Phương pháp định lượng Vitamin B6 trong dầu gội bằng HPLC - Khóa luận Dược sĩ

Phương pháp định lượng Vitamin B6 trong dầu gội đầu bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, đảm bảo độ chính xác và hiệu quả cao.

• Tác giả: Đồng Mai Ngân
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Thanh Thủy
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng vitamin B6 trong dầu gội bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Vitamin B6 và ứng dụng trong dầu gội

Vitamin B6, còn được gọi là Pyridoxin, là một trong những vitamin nhóm B quan trọng đối với sức khỏe tóc và da đầu. Vitamin B6 trong dầu gội đóng vai trò thiết yếu trong việc cân bằng độ pH, giảm viêm da đầu và cải thiện tình trạng tóc khô, gãy rụng. Các dạng vitamin B6 thường được sử dụng trong công thức mỹ phẩm bao gồm Pyridoxine HCl, Pyridoxal và Pyridoxamine. Tác dụng của Pyridoxin trong chăm sóc tóc được công nhận rộng rãi bởi khả năng tăng cường sức khỏe da đầu, giảm gàu và mụn mủ. Nhu cầu kiểm soát chất lượng dầu gội chứa vitamin B6 ngày càng tăng, đòi hỏi phương pháp phân tích chính xác, nhạy cảm và đáng tin cậy để đảm bảo hàm lượng vitamin được khai báo trên nhãn sản phẩm.

1.1. Các dạng và chỉ định của Vitamin B6

Vitamin B6 tồn tại dưới ba dạng chính: Pyridoxine, Pyridoxal và Pyridoxamine, trong đó Pyridoxine HCl là dạng được sử dụng phổ biến nhất trong dầu gội. Chỉ định sử dụng vitamin B6 trong mỹ phẩm nhằm mục đích điều trị gàu, viêm da đầu, cân bằng tiết dầu và tăng cường độ bóng mượt cho tóc. Hàm lượng vitamin B6 trong dầu gội thường dao động từ 0,1-0,5%, tùy thuộc vào công thức và mục đích sử dụng của sản phẩm.

1.2. Tác dụng Pyridoxin trong chăm sóc tóc

Pyridoxin (Vitamin B6) có tác dụng kháng viêm, giúp cân bằng độ pH da đầu và chống oxy hóa. Tác dụng này giúp giảm gàu và viêm da đầu hiệu quả, đồng thời tăng cường sản xuất collagen và keratin cho tóc khỏe mạnh. Ngoài ra, vitamin B6 trong dầu gội còn hỗ trợ cân bằng hoạt động của tuyến bã nhờn, từ đó cải thiện tình trạng tóc dầu và tóc khô.

II. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trong định lượng Vitamin B6

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hiện đại, được công nhận quốc tế trong định lượng vitamin B6 trong các mẫu mỹ phẩm, thuốc và thực phẩm. Phương pháp HPLC có độ nhạy cao, độ chính xác tuyệt vời và khả năng phân tách các chất có tính chất tương tự. Nguyên tắc hoạt động của HPLC định lượng vitamin B6 dựa trên sự phân tách các phân tử dựa vào độ hấp phụ trên cột sắc ký và độ hòa tan trong pha động. Ưu điểm của HPLC bao gồm thời gian phân tích ngắn, không cần chuẩn bị mẫu phức tạp, và có thể phát hiện các tạp chất cùng lúc. Phương pháp này được khuyến cáo bởi các tổ chức quốc tế như AOAC (Association of Official Analytical Chemists) cho định lượng vitamin B6 trong dầu gội.

2.1. Nguyên tắc và thông số của HPLC

HPLC hoạt động dựa trên nguyên tắc chromatography pha lỏng, trong đó pha tĩnh (cột sắc ký) và pha động (dung dịch) tương tác với các phân tử vitamin B6. Các thông số quan trọng bao gồm thời gian lưu hành (retention time), độ phân giải, hệ số đốI xứng peak và hiệu suất cột. Detector mảng diod (DAD) được sử dụng phổ biến để phát hiện vitamin B6 ở bước sóng 254-290 nm với độ nhạy cao.

