Khảo sát đột biến gen LDLR ở bệnh nhân tăng cholesterol máu tại Việt Nam

Nghiên cứu đột biến gen LDLR, nguyên nhân chính gây tăng cholesterol máu di truyền. Khảo sát và phân tích các biến thể gen trên bệnh nhân tại Việt Nam.

• Tác giả: Mai Kim Bảo Châu
• Người hướng dẫn: ThS. Trương Kim Phượng
• Trường học: Đại học Mở TP Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Y Dược
• Đề tài: Khảo sát tính chất đột biến điểm trên gen LDLR đối với một số mẫu bệnh phẩm máu của bệnh nhân tăng cholesterol máu ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Đột biến gen LDLR và vai trò trong tăng cholesterol máu

Đột biến gen LDLR là nguyên nhân chính dẫn đến tăng cholesterol máu di truyền, đặc biệt là bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH - Familial Hypercholesterolemia). Gen LDLR nằm trên nhiễm sắc thể số 19, mã hóa protein thụ thể LDL (Low Density Lipoprotein Receptor) - có chức năng loại bỏ LDL cholesterol khỏi máu. Khi gen này bị đột biến, thụ thể LDL không hoạt động bình thường, dẫn đến sự tích tụ cholesterol xấu (LDL-C) trong huyết thanh, gây ra bệnh tim mạch sớm. Nghiên cứu cho thấy khoảng 70-80% bệnh nhân FH có đột biến điểm trên gen LDLR, làm tăng nguy cơ xơ vữa động mạch và bệnh tim mạch.

1.1. Cấu trúc gen LDLR và chức năng sinh học

Gen LDLR gồm 18 exon, mã hóa thụ thể LDL với 839 amino acid. Protein này có vai trò quan trọng trong điều hòa cholesterol máu bằng cách liên kết với LDL particles và vận chuyển chúng vào tế bào. Khi thụ thể LDL bị khiếm khuyết, quá trình này bị ảnh hưởng, làm tăng nồng độ LDL cholesterol lên 2-10 lần so với bình thường, tùy thuộc vào mức độ đột biến.

1.2. Tần suất và loại đột biến trên gen LDLR

Đột biến điểm (point mutation) là loại phổ biến nhất trên gen LDLR, chiếm khoảng 60-70% các trường hợp FH. Ngoài ra còn có insertion/deletion (indels), đột biến splice site và các rearrangement. Các đột biến khác nhau tùy theo quần thể dân cư, với hơn 3000 biến thể LDLR được ghi nhận trên toàn thế giới, trong đó Việt Nam có các đột biến riêng biệt cần được xác định và khảo sát.

II. Bệnh tăng cholesterol máu di truyền Familial Hypercholesterolemia

Bệnh tăng cholesterol máu gia đình (FH) là một trong những rối loạn di truyền thường gặp nhất, ảnh hưởng đến 1 trong 250-500 người trên thế giới. Bệnh được phân loại thành hai dạng chính: FH dị hợp tử (HeFH) và FH đồng hợp tử (HoFH). Bệnh FH đặc trưng bởi cholesterol máu cao từ sơ sinh, đặc biệt là LDL-C cao, nhưng HDL cholesterol và triglyceride bình thường. Bệnh nhân FH có nguy cơ bệnh tim mạch sớm - nam giới có thể gặp nhồi máu cơ tim từ tuổi 30-40, nữ giới từ 40-50. Các tiêu chí chẩn đoán DLCN được sử dụng để xác định bệnh FH dựa trên lịch sử gia đình, nồng độ lipid và biểu hiện lâm sàng.

2.1. Phân loại FH dị hợp tử và đồng hợp tử

FH dị hợp tử (HeFH) xảy ra khi một bản sao gen LDLR bị đột biến, gây ra LDL-C cao 2-3 lần, ảnh hưởng 1/250-500 người. FH đồng hợp tử (HoFH) hiếm gặp hơn (1/160.000-1.000.000), cả hai bản sao gen LDLR đều bị đột biến, gây LDL-C cao 6-10 lần, có nguy cơ xơ vữa động mạch cực kỳ cao ngay từ tuổi trẻ.

2.2. Các tiêu chí chẩn đoán và biểu hiện lâm sàng

Tiêu chí DLCN (Dutch Lipid Clinic Network) đánh giá: lịch sử gia đình, nồng độ LDL-C, xantoma, xanthelasma, và bệnh tim mạch sớm. Bệnh nhân FH thường có arcus cornealis, xantoma gân Achilles, và nguy cơ cao bệnh tim mạch. Chẩn đoán xác định cần phải xác định đột biến gen LDLR bằng giải trình tự DNA để khởi động điều trị sớm.

