Khóa luận: Định lượng Tropan Alkaloids trong thực phẩm ngũ cốc của trẻ em

Khóa luận Dược sĩ định lượng Tropan Alkaloids trong ngũ cốc trẻ em. Trình bày phương pháp phân tích LC-MS/MS, kết quả thẩm định và ứng dụng thực tế.

• Tác giả: Phan Như Quỳnh
• Người hướng dẫn: Ts. Đặng Thị Ngọc Lan
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Định Lượng Một Số Tropan Alkaloids Trong Thực Phẩm Dinh Dưỡng (Ngũ Cốc) Của Trẻ Em
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về Tropan Alkaloids và nguy cơ phơi nhiễm

Tropan Alkaloids là một nhóm hợp chất hóa học tự nhiên có nguồn gốc từ các loài thực vật như cây lồng thược, khoai tây và các ngũ cốc. Những chất này có thể hình thành và tồn tại trong thực phẩm dinh dưỡng của trẻ em qua nhiều con đường khác nhau. Nguy cơ phơi nhiễm Tropan Alkaloids đặc biệt nghiêm trọng đối với trẻ em vì hệ miễn dịch và cơ thể của họ đang phát triển. Việc hiểu rõ về sự hình thành, dạng tồn tại và độc tính của các hợp chất này là nền tảng quan trọng để bảo vệ sức khỏe trẻ em. Các quy định hiện hành về ngưỡng cho phép của Tropan Alkaloids trong thực phẩm đã được các tổ chức y tế quốc tế như EFSA đưa ra nhằm đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

1.1. Sự hình thành Tropan Alkaloids trong ngũ cốc

Tropan Alkaloids có thể hình thành trong ngũ cốc qua quá trình phát triển của thực vật hoặc do sự ô nhiễm từ các loài cỏ dại. Các hợp chất này tồn tại dưới dạng tự nhiên và có thể được giữ lại trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự tích tụ của Tropan Alkaloids phụ thuộc vào điều kiện môi trường, loại đất, và các thực hành nông nghiệp.

1.2. Quy định an toàn thực phẩm quốc tế

EFSA (Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu) đã thiết lập ngưỡng giới hạn cho Tropan Alkaloids để bảo vệ sức khỏe công chúng, đặc biệt là trẻ em. Các quy định này dựa trên liều tham chiếu cấp tính (ARfD) và yêu cầu các nhà sản xuất thực phẩm phải kiểm tra và giám sát hàm lượng của những chất này trong sản phẩm.

II. Độc tính và cấu trúc của Tropan Alkaloids

Tropan Alkaloids là những hợp chất có tác động lên hệ thần kinh trung ương, có khả năng gây ra những tác dụng phụ nghiêm trọng đối với sức khỏe. Cấu trúc hóa học của các Tropan Alkaloids bao gồm các hợp chất như scopolamine và hyoscyamine, những chất này có khả năng ảnh hưởng đến các tiếp nhận acetylcholine. Độc tính của nhóm Tropan Alkaloids được xác định qua các nghiên cứu độc lực và các báo cáo từ các cơ quan y tế. Trẻ em đặc biệt dễ bị ảnh hưởng vì khối lượng cơ thể nhỏ hơn và khả năng chuyển hóa yếu hơn so với người trưởng thành. Hiểu biết về độc tính này giúp đặt ra những giới hạn an toàn phù hợp trong các sản phẩm thực phẩm dành cho trẻ em.

2.1. Tác dụng độc tính của Tropan Alkaloids

Tropan Alkaloids có thể gây ra các triệu chứng như khô miệng, tachycardia, co giật, và các vấn đề về hệ thần kinh khác. Ở trẻ em, những tác động này có thể là nghiêm trọng hơn do lượng nhạy cảm giới hạn. Các nghiên cứu độc lực chỉ ra rằng phơi nhiễm kéo dài với Tropan Alkaloids có thể gây ra các vấn đề sức khỏe lâu dài.

2.2. Cấu trúc phân tử của các hợp chất

Các Tropan Alkaloids chứa một vòng bicyclic đặc biệt với một nguyên tử nitơ. Cấu trúc này cho phép chúng tương tác với các tiếp nhận thần kinh cụ thể. Scopolamine và hyoscyamine là hai dạng isomer của cùng một cấu trúc cơ bản nhưng có hoạt động sinh học khác nhau.