2.2. Ứng dụng HPLC trong kiểm soát chất lượng dầu gội

HPLC trong kiểm soát chất lượng dầu gội Klorane giúp xác định chính xác hàm lượng vitamin B6, phát hiện các tạp chất và đảm bảo sản phẩm đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng. Phương pháp này cho phép định lượng vitamin B6 nhanh chóng, với độ lặp lại cao, độ thu hồi tốt (95-105%), và giới hạn phát hiện thấp (LOD ≤ 0,1 mg/L).

III. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

Xây dựng phương pháp HPLC để định lượng vitamin B6 trong dầu gội yêu cầu lựa chọn cột sắc ký phù hợp (thường là cột C18), pha động tối ưu (hỗn hợp buffer phosphate và acetonitril), tốc độ dòng, nhiệt độ cột và bước sóng phát hiện. Quá trình xây dựng phương pháp bao gồm khảo sát các tham số như pH pha động, tỷ lệ acetonitril, tốc độ dòng để đạt hiệu suất phân tách tốt nhất. Thẩm định phương pháp HPLC là bước quan trọng, bao gồm đánh giá độ chính xác, độ chính xác (precision), độ lặp lại (repeatability), độ thu hồi (recovery) theo tiêu chuẩn AOAC và ICH. Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), với yêu cầu RSD (độ lệch chuẩn tương đối) ≤ 2% cho phương pháp tốt.

3.1. Các bước xây dựng phương pháp định lượng

Xây dựng phương pháp bắt đầu từ lựa chọn cột C18 RP-HPLC, thiết lập pha động là hỗn hợp buffer phosphate (pH 3,0) và acetonitril theo tỷ lệ 90:10 (v/v). Dòng chảy được đặt ở 1,0 mL/phút, nhiệt độ cột 30°C, bước sóng phát hiện 254 nm. Mẫu vitamin B6 được điều chế nồng độ 50 µg/mL, tiêm 20 µL vào hệ thống HPLC với thời gian phân tích khoảng 15-20 phút.

3.2. Tiêu chí thẩm định theo AOAC

Thẩm định phương pháp AOAC đòi hỏi độ chính xác ≥ 95%, độ lặp lại RSD ≤ 2%, độ thu hồi 95-105%. LOD và LOQ cần được xác định bằng tỷ lệ signal-to-noise (S/N) = 3:1 và 10:1 tương ứng. Độ tuyến tính được kiểm chứng trong khoảng nồng độ 10-250 µg/mL với R² ≥ 0,999.

IV. Ứng dụng thực tiễn trong định lượng dầu gội Klorane

Phương pháp HPLC đã xây dựng được ứng dụng thành công trong định lượng vitamin B6 trong dầu gội Klorane, một sản phẩm mỹ phẩm chuyên dùng cho da đầu nhạy cảm và tóc khô. Kết quả phân tích cho thấy dầu gội Klorane chứa 0,35 ± 0,02 mg/mL vitamin B6, tương ứng với 87-103% hàm lượng khai báo, nằm trong giới hạn chấp nhận. Phương pháp này có khả năng phát hiện các tạp chất, chất bẩn và đảm bảo sản phẩm an toàn cho người sử dụng. Ngoài ra, phương pháp HPLC cũng được áp dụng để kiểm soát chất lượng các dầu gội khác chứa vitamin B6, đóng vai trò quan trọng trong công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm định chất lượng sản phẩm mỹ phẩm tại Việt Nam.

4.1. Quy trình định lượng vitamin B6 trong dầu gội Klorane

Mẫu dầu gội Klorane được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1 mL trong 10 mL ethanol, sau đó lọc qua bộ lọc PTFE 0,2 µm. Nồng độ mẫu được điều chỉnh thích hợp bằng pha động để nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn. Tiêm 20 µL mẫu vào hệ thống HPLC với điều kiện đã xác định, ghi nhận chromatogram và tính toán hàm lượng vitamin B6 bằng phương pháp đường chuẩn ngoài.

4.2. Ý nghĩa lâu dài của phương pháp phân tích

Phương pháp HPLC xây dựng có ý nghĩa lâu dài trong kiểm soát chất lượng sản phẩm dầu gội tại Việt Nam, giúp đảm bảo sản phẩm mỹ phẩm chứa vitamin B6 đáp ứng tiêu chuẩn quốc tế. Phương pháp này có thể mở rộng ứng dụng cho các sản phẩm mỹ phẩm khác, hỗ trợ công tác kiểm nghiệm và chứng nhận chất lượng tại các cơ sở phòng thí nghiệm dược phẩm và mỹ phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Tổng quan về vitamin B6 1. Các dạng thường gặp của vitamin B6: Vitamin B6 bao gồm một nhóm các hợp chất có liên quan về mặt hóa học, tất cả đều chứa một vòng pyridin làm lõi. Chúng khác nhau ở một nhóm biến đổi tại vị trí 4' của pyridin, có thể là nhóm amino methyl (Pyridoxamin), nhóm hydroxyl methyl (Pyridoxin) hoặc aldehyd (Pyridoxal).

Các dạng thường gặp của vitamin B6 1. Pyridoxin HCl Tên IUPAC: 4,5-bis(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol hydrochloride [14] Công thức phân tử: C8H11NO3. Công thức cấu tạo của Pyridoxin HCl Tính chất vật lý [14]: Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. Dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%.

Chảy ở khoảng 205°C kèm theo phân hủy. Hấp thụ tia tử ngoại. Tính chất hóa học: [15] - Vòng Pyridin (N dị vòng): tính base yếu, pKa = 5,85 + Định tính: thuốc thử chung alcaloid (acid picric…) + Định lượng: phương pháp đo acid trong môi trường khan + Tác dụng với acid tạo muối  điều chế nguyên liệu dược dụng Pyridoxin HCl dễ tan trong nước. 2 - Nhóm -OH phenol: tính acid yếu, pKa = 9,4, phản ứng với FeCl3 xuất hiện màu nâu cam, thêm HCl chuyển màu vàng.

- Nhóm -CH2OH: tạo phức bền với acid boric. Hòa tan Pyridoxin HCl, thêm vào dung dịch 2,6-dibromo-N-cloro-1,4-benzoquinon monoimin trong ethanol và amoniac, xuất hiện màu xanh dương. Lấy dung dịch Pyridoxin HCl ở trên, thêm vào dung dịch acid boric bão hòa, tiến hành tương tự, dung dịch không xuất hiện màu xanh. - Phản ứng thế ái điện thử vào C6: phản ứng tạo phẩm màu azo - Phản ứng của ion Cl- của acid HCl kết hợp: + AgNO3  tạo tủa trắng  Định tính 1.

Chỉ định của vitamin B6 Theo Dược thư Quốc gia Việt Nam [16], chỉ định của vitamin B6 gồm có: - Phòng và điều trị thiếu hụt vitamin B6. - Điều trị hội chứng lệ thuộc Pyridoxin di truyền ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. - Phòng và điều trị nhiễm độc thần kinh do dùng các thuốc khác như isoniazid, hydralazin, ethionamid hoặc capecitabin. - Điều trị ngộ độc cấp tính (hôn mê, co giật) do sử dụng quá liều isoniazid, hydralazin, cycloserin, ngộ độc nấm thuộc chi Gyromitra có độc chất Gyromitrin.

- Thiếu máu nguyên bào sắt di truyền. - Điều trị rối loạn chuyển hóa: Điều trị tăng acid oxalic trong nước tiểu nguyên phát, homocystin niệu nguyên phát, cystathionin niệu nguyên phát hoặc nước tiểu có acid xanthurenic. Tác dụng của Pyridoxin trong mỹ phẩm cho tóc Vitamin B6 trong các sản phẩm chăm sóc tóc thường được sử dụng để làm chắc khỏe và nuôi dưỡng tóc, có thể giúp cải thiện độ đàn hồi của tóc, làm giảm gãy rụng và cải thiện sức khỏe tổng thể của tóc. Ngoài ra B6 cũng có thể giúp kích thích mọc tóc và ngăn ngừa rụng tóc, giảm viêm da đầu do tiết bã nhờn [1-2].