III. Phương pháp phát hiện đột biến gen LDLR

Để phát hiện đột biến gen LDLR, các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp phân tích hiện đại. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được dùng để khuếch đại các exon của gen LDLR, sau đó các sản phẩm được giải trình tự DNA để xác định chính xác vị trí và loại đột biến. Phương pháp Next Generation Sequencing (NGS) cho phép phân tích toàn bộ gen nhanh chóng và hiệu quả. High Resolution Melt (HRM) là kỹ thuật nhanh để phát hiện các biến thể nhỏ. Ngoài ra, phân tích tổng hợp (meta-analysis) của các công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ hơn về tần suất và tính chất đột biến trên các quần thể khác nhau, đặc biệt là quần thể Việt Nam.

3.1. Công nghệ PCR và giải trình tự DNA

Phương pháp PCR sử dụng các bộ mồi đặc hiệu để khuếch đại exon gen LDLR. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự bằng DNA sequencing. Kết quả được so sánh với trình tự tham chiếu (reference sequence) để xác định các biến thể hoặc đột biến. Phương pháp này có độ chính xác cao và chi phí hợp lý, thích hợp cho khảo sát lâm sàng.

3.2. Next Generation Sequencing NGS và phân tích bioinformatics

NGS cho phép xác định toàn bộ trình tự gen LDLR trong một lần phân tích, phát hiện cả đột biến dị lạ và rare mutations. Các công cụ bioinformatics như CodonCode Aligner, Blastn được sử dụng để sắp gióng trình tự, phân tích biến thể, và dự đoán ảnh hưởng chức năng của đột biến trên protein. Phương pháp này độ nhạy cao nhưng chi phí lớn, phù hợp cho nghiên cứu lớn quy mô.

IV. Ý nghĩa lâm sàng và hướng điều trị

Việc xác định đột biến gen LDLR có ý nghĩa lâm sàng rất quan trọng trong việc chẩn đoán sớm và điều trị bệnh FH. Bệnh nhân được xác định có đột biến LDLR cần được giám sát chặt chẽ lâm sàng và sinh hóa, bắt đầu điều trị lipid-lowering sớm. Statin là thuốc tuyến đầu giúp giảm LDL-C, kết hợp với thay đổi lối sống, chế độ ăn uống. Đối với bệnh nhân HoFH không đáp ứng với statin, có thể sử dụng inhibitor PCSK9 hoặc apheresis lipid. Tư vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân cũng rất cần thiết, vì bạn thân và con em bệnh nhân có nguy cơ cao mang đột biến này. Sàng lọc di truyền trên gia đình giúp phát hiện sớm và can thiệp kịp thời, giảm nguy cơ bệnh tim mạch.

4.1. Chiến lược điều trị dựa trên đột biến LDLR

Bệnh nhân HeFH có đột biến LDLR được khuyến cáo dùng statin liều cao từ sớm, thường từ tuổi 20-30, kết hợp ezetimibe để tăng hiệu quả giảm LDL-C. Bệnh nhân HoFH cần liệu pháp kết hợp, bao gồm statin, inhibitor PCSK9, bile acid sequestrant, hoặc LDL apheresis để loại bỏ LDL cholesterol từ máu. Giám sát định kỳ LDL-C và xác định mục tiêu điều trị cá nhân hóa theo tính chất đột biến giúp tối ưu hóa kết quả điều trị.

4.2. Tư vấn di truyền và sàng lọc gia đình

Khi phát hiện đột biến LDLR ở bệnh nhân, cần tư vấn di truyền toàn diện cho gia đình. Cha mẹ, anh chị em, con em có nguy cơ 50% mang đột biến nếu bệnh nhân là HeFH. Sàng lọc di truyền trên gia đình bằng kiểm tra cholesterol và xác định đột biến gen giúp phát hiện sớm, can thiệp điều trị kịp thời, và giảm tỷ lệ bệnh tim mạch trong gia đình. Tư vấn lối sống lành mạnh cũng rất quan trọng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ chức Y tế thế giới (Word Health Organization-WHO, 2015), bệnh tim mạch (Cardiovascular diseases-CVD) là bệnh lý gây tử vong cao nhất trên toàn cầu. Năm 2015, ước tính có 17,7 triệu người chết vì bệnh tim mạch, chiếm 31% tổng số ca tử vong toàn cầu. Trong đó có khoảng 7,4 triệu người chết do mắc bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease-CHD). Đáng chú ý là nồng độ cholesterol trong máu tăng cao có liên quan chặt chẽ với bệnh tim mạch, cụ thể hơn là quá trình xơ vữa động mạch (Neil et al.

Bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia -FH) là dạng rối loạn lipid/cholesterol trong máu, do tính chất đột biến xảy ra trên một số gen mã hóa protein quan trọng trong cơ chế chuyển hóa cholesterol máu, điển hình là gen LDLR, APOB, PCSK9 (Taranto et al. Bệnh lý cao cholesterol máu và cụ thể bệnh lý FH là nguyên nhân gây ra bệnh tim mạch (CVD, CHD) (Genest et al. Công bố khoa học của Scriver và cộng sự (2002), Shu và cộng sự (2017) xác định tính chất đột biến xuất hiện trải dài trên gen LDLR là nguyên nhân chính dẫn đến bệnh lý FH. Hơn nữa, nhiều công trình nghiên cứu xác định các dạng đột biến xuất hiện trên gen Low-Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (APOB) làm mất chức năng thụ thể LDL (LDLR) dẫn đến nồng độ cholesterol LDL (LDL-C) trong máu tăng (Pereira et al., 2012; Varre et al., 2008 và Durst et al.

Gen LDLR (Low-density lipoprotein receptor) định vị trên nhiễm sắc thể số 19 (19p13.2 ), có kích thước 44.469 bp, gồm 18 exon (NCBI). Gen LDLR (Low Density Lipoprotein Recepter) mã hóa một dạng glycoprotein, đây là một loại protein xuyên màng trên bề mặt tế bào có chức năng hấp thụ cholesterol cung cấp cho tế bào (Hobbs et al., 1992 và Leigh et al. LDLR là thụ thể gắn với các phối tử mạng cholesterol (Lipoprotein mật độ thấp) nhập bào vào tế bào gan (Brown et al. Kế thừa và mong muốn hoàn thiện hướng nghiên cứu phâp tích đặc điểm phân tử trên các gen có vai trò trong sự chuyển hóa cholesterol trong máu, chúng tôi xin 1 phép được thực hiện chuyên đề Khóa luận tốt nghiệp: “KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN LDLR ĐỐI VỚI MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM MÁU CỦA BỆNH NHÂN TĂNG CHOLESTEROL MÁU Ở VIỆT NAM”.

Mục tiêu: Khảo sát tính chất đột biến điểm xuất hiện trên gen LDLR trên bệnh nhân tăng cholesterol máu, dựa vào phương pháp sinh học phân tử phù hợp: kỹ thuật PCR kết hợp giải tình tự. Nội dung nghiên cứu: 1. Khai thác dữ liệu khoa học trên nguồn dữ liệu trực tuyến: PubMeb, PubMeb central (PMC) thuộc NCBI, EMBL, Google, Google Scholar,… với một số từ khóa: LDLR, Familial Hypercholesterolemia (FH),. Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) khai thác chọn lọc các dữ liệu để xây dựng bộ dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp với công cụ Medcalc® phiên bản 18.1 nhằm khảo sát sự tương quan giữa tính chất xuất hiện một số dạng đột biến điểm trên gen LDLR đối với bệnh cao cholesterol máu có tính chất gia đình và một số bệnh lý tim mạch trên thế giới, chủ yếu dựa vào chỉ số “Proportion” (viết tắt là PR%) với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals - CIs).

Khảo sát thực nghiệm, ứng dụng phương pháp PCR-giải trình tự để khảo sát tính chất xuất hiện đột biến điểm trên gen LDLR máu đối với một số mẫu bệnh phẩm máu của người Việt Nam. Đồng thời, dự kiến cập nhật kết quả khảo sát trên máy tính về các bộ mồi để thiết lập/điều chỉnh quy trình PCR- giải trình tự phù hợp với mục tiêu và nội dung nghiên cứu nêu trên. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I. Cholesterol và Lipoprotein Cholesterol là chất béo hiện diện trong hệ mạch máu, các bào quan và hệ dẫn truyền thần kinh thần kinh trong cơ thể người (Lawes et al.

