cứu đánh giá độc tính trong nƣớc qua bộ thuốc thử chỉ áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm (bằng thiết bị đọc ánh sáng Microtox Model 500 1 Analyzer), chƣa đánh giá đƣợc độc tính của hỗn hợp kim loại và không chủ động trong nguồn thuốc thử khá đắt đỏ đó. Đồng thời, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Vibrio fischeri thƣờng có trong nƣớc biển và nƣớc đầm tôm.

Vì vậy, việc chủ động tạo nguồn vi khuẩn từ trong tự nhiên để phát hiện nhanh kim loại nặng trong nƣớc sinh hoạt là điều cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn. Do đó tên đề tài luận văn đƣợc lựa chọn là: “Nghiên cứu sự ức chế phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri nhằm phát hiện độc tính của nước sinh hoạt nhiễm một số kim loại nặng”. Mục tiêu của đề tài: - Đánh giá chất lƣợng nƣớc sinh hoạt ở một số đơn vị quân đội - Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của vi khuẩn Vibrio fischeri - Đánh giá ảnh hƣởng của một số kim loại nặng hòa tan trong nƣớc đến sự phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri làm cơ sở để chế tạo kit phát hiện nhanh độc tính của nƣớc sinh hoạt bị ô nhiễm kim loại nặng Đối tượng nghiên cứu: vi khuẩn phát quang Vibrio fischeri, nƣớc cấp sinh hoạt tại một số đơn vị quân đội và mẫu nƣớc chứa Cd2+, Cu2+ tự tạo. Phạm vi nghiên cứu: xác định các điều kiện phân lập và nuôi cấy để tạo nguồn vi khuẩn Vibrio fischeri; đánh giá sự ức chế phát quang vi khuẩn Vibrio fischeri trong nguồn nƣớc chứa Cd2+, Cu2+ tự tạo trong phòng thí nghiệm.

Nội dung nghiên cứu: - Khảo sát mẫu nƣớc dùng trong sinh hoạt ở một số đơn vị quân đội - Phân lập, xác định các đặc điểm sinh học của Vibrio fischeri từ đầm nuôi tôm - Xác định các điều kiện nuôi cấy, tạo nguồn vi khuẩn Vibrio fischeri dùng cho nghiên cứu - Xác định ảnh hƣởng của một số kim loại nặng tới khả năng phát quang của Vibrio fischeri Địa điểm nghiên cứu Phòng Công nghệ Hóa sinh - Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học và Công nghệ quân sự. 2 Đóng góp mới của đề tài Phân lập và tạo thành công nguồn vi khuẩn Vibrio fischeri từ nƣớc đầm tôm. Đồng thời, xác định đƣợc ảnh hƣởng của Cd2+ và Cu2+ đến khả năng phát quang của Vibrio fischeri. Ứng dụng thực tiễn của đề tài Các kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở giúp chế tạo kit phát hiện nhanh độc tính của nƣớc sinh hoạt.

Trong đó, kit phát hiện sử dụng một kim loại là chất chuẩn có ngƣỡng độc tính ổn định ở mức trung bình và đƣợc nghiên cứu phổ biến. Nồng độ gây suy giảm 50% khả năng phát quang của vi khuẩn (hay giá trị EC50) của chất chuẩn đƣợc sử dụng làm giá trị tiêu chuẩn để đánh giá độc tính với các mẫu nƣớc sinh hoạt. 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về ô nhiễm kim loại nặng nguồn nƣớc sinh hoạt ở Việt Nam 1.

Các khái niệm liên quan Kim loại nặng là những kim loại có khối lƣợng riêng lớn hơn 5g/cm 3 [2]. Một số kim loại nặng (nhƣ sắt, selen, molypden, đồng, mangan, coban, bo, stronti,… [34]) ở hàm lƣợng nhất định là nguyên tố vi lƣợng cần thiết cho cơ thể sống. Tuy nhiên, khi hàm lƣợng vƣợt quá giới hạn cho phép thì chúng sẽ gây độc cho sinh vật. Nƣớc sinh hoạt là nƣớc sử dụng cho mục đích sinh hoạt thông thƣờng không sử dụng để ăn uống trực tiếp hoặc chế biến thực phẩm tại các cơ sở chế biến (theo QCVN 02:2009/BYT về chất lƣợng nƣớc sinh hoạt).

Ô nhiễm môi trƣờng nƣớc là sự thay đổi tính chất vật lý, hóa học và sinh học của nƣớc, gây ra các tác động bất lợi cho sự tồn tại và phát triển của con ngƣời cũng nhƣ các sinh vật khác [18]. Kim loại nặng và ảnh hưởng của chúng đến con người 1. Cadimi (Cd) Cadimi thuộc nhóm IIB trong bảng tuần hoàn và nguyên tố này là một trong những kim loại quí hiếm. Trong vỏ Trái đất cadimi phân bố rải rác ƣớc tính đƣợc hàm lƣợng trung bình là 0,11mg/kg [2].

Ngoài ra, cadimi còn phân bố trong cặn lắng nƣớc sông, nƣớc biển và trong không khí [2]. Trong môi trƣờng khác nhau, cadimi tồn tại ở các dạng hợp chất khác nhau. Thông thƣờng trong môi trƣờng ôxi hóa, cadimi tồn tại dƣới dạng các hợp chất nhƣCdO, CdCO3, Cd3(PO4)2. Trong môi trƣờng khử, cadimi tồn tại chủ yếu dƣới dạng hợp chất CdS [10].