Một số phương pháp định lượng vitamin B6 đã có ở Việt Nam và trên thế giới 1. Các phương pháp định lượng vitamin B6 đã có ở Việt Nam Hiện nay ở Việt Nam đã có một số phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định vitamin B6 trong đa dạng nền mẫu (thuốc, sữa bột, sữa tươi, nấm, giấm chuối). Cách xử lý mẫu và điều kiện sắc ký được tóm tắt trong Bảng 1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định vitamin B6 ở Việt Nam TT Mẫu Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký TLTK - Cột: C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) Thuốc - Pha động: CH3CN – KH2PO4 0,015M Scanneuron- Hòa tan trong 1 (17:83) [17] Forte và pha động - Bước sóng phân tích: 278 nm Haneuvit - Nhiệt độ phân tích: 35oC - Cột: C18 (250 × 6,1 mm; 5 μm) - Pha động: Na2HPO4 (pH 3) – CH3CN Sữa bột và Chiết bằng 2 (80:20) [18] sữa tươi pha động - Bước sóng phân tích: 291 nm - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ PTN - Cột: C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) Chiết bằng - Pha động: MeOH – dung dịch đệm gồm dung dịch H3PO4 0,01M, acid 1- heptane sulfonic 3 Nấm lớn [19] HCl 0,1M 0,05% (w/v) (pH 2,5) (26:74) (pH =1) - Bước sóng phân tích: 290 nm, 395 nm - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ PTN - Cột: C18 (50 × 2,1 mm, 3,5 µm) Pha loãng - Pha động: MeOH – dung dịch đệm natri 4 Giấm chuối bằng pha 1-hexanesulfonate 0,05M (pH 2,5) (38:62) [20] động - Bước sóng phân tích: 210 nm - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ PTN Nhận xét: Nền mẫu đa dạng, cách xử lý đơn giản, đều sử dụng cột C18, pha động gồm MeOH, CH3CN và dung dịch đệm (đa số có pH ≤ 3), bước sóng phân tích đa dạng, nhiệt độ phân tích đa số phụ thuộc điều kiện PTN.

Các phương pháp định lượng vitamin B6 trên thế giới 1. Nền mẫu là thuốc Trên nền mẫu là thuốc (viên nén, viên nang) đã có khá nhiều phương pháp định lượng vitamin B6 bằng HPLC. Phương pháp xử lý mẫu đơn giản, điều kiện sắc ký được tóm tắt trong Bảng 1. Phương pháp định lượng vitamin B6 trên nền mẫu là thuốc TT Mẫu Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký TLTK - Cột: C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) - Pha động: MeOH - dung dịch đệm KH2PO4 Hòa tan bằng 1 Viên nén (pH 3 ± 0,2) (30:70) [3] pha động - Bước sóng phân tích: 254 nm - Nhiệt độ phân tích: 25oC - Cột: C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) - Chương trình gradient gồm CH3CN và đệm Viên Hòa tan trong 2 KH2PO4 0,025M pH 3,5 [4] nang MeOH - Bước sóng phân tích: 254 nm - Nhiệt độ phân tích: 25oC - Cột: C18 (150 × 4,6 mm, 5 µm) Nghiền nhỏ, - Chương trình gradient gồm MeOH và đệm 3 Viên nén hòa tan trong NaH2PO4 0,025M pH 2,5 [5] nước - Bước sóng phân tích: 220 nm - Nhiệt độ phân tích: 35oC - Cột: PA (150 × 3,0 mm, 3 µm) Nghiền nhỏ, - Chương trình gradient gồm CH3CN, dung 4 Viên nén hòa tan trong dịch đệm phosphat 0,025M pH 3,2 [6] nước - Bước sóng phân tích: 280, 290 nm - Nhiệt độ phân tích: 25oC - Cột: C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) - Pha động: MeOH - dung dịch đệm Nghiền nhỏ, Na2HPO4 0,05M, TEA 0,018M, pH 3,55 5 Viên nén hòa tan trong [7] (10:90) nước - Bước sóng phân tích: 280 nm - Nhiệt độ phân tích: 22oC - Cột: Supelcosil ABZ+ (150 × 4,6 mm; 5 µm) Nghiền nhỏ, - Pha động: MeOH - dung dịch đệm gồm 6 Viên nén hòa tan trong acid heptan sulphonic 0,005M, TEA 0,1% pH [8] MeOH 15% 2,8 (25:75) - Bước sóng phân tích: 290 nm - Nhiệt độ phân tích: 35oC Nhận xét: Trên nền mẫu là thuốc cách xử lý mẫu tương đối đơn giản (nghiền nhỏ, hòa tan trong dung môi), cột phân tích chủ yếu sử dụng cột C18, thành phần pha động gồm MeOH, CH3CN và dung dịch đệm, có thể đẳng dòng hoặc chương trình gradient 5 dung môi, bước sóng phân tích đa dạng từ 220 nm đến 290 nm, quá trình phân tích có thể cố định nhiệt hoặc phụ thuộc nhiệt độ PTN.

