Tài liệu: Định lượng stipuleanosid r2 trong thân rễ sâm vũ diệp panax

Nghiên cứu định lượng stipuleanosid r2 trong thân rễ sâm vũ diệp Panax bipinnatifidus Seem bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC chính xác.

• Tác giả: Dương Thị Phượng
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Tùng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Định lượng Stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Sâm Vũ Diệp và Stipuleanosid R2

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một loài thực vật quý hiếm thuộc họ Araliaceae, được sử dụng trong y học cổ truyền với nhiều công dụng chữa bệnh. Cây sâm vũ diệp chứa nhiều hợp chất hoạt tính có giá trị dược học cao. Trong đó, stipuleanosid R2 là một trong những thành phần chính có tác dụng sinh học đáng kể. Việc định lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu dược liệu là một công việc quan trọng nhằm kiểm soát chất lượng sản phẩm và đảm bảo hiệu quả điều trị. Khóa luận tốt nghiệp này tập trung vào việc phát triển và thẩm định một phương pháp phân tích hiệu quả để xác định hàm lượng này một cách chính xác.

1.1. Đặc điểm của Panax bipinnatifidus Seem.

Sâm vũ diệp là một loài thực vật đặc hữu của vùng Tây Bắc Việt Nam, đặc biệt phân bố ở các tỉnh như Lào Cai, Yên Bái. Cây có hình dáng đặc biệt với lá kép lông chim. Các bộ phận như thân, rễ đều chứa những hoạt chất có giá trị cao. Việc khai thác và chế biến sâm vũ diệp cần tuân theo quy trình khoa học để bảo vệ tài nguyên thiên nhiên.

1.2. Vai trò của Stipuleanosid R2

Stipuleanosid R2 là một hợp chất saponin có tác dụng sinh học quan trọng. Chất này được xác định có khả năng hỗ trợ chức năng miễn dịch và chống viêm. Định lượng chính xác stipuleanosid R2 giúp đánh giá chất lượng dược liệu và sản phẩm chiết xuất. Đây là cơ sở để chuẩn hóa sản phẩm và đảm bảo tính nhất quán về thành phần hoạt chất.

II. Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân tích được cộng đồng khoa học công nhân rộng rãi nhờ độ chính xác cao và tính chuyên biệt tốt. Phương pháp này tách chiết và định lượng các thành phần hóa học trong mẫu một cách hiệu quả. Nguyên tắc HPLC dựa trên sự khác biệt trong độ hấp phụ của các hợp chất lên pha tĩnh. Trong nghiên cứu này, HPLC được sử dụng để phát triển một phương pháp định lượng stipuleanosid R2 đáng tin cậy. Kỹ thuật này cho phép xác định chính xác hàm lượng chất hoạt động trong các mẫu dược liệu sâm vũ diệp.

2.1. Nguyên tắc và thông số HPLC

Nguyên tắc làm việc của HPLC dựa trên sắc ký chuyên biệt lỏng. Mẫu được bơm qua cột chứa pha tĩnh với dung dịch di động có tốc độ kiểm soát. Detector mảng điốt (DAD) được sử dụng để phát hiện và định lượng các hợp chất. Các thông số quan trọng như thời gian lưu giữ, độ phân giải và độ tinh khiết đều được giám sát chặt chẽ để đảm bảo kết quả chính xác.

2.2. Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp là bước quan trọng để đáp ứng các tiêu chuẩn phân tích. Các yêu cầu thẩm định bao gồm độ lặp lại, độ đúng, khoảng tuyến tính và giới hạn phát hiện (LOD/LOQ). Nghiên cứu kiểm tra độ lặp lại của phương pháp thông qua các lần đo lặp. Độ đúng được xác định bằng cách thêm chuẩn vào mẫu. Khoảng tuyến tính được khảo sát để đảm bảo phương pháp hoạt động trong khoảng nồng độ mong muốn.

III. Quá Trình Định Lượng Stipuleanosid R2 trong Dược Liệu

Quá trình định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp bao gồm nhiều bước chuẩn bị và phân tích. Đầu tiên, mẫu dược liệu được thu hái, làm khô và xay nhuyễn theo quy trình chuẩn hóa. Tiếp theo, chiết xuất stipuleanosid R2 từ mẫu bằng các dung môi thích hợp như methanol hoặc ethanol. Dung dịch chiết được lọc để loại bỏ các tạp chất trước khi phân tích. Cuối cùng, mẫu được bơm vào hệ thống HPLC để phát hiện và định lượng stipuleanosid R2 dựa trên diện tích peak so với chất chuẩn.