Tuy nhiên, trong môi trƣờng kiềm, chúng dễ dàng bị thuỷ phân. Cadimi phát thải vào môi trƣờng có nguồn gốc tự nhiên và nguồn gốc nhân tạo. Các hoạt động có nguồn gốc tự nhiên bao gồm hoạt động núi lửa (hàng năm phát thải trung bình 0,5x103 tấn [2]), hoạt động tạo bụi biển (hàng năm phát thải trung bình 0,1x103 tấn [2]), hoạt động xói mòn (hàng năm phát thải trung bình 4 15x103 tấn [32]). Các hoạt động có nguồn gốc nhân tạo bao gồm: khai thác và chế biến quặng, đốt nhiên liệu hóa thạch và xử lí chất thải.

Các hoạt động này tập trung ở các khu đô thị và khu công nghiệp [32]. Tổ chức ung thƣ thế giới (IARC) đã xếp cadimi và hợp chất của nó vào nhóm 2A (có khả năng gây ung thƣ cho ngƣời) [10]. Tuỳ vào mức độ phơi nhiễm, ngƣời nhiễm độc cadimi có thể bị thủng vách ngăn mũi, bị tổn thƣơng thận dẫn đến protein niệu, bị ảnh hƣởng tới máu, tim mạch, nội tiết,. và có nguy cơ bị ung thƣ phổi [25].

Đặc biệt, khi phơi nhiễm cadimi trong thời gian dài, con ngƣời có thể bị bệnh itai - itai (gây những cơn đau đớn vô cùng trong xƣơng sống và thận). Theo nghiên cứu của Dokmecia và cộng sự năm 2009 [25] chứng minh bệnh lý này là do hiện tƣợng mất khoáng chất cao, gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới hệ xƣơng.1 minh họa cho bệnh itai - itai bắt nguồn từ thƣợng lƣu sông Jinzu tại Nhật Bản.1: Bệnh itai - itai và cấu trúc xương [25] Cadimi (Cd) thâm nhập vào cơ thể bằng nhiều con đƣờng khác nhau (qua tiếp xúc, tiêu hóa,…). Chúng đƣợc bài tiết một phần nhờ thận và phần còn lại cũng đƣợc tích lũy tại đây trong thời gian dài (thời gian bán huỷ kéo dài 20 - 30 năm [10]). Tổ chức y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo lƣợng cadimi tối đa đƣa vào cơ thể hàng tuần có thể chịu đựng đƣợc là 0,007 mg/kg trọng lƣợng.

Đồng (Cu) Đồng là kim loại màu chuyển tiếp có số hiệu nguyên tử 29, nguyên tử khối 63,54. Trong thạch quyển, đồng tồn tại ở hai dạng đơn chất (đồng kim loại) và hợp chất (quặng pirit đồng (CuFeS2), quặng malachit [CuCO3. 5 Hiện nay, đồng phát thải vào môi trƣờng chủ yếu qua các hoạt động của con ngƣời. Môi trƣờng không khí tiếp nhận đồng dƣới dạng bụi hạt từ các hoạt động sản xuất công nghiệp và nông nghiệp nhƣ: khai thác và chế biến quặng, tái chế và sản xuất mĩ nghệ, sản xuất và sử dụng thuốc bảo vệ thực vật,… Môi trƣờng nƣớc tiếp nhận đồng từ các hoạt động sản xuất nông nghiệp, công nghiệp và đời sống sinh hoạt của con ngƣời.

Môi trƣờng nƣớc tại các vùng cửa sông đƣợc tích tụ bởi lƣợng lớn đồng sunfat (có khi lên đến 50 - 100 µg/l) bắt nguồn từ các chế phẩm diệt tảo mà con ngƣời sử dụng. Thông thƣờng, hàm lƣợng đồng trong nƣớc cấp sinh hoạt không vƣợt quá 1,3 mg/l [20]. Tuy nhiên, do thói quen sử dụng vật dụng chứa nƣớc có mối hàn đồng, đã làm gia tăng hàm lƣợng đồng trong nƣớc. Môi trƣờng đất tiếp nhận đồng thông qua quá trình lắng đọng, trầm tích đồng trong không khí và trong nƣớc.

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, đồng là nguyên tố vi lƣợng cần cho sự tồn tại và phát triển của sinh vật [39]. Chúng là thành phần thiết yếu tham gia cấu trúc lên một số enzyme. Vì vậy, đối với ngƣời có khẩu phần ăn thiếu nguyên tố vi lƣợng này thì sức đề kháng thấp hơn mức trung bình, thậm chí còn có thể bị thiếu máu. Tuy nhiên, nếu hàm lƣợng đồng vƣợt ngƣỡng cho phép, nó có thể trở thành chất độc, ảnh hƣởng không tốt tới hệ tiêu hóa và hệ thần kinh.

Trong nghiên cứu của Raffaele và cộng sự năm 2016 [44] đã xét nghiệm nồng độ đồng trong gan, nhận thấy nồng độ này vƣợt quá 250 µg/g (trọng lƣợng gan) sẽ gây ra bệnh Wilson ở ngƣời. Đây là căn bệnh liên quan đến rối loạn trao đổi chất đồng. Thông thƣờng, những ngƣời mắc bệnh này sẽ bị tổn thƣơng gan và rối loạn chức năng hệ thần kinh.