III. Phương pháp phân tích LC MS MS cho định lượng Tropan Alkaloids

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) là kỹ thuật tiên tiến được sử dụng để định lượng Tropan Alkaloids trong thực phẩm dinh dưỡng của trẻ em một cách chính xác và nhạy cảm. Phương pháp này cho phép phát hiện các hợp chất Tropan Alkaloids ở nồng độ rất thấp và cung cấp kết quả đáng tin cậy. Quy trình phân tích LC-MS/MS bao gồm các bước xử lý mẫu, tách chiết, sắc ký và phát hiện bằng khối phổ. Kỹ thuật này được các viện kiểm nghiệm hàng đầu thế giới áp dụng để đánh giá an toàn thực phẩm, đặc biệt là cho các sản phẩm dành cho trẻ em. Độ nhạy, độ chuyên biệt và độ lặp lại của LC-MS/MS giúp cung cấp dữ liệu chất lượng cao về hàm lượng Tropan Alkaloids trong các mẫu thực tế.

3.1. Quy trình xử lý và chuẩn bị mẫu

Mẫu ngũ cốc cho trẻ em được xử lý qua các bước chiết lỏng-lỏng (LLE) để tách chiết Tropan Alkaloids. Dung môi như acetonitrile được sử dụng để đạt hiệu suất chiết cao. Các dung dịch chuẩn được chuẩn bị để hiệu chuẩn máy và kiểm tra độ chính xác của phương pháp phân tích.

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp LC-MS/MS bao gồm xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ thu hồi. Các tham số này đảm bảo rằng phương pháp đủ chính xác và đáng tin cậy để định lượng Tropan Alkaloids trong mẫu thực tế của trẻ em.

IV. Ứng dụng thực tế và kết quả phân tích mẫu ngũ cốc

Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS để phân tích các mẫu ngũ cốc thực tế cho trẻ em cung cấp dữ liệu quan trọng về mức độ phơi nhiễm Tropan Alkaloids. Các kết quả phân tích giúp xác định những sản phẩm có nồng độ vượt quá ngưỡng cho phép và cần phải cải thiện. Nghiên cứu này được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, một cơ sở hàng đầu trong lĩnh vực kiểm nghiệm thực phẩm. Kết quả cho thấy sự khác biệt đáng kể trong nồng độ Tropan Alkaloids giữa các mẫu khác nhau, từ đó giúp các nhà sản xuất và cơ quan quản lý có thông tin để đảm bảo an toàn cho trẻ em. Những phát hiện này góp phần nâng cao chất lượng và độ an toàn của các sản phẩm thực phẩm dinh dưỡng dành cho trẻ em tại Việt Nam.

4.1. Kết quả phân tích mẫu và đánh giá rủi ro

Kết quả phân tích LC-MS/MS trên các mẫu ngũ cốc thực tế cho trẻ em cho thấy mức độ phơi nhiễm Tropan Alkaloids. Những mẫu có nồng độ cao cần được báo cáo cho cơ quan quản lý và nhà sản xuất. Đánh giá rủi ro dựa trên liều tham chiếu cấp tính (ARfD) giúp xác định những sản phẩm nguy hiểm.

4.2. Khuyến cáo cho công tác quản lý chất lượng

Các nhà sản xuất thực phẩm dinh dưỡng cho trẻ em cần triển khai các biện pháp kiểm soát từ khâu nguyên liệu đến thành phẩm. Kiểm tra định kỳ bằng phương pháp LC-MS/MS là cần thiết để đảm bảo an toàn. Các quy trình nông nghiệp tốt và lựa chọn nguyên liệu chất lượng cao giúp giảm Tropan Alkaloids.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Nguy cơ phơi nhiễm 1. Sự hình thành và dạng tồn tại các Tropan Alkaloids trong thực phẩm Tropan Alkaloids chủ yếu được tìm thấy trong hai họ thực vật là Solanaceae và Erythroxylaceae, với con đường sinh tổng hợp bắt nguồn từ amino acid L-ornithin. Thông qua một chuỗi phản ứng sinh hóa, L-ornithin được chuyển hóa thành hygrin, từ đó tạo thành các hợp chất nền như α-tropin, β-tropin, ecgonin và cuscohygrin – là cơ sở cho quá trình hình thành toàn bộ các TAs đã được biết đến hiện nay [3].