Nền mẫu là thực phẩm Trên nền mẫu thực phẩm đã có một số phương pháp xác định vitamin B6 bằng HPLC, nền mẫu đa dạng, cách xử lý phức tạp hơn so với nền mẫu thuốc. Điều kiện sắc ký và cách xử lý mẫu được tóm tắt trong Bảng 1. Phương pháp định lượng vitamin B6 trên nền mẫu thực phẩm TT Mẫu Cách xử lý mẫu Điều kiện sắc ký TLTK Chiết bằng - Cột: C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) H2SO4, trung hòa - Pha động: MeOH - H3PO4 pH 3,54 Bột đậu 1 bằng AcONa, (33:67) [9] bắp thêm enzym, pha - Bước sóng phân tích: 270 nm loãng bằng nước - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ PTN Chiết bằng dung - Cột: C18 (4.6 × 250 mm, 5µm) môi ở 70 oC - Pha động: MeOH - dung dịch đệm Hạt đậu Dung môi: (4:96), dung dịch đệm gồm natri hexan 2 [10] gà CH3CN-AcOH sulfonat, KH2PO4, TEA, pH 3,0 băng -H2O - Bước sóng phân tích: 210 nm, 280 nm (5:1:94) - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ PTN - Cột: C18 (250 × 4,6mm, 5μm) Xử lý bằng - Pha động: Đệm K3PO4 0,02M (pH 7,0) - Thực enzym sau đó 3 MeOH (90:10) [11] phẩm chiết bằng HCl - Bước sóng phân tích: 360 nm, 430 nm 1,1N - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ PTN Nhận xét: Nền mẫu là thực phẩm có cách xử lý mẫu phức tạp hơn so với nền mẫu là thuốc (chiết nóng, xử lý với enzym), cột phân tích chủ yếu sử dụng cột C18, thành phần pha động gồm MeOH, CH3CN và dung dịch đệm, có thể đẳng dòng hoặc chương trình gradient dung môi, bước sóng phân tích đa dạng từ 210 nm đến 430 nm, quá trình phân tích có thể cố định nhiệt hoặc phụ thuộc nhiệt độ PTN. Nền mẫu là mỹ phẩm Trên thế giới đã có một số phương pháp xác định vitamin B6 trong mẫu mỹ phẩm ví dụ như mỹ phẩm cho tóc, mỹ phẩm cho da ở dạng lỏng hoặc bán rắn.

Cách xử lý mẫu và điều kiện sắc ký được tóm tắt trong Bảng 1. Phương pháp định lượng vitamin B6 trên nền mẫu mỹ phẩm Mẫu Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký TLTK - Cột phân tích: C18 (250 × 4,6mm, 5 µm) Sản phẩm - Pha động: MeOH - dung dịch đệm Hòa tan bằng chăm sóc (20:80), dung dịch đệm gồm acid hexan [12] MeOH tóc sulfonic, TEA, H3PO4, pH 4,5 - Bước sóng phân tích: 263 nm - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ PTN Nhận xét: Nền mẫu mỹ phẩm có cách xử lý mẫu tương đối đơn giản, điều kiện sắc ký tương tự với những nền mẫu trên, bước sóng phân tích tại 263 nm. Tổng quan về phương pháp HPLC 1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao.

Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải của các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận sử lý số liệu thành sắc ký đồ với các thông tin về pic của chất phân tích [21] 1.

Các thông số đặc trung của quá trình sắc ký 1. Thời gian lưu (tR) Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector được gọi là thời gian lưu tR.