3.1. Chuẩn bị mẫu và chiết xuất

Chuẩn bị mẫu là công đoạn đầu tiên và rất quan trọng. Dược liệu sâm vũ diệp được làm khô hoàn toàn để loại bỏ độ ẩm và bảo quản tốt hơn. Sau đó mẫu được xay nhuyễn thành bột mịn. Chiết xuất stipuleanosid R2 bằng cách ngâm mẫu trong dung môi hữu cơ ở nhiệt độ phòng hoặc gia nhiệt. Quá trình lọc và làm sạch dung dịch chiết là cần thiết để loại bỏ tạp chất gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

3.2. Phương pháp HPLC áp dụng

Chương trình sắc ký được tối ưu hóa để đạt độ phân giải tốt nhất. Dung môi di động thường là hỗn hợp nước và acetonitril với tỷ lệ và gradient được điều chỉnh để tách chiết tối ưu. Cột HPLC được lựa chọn dựa trên tính chất hóa học của stipuleanosid R2. Tốc độ dòng, nhiệt độ cột và bước sóng phát hiện được cài đặt chính xác. Kết quả phân tích được ghi nhận dưới dạng sắc ký đồ hiển thị đỉnh (peak) của stipuleanosid R2.

IV. Kết Quả và Ý Nghĩa Thực Tiễn của Nghiên Cứu

Nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 đã đạt được những kết quả quan trọng trong việc xây dựng một phương pháp phân tích chính xác và có thể áp dụng rộng rãi. Phương pháp HPLC được xác thực đáp ứng các tiêu chuẩn thẩm định quốc tế. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định cho phép phát hiện các nồng độ rất nhỏ của chất này. Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu khác nhau của sâm vũ diệp đã được xác định chính xác. Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong kiểm soát chất lượng dược liệu, phát triển sản phẩm và chuẩn hóa các sản phẩm chứa sâm vũ diệp.

4.1. Kết quả định lượng và thẩm định

Phương pháp HPLC phát triển đã cho kết quả thẩm định đạt tiêu chuẩn cao. Độ lặp lại được xác định với hệ số biến thiên (RSD) thấp. Độ đúng đạt từ 95-105% khi thêm chuẩn. Khoảng tuyến tính được khảo sát trong phạm vi nồng độ rộng. Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu dược liệu được định lượng với độ chính xác cao. Kết quả cho thấy hàm lượng biến thiên tùy theo nguồn gốc mẫu và điều kiện bảo quản.

4.2. Ứng dụng thực tiễn và triển vọng

Phương pháp phân tích được xây dựng có thể áp dụng vào kiểm soát chất lượng các sản phẩm dược liệu sâm vũ diệp trong lĩnh vực sản xuất. Kết quả nghiên cứu cung cấp dữ liệu khoa học để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu này. Phương pháp này cũng có thể mở rộng để định lượng các saponin khác trong các loài thực vật tương tự. Triển vọng ứng dụng bao gồm phát triển thuốc và các bổ sung dinh dưỡng có chất lượng đảm bảo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1. Tên khoa học SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [3,21], SVD thuộc chi Sâm (Panax.

L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2]. Đặc điểm thực vật Sâm vũ diệp là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm [3,21]. Thân rễ dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại. Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dương lịch.

Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 cái mọc vòng. Lá chét 5 - 7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không đều, mép có răng cưa, có lông. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem. Đặc điểm phân bố và sinh thái Sâm vũ diệp là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước ta.

Trong tự nhiên, SVD phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc nước ta [3,21,22]. Gần đây sâm vũ diệp đã được nghiên cứu và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai. Hiện nay vùng phân bố của SVD đang bị thu hẹp dần và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Do vậy SVD là loài dược liệu quý hiếm cần được bảo tồn và gìn giữ để phát triển trong tương lai.

Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù. Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm 2 thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thể cho ra một cụm hoa.

Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kì có lượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của sâm vũ diệp. Cách xác định tuổi của cây dựa vào những vết sẹo thân được hình thành sau khi quả chín [3]. Thành phần hóa học Theo các tài liệu đã nghiên cứu cho thấy Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Panax L.

Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định được gần 300 saponin từ các loài thuộc chi này [31]. Các kết quả nghiên cứu trước đây của SVD cũng chỉ ra rằng saponin là thành phần chính của lá và rễ cây sâm vũ diệp, trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [11,23]. Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố phân lập được 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [37]. Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự vào năm 2002 cho thấy kết quả định tính sơ bộ trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin [21].

Năm 2003, đã xác định thành phần saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro. Ngoài ra còn có các saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [22]. Gần đây vào năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập và xác định được một nhóm gồm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) là thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn (Việt Nam), trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) [33]. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [33] 1.

Tác dụng dược lý Tính vị, công năng: Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [3]. Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy khi thử trên động vật thí nghiệm, SVD có độc tính cấp rất thấp, tăng cường chức năng sinh lý, ảnh hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo dai của cơ thể, tăng sức đề kháng, tác dụng tán huyết [3]. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng SVD có tác dụng chống stress [25], chống trầm cảm, có tác dụng bảo vệ gan và kích thích tăng miễn dịch [12-15]. Công dụng Sâm vũ diệp được biết đến như một vị thuốc quý có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ [25], chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, nhất là đối với phụ nữ sau khi sinh.

Sâm vũ diệp còn được dùng để cầm máu, tán ứ, tiêu sưng. Dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn, rắc chữa chảy máu và làm vết thương mau lành. Rễ cây sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt cho sức khỏe đặc biệt là chức năng sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao rồi dùng để pha với nước hoặc rượu 4 để uống cũng có tác dụng như rễ.

Ở Trung Quốc, sâm vũ diệp còn được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [7,22]. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 1. Công thức hóa học Hình 1. Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 [41] Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]- 3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- carboxylic acid [40].

Công thức phân tử: C53H84O23 [41]. Phân tử lượng: 1089. Tính chất lý hóa Chất bột màu trắng. Điểm nóng chảy 210 - 2150C [41].

Tác dụng sinh học Stipuleanosid R2 là thành phần saponin trong dược liệu, được biết đến như là thành phần có hoạt tính và quyết định các tác dụng sinh học của các loài dược liệu như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis [36], Aralia elata [34]. Trong một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc tế bào ung thư [30]; ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt là đối với dòng tế bào K562 và U937 [29]; có tác dụng chống oxy hóa [38]; hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và hạ lipid máu [37]. Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC Theo như tài liệu chúng tôi tìm hiểu được tính đến thời điểm hiên tại: Trên thế giới vẫn chưa có các nghiên cứu công bố về định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu bằng phương pháp HPLC mà chủ yếu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập chất này trong các dược liệu. Do đó việc xây dựng được phương pháp định lượng stipuleanosid R2 là rất cần thiết trong việc ứng dụng dược liệu trong thực tiễn.

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 1. Nguyên tắc của HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một một phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp phân tích; dựa trên cơ sở là sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao. Trong đó: pha động là chất lỏng; pha tĩnh là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay dựa trên phân bố theo kích cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.

Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động dẫn tới thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ khác nhau và từ đó giúp phân tách được các chất. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector. Detector sẽ giúp phát hiện và đo nồng độ các chất phân tích. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng như: detector UV-Vis, detector huỳnh quang (FLD), detector diode array (DAD), detector điện hoá,…Trong đề tài này chúng tôi sử dụng detector DAD.

6 Nếu thực hiện quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ thu được kết quả là một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc ký đồ [4,5,8,20,27,28]. Một số thông số đặc trưng [2,3,5,9,10,15] Hình 1. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng [9] a) Thời gian lưu t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký.

tR (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó. tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0. b) Hệ số dung lượng k’ Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức: t 'R t R -t 0 t R k'= = = -1 t0 t0 t0 Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm 7 mẫu do đó làm giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian lưu kéo dài.

Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. c) Hệ số bất đối AF (tailing factor) Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ: AF  W1/20 2a Trong đó: - W1/20: là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic. - a: là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Yêu cầu trong phép định lượng: 0,9 < AF < 2.

Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối. d) Hệ số chọn lọc ' t R,B-t 0 α= k B = (k’B  k’A) k 'A t R,A -t 0 Yêu cầu: α nằm trong khoảng 1,05 đến 2. α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng.