Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu vi khuẩn nitrat hóa và phương pháp xác định hoạt tính

Nghiên cứu vi khuẩn nitrat hóa: Phương pháp phân lập và xác định hoạt tính giúp hiểu rõ quá trình chuyển hóa nitơ, ứng dụng trong xử lý môi trường và nông nghiệp.

• Tác giả: Hồ Thị Hạnh Nguyên
• Người hướng dẫn: ThS. Huỳnh Văn Thành
• Trường học: Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Tìm hiểu về vi khuẩn nitrat hóa, phương pháp tăng sinh, phân lập và xác định hoạt tính của vi khuẩn
• Loại tài liệu: Đồ án tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Những ảnh hưởng của những chất thải có bản chất nitơ đến môi trường sống và nước thải
• 1.2. Độc tính (Toxicity)
• 1.3. Sự thiếu oxi trong nước (Eutrophication)
• 1.4. Sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia)
• 1.5. Chu trình nitơ trong nước thải (The Wastewater Nitrogen Cycle)
• 1.6. Quá trình nitrate hoá
• 1.6.1. Giới thiệu về quá trình nitrate hóa trong môi trường (Introduction to Nitrification)

Tóm tắt

I. Giới thiệu về vi khuẩn nitrat hóa

Vi khuẩn nitrat hóa đóng vai trò quan trọng trong quá trình xử lý nước thải, đặc biệt trong việc chuyển hóa các hợp chất nitơ độc hại thành dạng ít gây hại hơn. Nitrosomonas và Nitrobacter là hai loại vi khuẩn chính tham gia vào quá trình này. Nitrosomonas oxy hóa amoni (NH4+) thành nitrit (NO2-), trong khi Nitrobacter chuyển hóa nitrit thành nitrat (NO3-). Quá trình này không chỉ giúp giảm thiểu ô nhiễm nitơ mà còn hỗ trợ quá trình tự làm sạch của hệ sinh thái nước.

1.1. Vai trò của vi khuẩn nitrat hóa

Vi khuẩn nitrat hóa tham gia vào chu trình nitơ, giúp chuyển hóa các hợp chất nitơ độc hại thành dạng ít gây hại hơn. Quá trình này bao gồm hai giai đoạn chính: oxy hóa amoni thành nitrit và chuyển hóa nitrit thành nitrat. Nitrosomonas và Nitrobacter là hai loại vi khuẩn chính thực hiện các giai đoạn này. Sự hiện diện của chúng trong hệ thống xử lý nước thải giúp giảm thiểu ô nhiễm nitơ và hỗ trợ quá trình tự làm sạch của hệ sinh thái nước.

1.2. Ứng dụng trong xử lý nước thải

Vi khuẩn nitrat hóa được ứng dụng rộng rãi trong xử lý nước thải, đặc biệt là trong ngành công nghiệp chế biến thủy sản. Việc bổ sung các chế phẩm vi sinh vật giúp tăng cường hiệu quả xử lý nitơ trong nước thải, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường. Phương pháp này được coi là thân thiện với môi trường và có tính ổn định cao.

II. Phương pháp tăng sinh và phân lập vi khuẩn

Phương pháp tăng sinh và phân lập vi khuẩn là các bước quan trọng trong nghiên cứu vi khuẩn nitrat hóa. Quá trình tăng sinh giúp nhân số lượng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy, trong khi phân lập cho phép tách riêng các chủng vi khuẩn để nghiên cứu sâu hơn. Các phương pháp này đã được cải tiến qua nhiều năm, từ nghiên cứu của Winogradsky (1890) đến các kỹ thuật hiện đại như sử dụng môi trường agar tinh chế.

2.1. Quy trình tăng sinh vi khuẩn

Phương pháp tăng sinh vi khuẩn nitrat hóa bao gồm việc nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường giàu dinh dưỡng để kích thích sự phát triển. Các yếu tố như nhiệt độ, pH và nồng độ oxy cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo hiệu quả của quá trình. Các nghiên cứu từ thế kỷ 19 đến nay đã giúp cải thiện đáng kể hiệu quả của phương pháp này.