Thực vật thuộc họ Solanaceae là nguồn lây nhiễm TAs vào thực phẩm phổ biến nhất với các loài Datura, Hyoscyamus và Atropa. Một số loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm TAs như:  Ngũ cốc có thể bị lẫn hạt cỏ dại như Datura stramonium trong quá trình thu hoạch.  Mật ong hoang dã, nếu ong lấy mật từ hoa của các loài thực vật chứa TAs.  Trà thảo dược, có thể chứa lá hoặc hạt của các cây họ Solanaceae.

Ngũ cốc là loại thực phẩm thường bị nhiễm TAs nhất do hạt của Datura stramonium có kích thước và hình dạng rất giống với hạt kiều mạch và các loại hạt khác như hạt lanh, đậu nành, lúa miến và kê. Quy trình làm sạch nông sản không phải lúc nào cũng loại bỏ hoàn toàn các bộ phận và hạt của cây cỏ dại. Các nông sản này sẽ được sử dụng làm nguyên liệu hoặc trực tiếp sản xuất ra các sản phẩm dinh dưỡng cho trẻ em khiến các sản phẩm bị nhiễm Tropan Alkaloids. Để có thêm dữ liệu về sự xuất hiện của TAs trong thực phẩm, Ủy ban EU đã thông qua Khuyến nghị 2015/976/EUI về việc giám sát sự hiện diện của TAs trong thực phẩm.

Tuy nhiên, việc giám sát còn hạn chế do sự thiếu hụt các phương pháp phân tích đáng tin cậy kết hợp với độ nhạy phù hợp [5]. Các quy định hiện hành về ngưỡng cho phép của Tropan Alkaloids Sự hiện diện của TAs trong thực phẩm gây nguy hiểm cho sức khỏe con người, do khả năng gây ra các tác động cấp tính trong thời gian ngắn. Do vậy, Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) đã thiết lập liều tham chiếu cấp tính (ARfD) là tổng lượng Atropin và Scopolamin ở mức 0,016 µg/kg trọng lượng cơ thể (bw) (EFSA, 2013). Theo các cuộc khảo sát chế độ ăn uống của Châu Âu được tiến hành từ năm 2009 đến năm 2019, phơi nhiễm cấp tính qua chế độ ăn uống với tổng lượng Atropin và Scopolamin khác nhau tùy theo nhóm tuổi và có xu hướng cao hơn ở nhóm dân số trẻ dưới 17 tuổi (EFSA, 2013; EFSA, 2018) [6].

Trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ là nhóm tuổi tiếp xúc nhiều nhất vì chúng tiêu thụ lượng sản phẩm từ ngũ cốc cao hơn mỗi trọng lượng cơ thể [4]. Theo quy định của Ủy ban Châu Âu (2016/239), mức tối đa được thiết lập trong thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ có chứa kê, lúa miến, kiều mạch là 1,0 µg/kg với mỗi loại Tropan Alkaloids [4], [5], [7]. Quy định EU 2021/1408 2 ngày 27 tháng 8 năm 2021 đã đưa ra quy định mức giới hạn tối đa của hai chất thuộc nhóm Tropan Alkaloids là Atropin và Scopolamin trong một số loại thực phẩm nhất định như bảng 1. Quy định mức giới hạn tối đa của Atropin và Scopolamin trong một số loại thực phẩm [7] Mức giới hạn tối đa (µg/kg) Thực phẩm Atropin Scopolamin Thực phẩm chế biến từ ngũ cốc và thức ăn cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, có chứa hạt kê, cao lương, kiều 1,0 1,0 mạch, ngô hoặc các sản phẩm có nguồn gốc từ chúng.

Tổng của Atropin và Scopolamin (µg/kg) Kê và cao lương chưa chế biến 5,0 áp dụng từ 01/09/2022 Ngô chưa chế biến ngoại trừ : + Ngô chưa chế biến dự định được chế biến bằng 15 áp dụng từ 01/09/2022 phương pháp xay xát ướt + Ngô chưa chế biến để trồng Kiều mạch chưa chế biến 10 áp dụng từ 01/09/2022 + Ngô để trồng + Kê, cao lương và ngô đưa ra thị trường cho 5,0 áp dụng từ 01/09/2022 người tiêu dùng + Các sản phẩm kê, cao lương và xay xát + Kiều mạch được đưa ra thị trường cho người tiêu dùng 10 áp dụng từ 01/09/2022 + Các sản phẩm xay xát từ kiều mạch Trà thảo mộc (sản phẩm khô) trừ trà thảo mộc (sản 25 áp dụng từ 01/09/2022 phẩm khô) của hạt hồi Trà thảo mộc (sản phẩm khô) của hạt hồi 50 áp dụng từ 01/09/2022 Trà thảo mộc (dạng lỏng) 0,20 áp dụng từ 01/09/2022 3 1. Thực trạng Trong những năm gần đây, các vụ ngộ độc Atropin và Scopolamin được phát hiện thường xuyên. Năm 2013, theo RASFF, một số người ở Phần Lan sau khi tiêu thụ hỗn hợp rau, đậu, hạt đông lạnh từ Bỉ với nguyên liệu thô từ Tây Ban Nha [8]. Năm 2019, Uganda ghi nhận đợt ngộ độc thực phẩm khiến hơn 300 người nhập viện với 5 ca tử vong do sử dụng ngũ cốc được viện trợ trong đó ngô và đậu nành nhiễm TAs của D.

Trong thực phẩm từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, Mulder et al. phát hiện mẫu chứa TAs chiếm 22% trong số 113 mẫu được phân tích (ngũ cốc ăn sáng được chế biến với sữa hoặc nước, bánh quy và bánh quy giòn) tại Hà Lan giai đoạn 2011 – 2014 [10]. Một số báo cáo về các trường hợp ngộ độc liên quan đến TAs được thể hiện ở bảng 1. Các trường hợp ngộ độc TAs.

Quốc gia, Mẫu thực phẩm Mức độ phơi nhiễm ngày ghi nhận Slovenia Atropin 26 mg/kg và Bột kiều mạch 2003 scopolamin 12 mg/kg Pháp Bánh mì, bánh crepe làm Atropin là 16,467 mg/kg và 9/2012 từ bột kiều mạch scopolamin là 7,042 mg/kg Hà Lan Trà Atropin là 1,1 mg/kg 2013 Cộng hòa Séc Ngũ cốc và các sản Atropin là 1200 – 1500 µg/kg và 26/11/2015 phẩm bánh scopolamin là 360 – 460 µg/kg Đức Ngũ cốc và các sản Atropin là 156,2 – 207,5 µg/kg và 20/02/2015 phẩm bánh scopolamin 27,2 – 31,3 µg/kg Thực phẩm bổ sung, Cộng hòa Séc thực phẩm tăng cường vi Atropin là 7,9 µg/kg 13/04/2016 chất dinh dưỡng Croatia Ca cao và các chế phẩm Atropin là 200,5 µg/kg và 29/01/2019 từ ca cao, cà phê và chè scopolamin là 488,7 µg/kg 1. Tổng quan nhóm Tropan Alkaloids 1. Độc tính của nhóm Tropan Alkaloids Các TAs là các chất ức chế hệ cholinergic có nguồn gốc tự nhiên, cơ chế là đối kháng cạnh tranh với acetylcholin và các chất kích thích hệ muscarinic khác như pilocarpin, physostigmin,… ngăn cản sự gắn acetylcholin vào receptor muscarinic ở thần kinh trung ương và ngoại vi, gây kích thích thần kinh trung ương và hủy phó giao cảm [11]. TAs tác dụng mạnh lên các cơ quan chính của bụng và ngực, đặc biệt là trên cơ trơn và tuyến ngoại tiết [2].

4 Những tác dụng không mong muốn lên thần kinh trung ương CNS được báo cáo nhiều nhất bao gồm chóng mặt, mờ mắt, giãn đồng tử, khô miệng rõ rệt, da đỏ, nôn mửa, trướng bụng, ý thức lơ mơ, co thắt cơ, nhiệt độ cơ thể thấp, ảo giác, mê sảng, nhịp tim nhanh và thẩm chí là tê liệt, hôn mê dẫn đến tử vong [8], [11], [12], [13].3 trình bày độc tính phụ thuộc vào liều của Atropin [2]. Độc tính phụ thuộc vào liều của Atropin. Liều Triệu chứng 0,5 mg Nhịp tim chậm nhẹ; khô miệng nhẹ; ức chế tiết mồ hôi Khô miệng; khát nước; nhịp tim nhanh nhẹ, đôi khi xuất 1,0 mg hiện sau giai đoạn nhịp chậm; giãn đồng tử nhẹ Nhịp tim nhanh; hồi hộp đánh trống ngực; khô miệng rõ rệt; 2,0 mg mờ thị lực gần Bồn chồn và mệt mỏi; đau đầu; tiểu khó (khó đi tiểu); táo 5,0 mg bón; khó nói và khó nuốt Các triệu chứng trên trở nên rõ rệt hơn; mạch nhanh và yếu; 10,0 mg trở lên thị lực rất mờ; mất điều hòa vận động, kích động và hưng phấn; ảo giác và mê sảng; hôn mê Tác dụng độc hại thường xảy ra trong vòng 60 phút sau khi uống hoặc ăn và các triệu chứng lâm sàng dưới mức gây tử vong có thể kéo dài đến 24 đến 48 giờ [8]. Nguồn Martindale cho biết, báo cáo liều gây tử vong là 100 mg hoặc ít hơn đối với người lớn và 10 mg đối với trẻ em, nếu không được điều trị bằng thuốc giải độc như physostigmin [8].

Physostigmin là một alkaloid pyrrolo-indol, là một loại thuốc cholinergic hoạt động bằng cách ức chế có hồi phục các enzym acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase, tăng cường truyền tín hiệu acetylcholin trong não [14]. Ngoài ra, pilocarpin và benzodiazepin cũng được sử dụng để giải độc [8], [12]. Cấu trúc của Tropan Alkaloids Tropan Alkaloids là nhóm các chất chuyển hóa thứ cấp đặc trưng bởi khung cấu trúc 8-azabicyclo[3,2,1]octan, gồm vòng piperidin và pyrrolidin có chung một nguyên tử nitơ và hai nguyên tử carbon (hình 1. Hầu hết chúng là este có nguồn gốc từ acid hữu cơ và hydroxypropan [3].

Cấu trúc hóa học nhân tropan Nghiên cứu này tập trung vào 3 TAs: Atropin, Scopolamin và Homatropin. Thông tin về định danh hóa học của 3 chất này được thể hiện trong bảng 1. Định danh hóa học của các Tropan Alkaloids Công thức Công thức Danh pháp IUPAC hóa học cấu tạo [(1R,5S)-8-methyl-8- C17H23NO3 Atropin azabicyclo[3.1]octa (hyoscyamin) n-3-yl] 3-hydroxy-2- phenylpropanoate [(1R,2R,4S,5S)-9- methyl-3-oxa-9- azatricyclo[3.02,4] Scopolamin C17H21NO4 nonan-7-yl] (2S)-3- ((-)-hyoscin) hydroxy-2- phenylpropanoate [(1S,5R)-8-methyl-8- azabicyclo[3.1] Homatropin octan-3-yl] 2- C16H21NO3 hydroxy-2- phenylacetate Các TAs phổ biến nhất có trong thực phẩm là Atropin, một hỗn hợp racemic của (±)-hyoscyamin, và (−)-Scopolamin hay còn gọi là hyoscin [15]. Atropin có xu hướng dễ bị chuyển hóa thành hỗn hợp racemic hơn so với Scopolamin.

Về mặt cấu trúc hóa học, Scopolamin khác với Atropin và Hyoscyamin bởi cầu epoxid nối giữa carbon số 6 và số 7 trong hệ vòng. Ngoài ra, các alkaloid có thể được chuyển đổi thành các muối tương ứng, giúp cải thiện đáng kể độ tan trong nước so với dạng base tự do. Một số tính chất lý hóa của 3 chất này được trình bày trong bảng 1. Tính chất lý hóa của các Tropan Alkaloids Đặc tính Atropin Scopolamin Homatropin Khối lượng 289,4 g/mol 303,35 g/mol 275,34 g/mol phân tử Trạng thái vật lý Rắn, bột màu trắng Rắn, bột màu trắng Rắn, bột màu trắng Nhiệt độ 118,5°C 59°C 191 – 212°C nóng chảy pKa 9,84 7,75 9,9 – 10,1 Tỷ trọng 1,2 g/cm3 1,3 g/cm3 1,1 g/cm3 - Tan trong H2O: - Tan trong H2O: - Tan trong MeOH, 200 mg/L (25oC), 17400 mg/L (25oC), Độ tan EtOH, acetone, MeOH, EtOH MeOH, ether, ether, benzene (96%) cloroform, aceton Hệ số logKow 1,83 0,98 1,90 (n-octanol/nước) 1.

Tình hình nghiên cứu 1.