Sự thay đổi lượng cholesterol trong máu liên quan đến sự không cân bằng dinh dưỡng hoặc rối loạn yếu tố di truyền.(Lawes et al. Lượng (nồng độ) cholesterol trong máu được biểu thị bởi đơn vị System Internationale (SI), là đơn vị đo lượng cholesterol (millimol, mmol) trên một đơn vị máu (lit, l): mg/dl hoặc mg/L. Thông thường, việc xác định nồng độ cholesterol trong máu liên quan đến bệnh lý rối loạn mỡ máu và bệnh (FH) thường dựa vào chỉ số lượng (nồng độ) cholesterol toàn phần, HDL cholesterol, LDL cholesterol và VLDL cholesterol (Lawes et al. Trong các nghiên cứu về bệnh FH ở Hoa Kỳ và Nhật Bản, chỉ số SI được xác định bởi đơn vị mg/dl, hệ số quy đổi như sau: 1 (mg/dl) = 0.02586 (mmol/l) (Lawes et al.

Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH- Familial hypercholesterolaemia) FH (Familial hypercholesterolaemia) là bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình, thuộc dạng bệnh lý rối loạn di truyền liên quan đến sự rối loạn chuyển hóa lipid trong máu. Bệnh FH đặc trưng bởi sự gia tăng nồng độ lipoprotein mật độ thấp kết hợp cholesterol (LDL-C, Low-density lipoprotein cholesterol) dẫn đến lắng đọng cholesterol trong mô và cơ quan, dẫn đến nguy cơ mắc bệnh xơ vữa động mạch và các bệnh tim mạch khác (CVDs-cardiovascular diseases) (Brown&Goldstein, 1986; Varghese et al., 2014; Migliara et al.,2017 và Robinson et al. Việc chẩn đoán bệnh FH có thể giúp chẩn đoán và điều trị bệnh kịp thời nhằm làm giảm nguy cơ mắc các bệnh lý tim mạch và đột quỵ. Thông thường việc chẩn đoán bệnh FH chủ yếu dựa vào chẩn đoán lâm sàng: xét nghiệm chỉ số sinh hóa máu (lượng/nồng độ cholesterol: HDL-C, LDL-C, cholesterol toàn phần,.) trong máu 3 kết hợp phân tích tiền sử gia đình và có thể được hỗ trợ bằng xét nghiệm di truyền (Migliara et al.

Bệnh FH được ghi nhận khi giá trị LDL-C thường cao hơn 190 mg/dL ở người trưởng thành và 160 mg/dL ở trẻ em (Hopkins et al. Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH) ở thể đồng hợp (Homozygous Familial Hypercholesterolemia, HoFH) và thể dị hợp (Heterozygous Familial Hypercholesterolemia, HeFH). Trong đó, tần suất mắc bệnh FH đồng hợp thuộc dạng hiếm gặp, xấp xỉ 1/1.000 trường hợp. Tần suất mắc bệnh FH dị hợp dao động khoảng 1/200–1/500 trường hợp (Austin et al., 2004; Nordestgaard et al., 2013; Al-Hinai et al.

Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH) là 1 trong 300 căn bệnh rối loạn di truyền phổ biến tại Hoa Kỳ, đồng thời người có tiền sử gia đình mắc bệnh cao cholesterol và bệnh tim mạch có khả năng mắc bệnh FH cao hơn so với những trường hợp khác (Hopkins et al. Công trình nghiên cứu khoa học của Hopkins và cộng sự (2011) ghi nhận cần phải phân tích, kiểm tra các chỉ số về nồng độ cholesterol trong máu sớm ở đối tượng trẻ em ngay từ lúc 2 tuổi hoặc trước 20 tuổi nhằm làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và bệnh động mạch vành. Nguyên nhân dẫn đến bệnh lý FH thường là do tính chất đột biến xảy ra chủ yếu trên một số gen mã hóa protein quan trọng trong cơ chế chuyển hóa cholesterol máu, điển hình là gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), ApoB (Apolipoprotein B), PCSK9 (proprotein convertase subtilisin / kexin loại 9) (Hartgers et al. Trong đó, yếu tố chính gây ra bệnh lý FH là do các đột biến trên gen LDLR (Bruikman et al., 2017; Reeskamp et al.

Tiêu chí chuẩn đoán bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình Theo Tổ Chức Y Tế Thế Giới (World Health Organization,WHO), bệnh lý FH được xác định theo tiêu chí nồng độ cholesterol ở người trưởng thành ≥ 5,0 mmol/l. Bên cạnh đó, các bộ tiêu chí được sử dụng để chẩn đoán bệnh nhân mắc bệnh FH thường được sử dụng của tổ chức DLCN (Dutch Lipid Clinic Network), Simon Broome và 4 MEDPED của Hoa Kỳ (US Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths) (Al-Hinai et al.1 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức DLCN Tiêu chí Điểm Nhóm 1: Tiểu Thế hệ thứ nhất có người mắc bệnh tim mạch sớm 1 sử gia đình (<55 tuổi ở nam, <69 tuổi ở nữ) Thế hệ thứ nhất có nồng độ cholesterol LDL trong máu 1 cao hơn 95% theo độ tuổi và giới tính Thế hệ thứ nhất có xuất hiện xanthoma trong gân và/hoặc 2 cung giác mạc Trẻ em < 18 tuổi có nồng độ cholesterol LDL trong máu 2 cao hơn 95% theo độ tuổi và giới tính Nhóm 2: Tiền Bệnh nhân mắc bệnh tim mạch vành sớm 2 sử lâm sàng (<55 tuổi ở nam và <60 tuổi ở nữ) Bệnh nhân mắc bệnh mạch máu não và ngoại vi sớm 1 (<55 tuổi ở nam và <60 tuổi ở nữ) Nhóm 3: Kiểm Xuất hiện xanthoma trong gân 6 tra thể chất Xuất hiện xanthoma trong cung giác mạc ở người dưới 4 45 tuổi Nhóm 4: Các Nồng độ cholesterol LDL* kết quả kiểm >8,5 mmol/L (>325 mg/dL) 8 tra sinh hóa 6,5-8,4 mmol/L (251-325 mg/dL) 5 (Nồng độ 5,0-6,4 mmol/L (191-259 mg/dL) 3 cholesterol 4,0-4,9 mmol/L (155-190 mg/dL) 1 LDL) Nhóm 5: Xét Xuất hiện các đột biến trên các gen LDLR, ApoB hay nghiệm di PCSK9 gây bệnh FH. truyền phân tử 8 (phân tích DNA) Theo Nordestgaard và cộng sự (2013) thang điểm để xác định bệnh FH dựa vào tiêu chí của DLCN như sau: - Bệnh nhân chắc chắn mắc bệnh FH 8 điểm - Bệnh nhân có nguy cơ mắc bệnh FH 6-8 điểm - Bệnh nhân có thể mắc bệnh FH 3-5 điểm - Không mắc bệnh FH 0-2 điểm 5 Bảng 1.2 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của Simon Broome Tiêu chí Mô tả 1 Nồng độ cholesterol toàn phần >7,5 mmol/L hoặc nồng độ LDL- C >4,9 mmol/L (đối với người trưởng thành) Nồng độ cholesterol toàn phần >6,7 mmol/L hoặc nồng độ LDL- C >4,0 mmol/L (đối với trẻ em dưới 16 tuổi) 2 Xuất hiện xanthomas trong gân ở người bệnh hay người có quan hệ huyết thống (thế hệ thứ nhất) hoặc thế hệ thứ hai trong gia đình người bệnh. 3 Bằng chứng có xuất hiện đột biến trên gen LDLR hay các gen khác có liên quan đến bệnh FH dựa trên DNA người bệnh.

4 Trong tiền sử gia đình có người bị nhồi máu cơ tim trước 50 tuổi ở thế hệ thứ nhất hoặc thứ hai, hay trước 60 tuổi ở thế hệ thứ nhất 5 Trong tiền sử gia đình có người có nồng độ cholesterol tổng >7,5 mmol/L ở thế hệ thứ nhất hay thứ hai Bảng 1.3 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của US MEDPED Nồng độ Cholesterol toàn phần ( mmol/L) Tuổi (năm) Thế hệ thứ Thế hệ thứ Thế hệ thứ ba Tổng dân số nhất bị FH hai bị FH bị FH < 20 ≥ 5,7 ≥ 5,9 ≥ 6,2 7,0 20-29 ≥ 6,2 ≥ 6,5 ≥ 6,7 7,5 30-39 ≥ 7,0 ≥ 7,2 ≥ 7,5 8,8 ≥ 40 ≥ 7,5 ≥ 7,8 ≥ 8,0 9,3 I. Gen LDLR Hình 1. Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19 Gen LDLR (low-density lipoprotein receptor) định vị trên nhiễm sắc thể số 19 ( vị trí 19p13.2 ), kích thước 44469 bp với 18 exon ( NCBI ).