2.2. Kỹ thuật phân lập vi khuẩn

Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng các chủng vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy hỗn hợp. Các kỹ thuật như sử dụng môi trường agar tinh chế và pipet mao quản thủy tinh đã được áp dụng để phân lập các chủng vi khuẩn nitrat hóa. Những kỹ thuật này giúp nghiên cứu sâu hơn về đặc tính và hoạt tính của từng chủng vi khuẩn.

III. Xác định hoạt tính của vi khuẩn

Xác định hoạt tính của vi khuẩn nitrat hóa là bước quan trọng để đánh giá khả năng xử lý nitơ của chúng. Các phương pháp như đo nồng độ nitrit và nitrat trong mẫu nước thải được sử dụng để đánh giá hiệu quả của quá trình nitrat hóa. Việc xác định hoạt tính giúp lựa chọn các chủng vi khuẩn có hiệu suất cao để ứng dụng trong thực tế.

3.1. Phương pháp định lượng nitrit và nitrat

Xác định hoạt tính của vi khuẩn nitrat hóa thường được thực hiện thông qua việc đo nồng độ nitrit (NO2-) và nitrat (NO3-) trong mẫu nước thải. Các phương pháp hóa học và sinh học được sử dụng để đánh giá hiệu quả của quá trình nitrat hóa. Kết quả thu được giúp đánh giá khả năng xử lý nitơ của các chủng vi khuẩn.

3.2. Ứng dụng trong nghiên cứu và thực tiễn

Việc xác định hoạt tính của vi khuẩn nitrat hóa không chỉ quan trọng trong nghiên cứu mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao. Các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao được lựa chọn để ứng dụng trong các hệ thống xử lý nước thải, giúp giảm thiểu ô nhiễm nitơ và bảo vệ môi trường.

IV. Tác động của vi khuẩn nitrat hóa đến môi trường

Tác động của vi khuẩn nitrat hóa đến môi trường là một chủ đề quan trọng trong nghiên cứu sinh học vi sinh. Vi khuẩn nitrat hóa không chỉ giúp giảm thiểu ô nhiễm nitơ mà còn có thể gây ra các vấn đề như cạn kiệt oxy hòa tan trong nước. Hiểu rõ các tác động này giúp cân bằng lợi ích và rủi ro khi ứng dụng vi khuẩn nitrat hóa trong thực tế.

4.1. Lợi ích trong xử lý nước thải

Vi khuẩn nitrat hóa đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý nước thải, giúp giảm thiểu hàm lượng nitơ độc hại. Quá trình nitrat hóa chuyển hóa các hợp chất nitơ thành dạng ít gây hại hơn, giúp bảo vệ môi trường nước và hỗ trợ quá trình tự làm sạch của hệ sinh thái.

4.2. Rủi ro tiềm ẩn

Mặc dù có nhiều lợi ích, vi khuẩn nitrat hóa cũng có thể gây ra các vấn đề như cạn kiệt oxy hòa tan trong nước. Sự tiêu thụ oxy trong quá trình nitrat hóa có thể dẫn đến tình trạng thiếu oxy, ảnh hưởng đến sự sống của các sinh vật thủy sinh. Hiểu rõ các rủi ro này giúp cân bằng lợi ích và hạn chế tác động tiêu cực đến môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS.1 Những ảnh hưởng của những chất thải có bản chất nitơ đến môi trường sống và nước thải: Sự hiện diện của những chất thải có bản chất nitơ và những chất thải có chứa nitơ trong nước thải cuối cùng của một hệ thống nước thải nhà máy hay xí nghiệp được thải ra, có thể tác động bất lợi và gây ô nhiễm đến chất lượng của nguồn nước tiếp nhận (các nguồn nước mặt như: sông, suối, ao, hồ…). Nguồn gốc của những chất thải có bản chất nitơ gây ô nhiễm nguồn nước nhận chính là những ion NH4+, NO2- và NO3-. Những tác động gây ô nhiễm quan trọng có liên quan tới sự hiện diện của những chất thải có bản chất nitơ ấy bao gồm: sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO), độc tính (Toxicity), sự thiếu oxi trong nước (Eutrophications) và sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia). Để giảm bớt những ảnh hưởng bất lợi của những chất thải có bản chất nitơ cho nguồn nước tiếp nhận, một hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) phải đảm bảo yêu cầu xử lý và giảm lượng chất thải có bản chất nitơ xuống dưới hoặc bằng mức cho phép của tiêu chuẩn xả thải trong nước thải đầu ra của hệ thống xử lý nước thải ấy.

Hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) phải đảm bảo quá trình oxi hóa nitơ (nitrify) và quá trình khử nitơ (denitrify) những chất thải có bản chất nitơ xảy ra hoàn tất trong cả quá trình hoạt động của hệ thống. Yêu cầu của quá trình nitrate hóa (nitrification) thường được đưa ra như giới hạn thải ra NH3 và yêu cầu của quá trình phản nitrate (denitrification) thường được đưa ra như giới hạn Tổng nitơ hay Tổng nitơ Kjeldahl (TKN).1 Sự cạn kiệt oxi hòa tan (DO): Việc thải ra những chất thải có bản chất nitơ vào nguồn nước nhận là kết quả của sự cạn kiệt nguồn oxi hòa tan trong nguồn nước nhận ấy. Sự cạn kiệt xảy ra thông qua sự tiêu thụ oxi hòa tan bởi hoạt động của vi khuẩn. Đầu tiên, NH4+ được oxi hóa thành NO2- và NO2- được oxi hóa thành NO3- bên trong nguồn nước tiếp nhận.

Quá trình oxi hóa mỗi ion xảy ra bằng oxi hòa tan được di chuyển từ nguồn nước tiếp nhận vào vi khuẩn và gia tăng thêm NH4+ và NO2-. Tiếp theo, NH4+, NO2- và NO3- đáp ứng như là nguồn nitơ dinh dưỡng cho sự 5 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH tăng trưởng của những thực vật sống ở nước, chủ yếu là những loài tảo. Khi những thực vật ấy chết đi, oxi hòa tan sẽ được di chuyển từ nguồn nước tiếp nhận vào vi khuẩn để phân hủy những thực vật đã chết ấy.

+ O2 + O2 + - NH4 NO2 NO3- 1.2 Độc tính (Toxicity): Ba ion có bản chất nitơ trên (NH4+, NO2- & NO3-) có thể là độc chất cho sự sống của những loài thủy sinh vật, đặc biệt nhất là cá. Những ion NH4+ và NO2- là vô cùng độc. Và NO2- là độc nhất trong 3 loại ion có bản chất nitơ. Mặc dù NH4+ là nguồn dinh dưỡng nitơ ưa thích nhất cho phần lớn sinh vật sống, NH4+ được biến đổi thành NH3 với sự tăng lên của pH và gây độc cho sự sống của thủy sinh vật.3 Sự thiếu oxi trong nước (Eutrophication): Trong khi phosphate (PO42-) là nguồn gốc chính yếu của sự thiếu oxi trong nước thì những chất thải có bản chất nitơ cũng góp phần quan trọng cho vấn đề ô nhiễm nước này.

Sự thiếu oxi trong nước nói đến sự thải ra những chất dinh dưỡng của thực vật (chủ yếu là: phốt pho và nitơ) vào nước sạch (như: hồ và ao). Sự hiện diện những chất dinh dưỡng này kích thích sự tăng trưởng nhanh chóng hay sự ra hoa của thực vật thủy sinh, bao gồm cả tảo. Khi những thực vật thủy sinh này già và chết đi, xác của chúng sẽ làm cho nguồn nước thiếu oxi do quá trình hoạt động phân hủy hiếu khí của những vi sinh vật diễn ra. Sự thiếu oxi trong nước dẫn đến sự lão hóa nhanh chóng của nguồn nước ngọt khi chúng mất khá nhiều oxi cho sự phân hủy này.

Và sự tích lũy xác những thực vật thủy sinh ngày càng nhiều dẫn đến khả năng phân hủy của nguồn nước bị giảm đi đến mức chúng không thể phân hủy được nữa, không tự làm sạch được nữa thì dẫn đến nguồn nước ấy bị ô nhiễm. 6 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS.4 Sự làm mất khả năng vận hành oxi trong máu (Methemoglobinemia): Từ “Methemoglobinemia” hay “Hội chứng da xanh ở trẻ em” nói đến một căn bệnh của những đứa trẻ còn nhỏ (dưới 6 tháng tuổi) ăn uống phải nước ngầm đã nhiễm bẩn NO3-. Khi một đứa bé ăn uống những thứ được làm ra từ nước ngầm đã bị nhiễm bẩn NO3- thì những ion này dễ dàng được biến đổi thành NO2- trong đường tiêu hóa của đứa bé. Ion NO2- này xâm nhập vào hệ tuần hoàn của đứa trẻ và nhanh chóng liên kết với Fe trong nhân của Hemoglobin hay những tế bào hồng cầu.

Sự hiện diện của NO2- trong nhân ngăn cản Hemoglobin thu được oxi khi nó đi qua phổi của đứa trẻ. Sự thiếu oxi trong cơ thể của đứa trẻ dẫn đến da của đứa trẻ trở nên xanh xao, vì thế mới có thuật ngữ “Blue baby syndrome”. Nếu thiếu oxi trong não của đứa trẻ, chứng liệt hay chết có thể xuất hiện. Methemoglobinemia thường xuất hiện ở những vùng nông thôn, nơi mà nước dùng để uống được thu từ nước ngầm.

Methemoglobinemia không có dấu hiệu để cảnh báo và mặc dù nó có thể xuất hiện với những người trưởng thành, nó có thể độc hơn nhiều với những đứa trẻ sơ sinh bởi vì pH trong cơ thể chúng thấp hơn và trọng lượng cơ thể chúng thấp hơn khi so sánh với những người trưởng thành. Và khi ion NO3- ở nồng độ cao cũng có thể làm tăng nguy cơ gây ung thư dạ dày ở mọi lứa tuổi.2 Chu trình nitơ trong nước thải (The Wastewater Nitrogen Cycle): 7 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Hình 1.1: Chu trình nitơ trong nước thải. Có nhiều hợp chất có bản chất nitơ tồn tại trong môi trường sống và trong hệ thống xử lý nước thải.

Phần lớn nitơ tìm thấy trong môi trường sống tồn tại dưới dạng nitơ phân tử (N2) trong bầu khí quyển chúng ta (chúng chiếm tới 76% trong bầu khí quyển so với các khí khác). Mặc dù sự cấu thành không nhiều của nitơ trong sinh khối so với carbon hay oxi nhưng nitơ là một yếu tố thiết yếu của tất cả sự sống sinh vật. Nó được kết hợp chặt chẽ trong nguyên liệu tế bào và được dùng cho sự tăng trưởng, tạo ra enzyme và thông tin về di truyền học. Tuy nhiên, nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ nối với nhau bằng 3 dây nối N N, nó rất khó để hầu hết sinh vật có thể bẻ gãy.

May thay, nitơ phân tử được tạo ra sẵn có cho sự sống sinh vật khi mà liên kết 3 bị bẻ gãy bởi một nhóm vi khuẩn duy nhất và được cố định lại hay biến đổi thành NH4+. 8 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH Những vi khuẩn biến đổi nitơ phân tử thành NH4+ là những vi khuẩn cố định nitơ. Những vi khuẩn này có thể sống tự do trong đất xung quanh rễ của thực vật hay có thể tăng trưởng cộng sinh trong rễ của những cây họ đậu.

Sự cố định nitơ tức là sự chuyển đổi nitơ phân tử thành NH4+, được hoàn thành bởi enzyme nitrogenase chỉ được tìm thấy trong những vi khuẩn cố định nitơ. Trước khi sự sử dụng phân bón nitơ lan rộng, thực vật tăng trưởng nốt sần hay những cây họ đậu cung cấp nitơ cho đất. Ví dụ những cây họ đậu bao gồm: Cỏ linh lăng, Cỏ ba lá và những cây Đậu nành. Một vài loài tảo cũng có thể sử dụng nitơ phân tử để sản xuất ra amino acid và protein.

Tảo lấy nitơ phân tử từ không khí và đồng hóa chúng thành những phân tử hữu cơ. Cuối cùng, những phân tử hữu cơ này với nitơ liên kết thành cấu trúc của chúng và được tiêu thụ trong suốt chiều dài của chuỗi thức ăn; như là tảo được tiêu thụ bởi những dạng sống cao hơn. Sự di chuyển của nitơ và sự thay đổi chính nó trong các trạng thái oxi hóa từ không khí sang sinh vật sống đến hệ thống xử lý nước thải (Hệ thống bùn hoạt tính) và sự trở lại của nó vào không khí là chu trình nitơ trong nước thải. Chu trình này liên kết với những hợp chất có bản chất nitơ then chốt liên tiếp như: nitơ phân tử (N2), amino acid, protein, urea, NH4+, NH3, NO2- và NO3-.

Trong đó, amino acid và protein là những dạng hữu cơ của nitơ; còn nitơ phân tử (N2), NH4+, NH3, NO2- và NO3- là những dạng vô cơ của nitơ. Sự sản sinh ra NO2- và NO3- trong hệ thống cống rãnh là hiếm thấy. Những điều kiện trong hệ thống cống rãnh là không phù hợp cho sự tạo ra hay quá trình nitrate hóa của những ion này. Những điều kiện bất lợi trong hệ thống cống rãnh ngăn cản quá trình nitrate hóa bao gồm: sự thiếu oxi thích hợp, quần thể vi khuẩn nitrate hóa nhỏ và thời gian nước được giữ lại ngắn.

Tuy nhiên, lượng rất lớn NO2- và NO3- có thể được tìm thấy trong hệ thống cống rãnh nếu chúng được thải ra từ nguồn nước thải công nghiệp có những ion này, như là nước thải nhà máy thép. Những amino acid và protein trong mô thực vật, trong rễ, trong hạt và từ thịt vật nuôi được thải trực tiếp vào hệ thống cống rãnh (rác vứt bỏ đi, nước thải chế 9 SVTH: HỒ THỊ HẠNH NGUYÊN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP – GVHD: ThS. HUỲNH VĂN THÀNH biến thực phẩm) và gián tiếp vào hệ thống cống rãnh (chất thải có bản chất là phân). Nhiều vi khuẩn trong hệ thống cống rãnh khử nhóm amino (-NH2) ra khỏi các amino acid và protein.

Sự khử nhóm NH2 được hoàn thành với enzyme deaminase và đưa đến kết quả là tạo ra NH4+. Sự tạo thành NH4+ còn được biết đến như là quá trình amôn hóa. Sự khử nhóm NH2 của amino acid phenylalanine được cho thấy: Phenylalanine–Proteus NH4+ Phenylpyruvic acid Urea: là một hợp chất nitơ hữu cơ, chúng được tìm thấy trong nước tiểu, phân bón và những chất thải từ chăn nuôi. Khi mà được thủy phân bởi enzyme urease của vi khuẩn, NH4+ được giải phóng.